亞甲藍的一種抗急性腦缺血損傷用途
【專利摘要】本發明涉及亞甲藍(methylene?blue，MB)的一種抗急性腦缺血新用途。亞甲藍能夠明顯減小由永久性大腦中動脈閉塞(middle?cerebral?artery?occlusion，MCAO)引起的腦缺血梗死灶，緩解神經功能的損傷。本發明的 申請人:采用線栓法將大鼠大腦中動脈永久性閉塞，即刻及腦缺血后不同時間點多次腹腔注射亞甲藍后，觀察大鼠永久性腦缺血梗死的程度及行為學的改變。研究發現亞甲藍能夠明顯減小由腦缺血造成的梗死體積，提高大鼠在腦缺血后的行為能力。通過本發明的方法，在腦缺血后多次給予合適劑量的臨床用藥亞甲藍，就能夠顯著減輕大鼠永久性腦缺血后的損傷程度，改善大鼠腦缺血后的行為能力。亞甲藍的此種用途，有望為臨床提供一種腦卒中后的急救治療措施，減輕患者因為錯過黃金治療期帶來的永久性神經功能損傷。
【專利說明】亞甲藍的一種抗急性腦缺血損傷用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及亞甲藍的一種抗急性腦缺血損傷用途。大鼠經大腦中動脈閉塞缺血后，立即腹腔注射亞甲藍，并在缺血后多個時間點給藥，能夠明顯減小大鼠永久性腦缺血后梗死灶的體積，提高大鼠的行為能力。
【背景技術】
[0002]缺血性腦卒中占腦卒中病人總數的70%-80%，它是導致成人殘疾的首因。治療缺血性腦卒中的藥物多達幾十種之多，但目前的用藥多以溶栓為主，有些藥物副作用還很大，即便如此，由于時間窗的問題(得病后6小時以內，3小時以內為黃金治療期)，在我國僅有1.6%的患者能夠得到及時的溶栓治療，即使在美國也只有5%的病人能得到及時溶栓治療。因此，能緩解急性期的腦缺血損傷和減輕隨后的永久性腦梗死的救治藥物凸顯尤為重要。
[0003]亞甲藍(化學式C16H18C1N3S)又稱亞甲基藍、次甲基藍、次甲藍、美藍、品藍、甲烯藍、瑞士藍。亞甲藍屬于芳香雜環化合物，1876年由Heinrich Caro合成，自1890s起用于實驗室和臨床。亞甲藍在臨床上的應用包括以下幾個方面:1.低濃度時，亞甲藍能使高鐵血紅蛋白還原為氧合血紅蛋白，故亞甲監可治療聞鐵血紅蛋白血癥。2.聞濃度時，亞甲監能將氧合血紅蛋白的鐵氧化為三價鐵，而形成高鐵血紅蛋白，利用此作用可治療氰化物中毒。
3.亞甲藍能使膀胱結石 溶解，故可用于尿路結石，對草酸鈣結石療效較好。4.亞甲藍與神經組織有較強的親和力，可作用于神經末梢，治療神經性皮炎。5.其他治療:亞甲藍還可以治療感染性休克、閉塞性脈管炎、血管瘤等。此外，有研究報道亞甲藍在大鼠腦缺血再灌損傷中具有保護作用，提示可能用于腦缺血溶栓治療后的保護作用。但是目前能夠及時得到溶栓治療的患者只占缺血性腦卒中患者的2%左右，亞甲藍對另外98%錯過黃金治療期而帶來的永久性神經功能損傷的患者是否能起到保護作用尚未見研究報道。

【發明內容】

[0004]本發明公開了亞甲藍的一種抗急性腦缺血損傷用途。大鼠經大腦中動脈閉塞后即刻腹腔注射亞甲藍((本發明中應用的亞甲藍由Amresco公司生產，優選的用藥劑量是Img/kg, 5mg/kg, 10mg/kg,更優選的是5mg/kg),并在缺血后多個時間點繼續給藥,能夠明顯減小大鼠永久性腦缺血造成的梗死體積，改善大鼠的行為能力。通過本發明的方法，采用在適宜時間注射合適劑量的亞甲藍，就能夠提高大鼠等動物對抗急性腦缺血損傷的能力，為臨床治療缺血性腦卒中提供了有力的實驗證據。若能得以推廣到人體應用，將有較好的經濟效益和社會效益。
[0005]本發明的 申請人:采用線栓法對成年大鼠進行大腦中動脈閉塞造成局灶性腦缺血，栓塞后即刻經腹腔注射不同劑量的亞甲藍，并在缺血后多個時間點給予上述劑量的亞甲藍注射，在缺血24小時后觀察大鼠的行為能力和腦梗死程度，評價亞甲藍對急性腦缺血損傷的保護作用。【具體實施方式】
[0006]材料:
[0007]I)戊巴比妥鈉，德國進口，北京試劑公司分裝。
[0008]2)1%戊巴比妥鈉注射液:取Ig戊巴比妥鈉粉末，溶于10ml生理鹽水中，充分混勻，制成I %戊巴比妥鈉注射液100ml，用于動物麻醉，以大鼠體重為依據，按照0.5ml/100g
用量使用。
[0009]3)亞甲藍(methylene blue, MB)分子式C16H18C1N3S是雜環芳香族染料，屬于噻嗪類染料家族，無臭深藍色晶體，溶于水和氯仿，但不溶于酒精，避光保存，Amresco公司生產，效期安全。其水溶液呈藍色，現用現配。
[0010]4) 10mg/kg亞甲藍腹腔注射液:稱取90mg亞甲藍粉末，溶于30ml生理鹽水中，充分混勻，制成3mg/ml亞甲藍腹腔注射液30ml，以大鼠體重為依據，按照0.33ml/100g用量使用，即得10mg/kg的實際用量。
[0011]5) 5mg/kg亞甲藍腹腔注射液:取上述配制的10mg/kg亞甲藍腹腔注射液1ml,溶于1ml生理鹽水中，充分混勻，制成1.5mg/ml亞甲藍腹腔注射液20ml,以大鼠體重為依據，按照0.33ml/100g用量使用，即得5mg/kg的實際用量。
[0012]6) lmg/kg亞甲藍腹腔注射液:取上述配制的10mg/kg亞甲藍腹腔注射液2ml,溶于18ml生理鹽水中，充分混勻，制成0.3mg/ml亞甲藍腹腔注射液20ml，以大鼠體重為依據，按照0.33ml/100g用量使用，即得lmg/kg的實際用量。
[0013]7)氯化三苯基四氮唑(2, 3, 5-Triphenyltetrazolium chloride, TTC),分子式C19H15C1N4,白色至淺黃色結晶粉末，用作分析試劑和色譜分析試劑，sigma公司進口，避光保存。
[0014]8)1% TTC溶液:取0.1gTTC粉末，溶于1ml純水中，充分混勻，制成1% TTC溶液10ml，用于腦片的染色，用時避光，37°C。
[0015]9)成年雄性SD大鼠，體重280_320g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，飼養在室溫22-25°C，12h晝夜循環交替，自由飲食。所有動物實驗流程均符合動物實驗倫理委員會的規定。
[0016]10)大腦中動脈閉塞性缺血模型的制備:選用體重范圍在280~350g的雄性SD大鼠，于術前12h禁食，自由飲水，以I %戊巴比妥鈉(0.5ml/100g)腹腔注射實施麻醉后，將大鼠固定于操作臺上，腹面朝上，從頸部正中剪開皮膚，剝離暴露出頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)，和頸外動脈(ECA)。經ECA將線栓插入至大腦中動脈，系緊結扎線，即刻給予腹腔注射亞甲藍，消毒并縫合皮膚。
[0017]效果驗證:
[0018]應用神經功能評分和腦梗死體積測定作為亞甲藍治療效果驗證的方法，具體實施如下:
[0019]I)神經功能評分
[0020]手術后24h實施神經功能評分，采取三種評分方法:Longa評分法、爬格實驗、肢體放置測驗對大腦中動脈閉塞性缺血后的大鼠神經功能進行評價。分值越大，神經功能損傷越嚴重。采用單因素方差分析，用P值判斷統計學差異。[0021]2)腦梗死的測定
[0022]以大腦視交叉為中心，做冠狀切片6片，每片2mm，腦切片置于I % TTC溶液中避光室溫孵育20min，然后用4%多聚甲醛室溫固定2h，置換清水后，平鋪掃描儀上掃描入電腦。用image J軟件計算梗塞百分比。采用單因素方差分析，用P值判斷統計學差異。
[0023]結果發現:應用本發明公開的濃度的亞甲藍溶液在大鼠行MCAO手術后即刻、5h、1h給予腹腔注射后，能顯著降低大鼠的腦梗死體積，改善神經功能，提高大鼠的行為能力。
[0024]實施實例一:
[0025]亞甲藍(lmg/kg, 5mg/kg, 10mg/kg)腹腔注射對MCAO大鼠急性腦缺血損傷的保護作用
[0026]1、材料:
[0027]I)戍巴比妥鈉(PelltobarbitalumNatricum):德國進口，北京試劑公司分裝,批號020402，有效期2015年3月。
[0028]2)1%戊巴比妥鈉注射液制備:以德國Merck公司生產的戊巴比妥鈉為基礎，取Ig戊巴比妥鈉粉末，溶于10ml生理鹽水中，充分混勻，制成I %戊巴比妥鈉注射液100ml，用于動物麻醉，以大鼠體重為依據，按照0.5ml/100g用量使用。 [0029]3)0.9%生理鹽水:石家莊四藥有限公司生產，國藥準字H13023200，有效期至2015年I月29日。
[0030]4)亞甲藍(methylene blue, MB)分子式C16H18C1N3S是雜環芳香族染料，屬于噻嗪類染料家族，無臭深藍色晶體，溶于水和氯仿，但不溶于酒精，避光保存，Amresco公司生產，有效期至2015年I月。
[0031]5) 10mg/kg亞甲藍腹腔注射液:以Amresco公司生產的亞甲藍為基礎，稱取90mg亞甲藍粉末，溶于30ml生理鹽水中，充分混勻，制成3mg/ml亞甲藍腹腔注射液30ml，以大鼠體重為依據，按照0.33ml/100g用量使用，即得10mg/kg的實際用量。
[0032]6) 5mg/kg亞甲藍腹腔注射液:取上述配制的10mg/kg亞甲藍腹腔注射液10ml，溶于1ml生理鹽水中，充分混勻，制成1.5mg/ml亞甲藍腹腔注射液20ml，以大鼠體重為依據，按照0.33ml/100g用量使用，即得5mg/kg的實際用量。
[0033]7) lmg/kg亞甲藍腹腔注射液:取上述配制的10mg/kg亞甲藍腹腔注射液2ml,溶于18ml生理鹽水中，充分混勻，制成0.3mg/ml亞甲藍腹腔注射液20ml，以大鼠體重為依據，按照0.33ml/100g用量使用，即得lmg/kg的實際用量。
[0034]8)氯化三苯基四氮唑(2, 3, 5-Triphenyltetrazolium chloride, TTC),分子式C19H15C1N4,白色至淺黃色結晶粉末，用作分析試劑和色譜分析試劑，sigma公司生產，避光保存，有效期至2015年8月。
[0035]9)1% TTC溶液:以sigma公司生產的TTC為基礎，取0.1gTTC粉末，溶于1ml純水中，充分混勻，制成1% TTC溶液10ml，用于腦片的染色，用時避光，37°C。
[0036]10)成年雄性SD大鼠，體重280_320g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，飼養在室溫22-25°C，12h晝夜循環交替，自由飲食。所有動物實驗流程均符合動物實驗倫理委員會的規定。
[0037]11)大腦中動脈閉塞性缺血模型的制備:
[0038]A.動物選擇:選用體重范圍在280~350g的雄性SD大鼠，于術前12h禁食，自由飲水。
[0039]B.手術操作:以1%戊巴比妥鈉(0.5ml/100g)腹腔注射實施麻醉后，將大鼠固定于操作臺上，腹面朝上，從頸部正中剪開皮膚，剝離暴露出頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)，和頸外動脈(ECA)。經ECA將線栓插入至大腦中動脈，系緊結扎線消毒并縫合皮膚。
[0040]C.給藥方式與劑量:于模型制作后即刻、5h、10h三次給予腹腔注射亞甲藍溶液(lmg/kg,5mg/kg,10mg/kg)。
[0041]D.模型成功入選標準:大鼠麻醉蘇醒后按Zea Longa(0-4分)5分制評分標準進行神經功能缺失程度評分。
[0042]a) O分:無神經功能缺失癥狀，活動正常者；
[0043]b) I分:不能伸展對側前爪者；
[0044]c)2分:爬行時出現向左轉圈者；
[0045]d) 3分:行走時身體向偏癱側傾倒者；
[0046]e)4分:不能自發行走，意識喪失者。
[0047]E.模型排除標準
[0048]a)依據Zea Longa5分制評分法,神經功能缺失體征評分低于I分者； [0049]b)開顱發現并發蛛網膜下腔出血者；
[0050]c)腦組織切片HE染色無缺血病理改變者；
[0051 ] d) TTC染色未見缺血灶者；
[0052]e)缺血24h內死亡者。
[0053]2、方法:
[0054](I)大腦中動脈閉塞性缺血模型的制備:體重280~320g的雄性SD大鼠，稱重，I %戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉(0.5ml/100g)，仰臥位固定在鼠手術板上，充分暴露頸部。頸前正中切口，分離筋膜，暴露右側頸動脈，向近心端游離頸總動脈(CCA)約0.2cm，向遠心端游離頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)。在ECA上穿兩條結扎線，一根在分叉處打松結，一根盡量靠近遠心端結扎，ICA上夾動脈夾，在已分離的CCA近心段夾動脈夾。提起ECA上遠心端結扎線，電凝器熔斷ECA，于ECA靠近遠心端處(約距離動脈分叉3mm處)剪一小口，將尼龍線栓從剪好的小口置入ECA，向前推進經CCA到ICA動脈夾處扎緊ECA上原來松結的結扎線，放開ICA上的動脈夾，繼續向前推進線栓，至標記處(1.8-2.0cm)，此時大鼠呼吸可有短暫加速，提示模型成功。再次扎緊ECA上的結扎線，剪斷線栓，放開CCA上動脈夾，即刻腹腔注射給予亞甲藍(Methylene blue, MB)治療(A組:1 mg/kg, B組:5mg/kg, C組:10mg/kg)，對照組(N組)給予相同量的生理鹽水。確認大鼠無活動出血后，消毒皮膚、縫合切口。將大鼠放置于干凈通風的鼠籠內單籠飼養，維持籠內溫度25°C左右。觀察大鼠一般情況至麻醉蘇醒。期間于手術后5h、1h兩次腹腔注射追加給藥，劑量同前。
[0055](2)神經功能缺損檢測:手術后24h實施神經功能評分，采取三種評分方法:Longa評分法、爬格實驗、肢體放置測驗對大腦中動脈閉塞性缺血大鼠神經功能進行評價。
[0056]Zea Longa (0-4分)5分制評分標準進行神經功能缺失程度評分。O分:無神經功能缺失癥狀，活動正常者；1分:不能伸展對側前爪者；2分:爬行時出現向左轉圈者；3分:行走時身體向偏癱側傾倒者:4分:不能自發行走，意識喪失者。
[0057]肢體放置測驗:肢體放置于三種獨立刺激(視覺、觸覺、本體感覺)以評測運動感覺完整性。具體實驗有:前肢放置實驗，包括(I)視覺亞實驗，即前方刺激:實驗者將動物握于手中，使其前爪懸空，自桌面上方1cm處向桌面緩慢斜線靠近(此時桌子位于大鼠前方)，大鼠正常反應為前肢即刻抓向桌面，損傷大鼠則表現為肢體反應延遲。O分-動物肢體放置反應正常；1分-反應延遲但不超過2s ;2分-反應延遲且超過2s。側方刺激,此時桌子位于動物側方，其余實驗方法及評分標準同前方刺激。(2)觸覺亞實驗，將動物置于桶狀凹陷實驗器內，使其前爪懸空，此時大鼠應該既看不見，也不能用胡須觸及桌面，用其前爪背側輕觸桌面，刺激深度僅達皮膚和毛發，動物反應及評分同視覺亞實驗，觸覺刺激同樣分前方及側方刺激。(3)本體覺亞實驗，操作及評分同觸覺亞實驗，僅刺激深度不同，本體覺亞實驗給予前爪較大壓力，刺激深達肌肉及關節，該亞實驗只有前方刺激。動物前肢放置實驗總分范圍為O~10分,功能損傷越重,得分越高。
[0058]爬格實驗:主要檢測實驗動物的視覺、觸覺以及前肢對感覺及運動的整合能力。整個空格的面積為1cmX 110cm，由許多正方形小網格組成(面積9cm2)，小網格網絲的直徑為1.0mm，放置在離地面Im的高度。大鼠自由從空格的一端爬向另一端，行進中腦缺血對側前肢掉入網格一次，記為失誤一分，失誤是由腦組織缺血損傷導致的運動功能失調。
[0059](3)腦梗死體積檢測:神經功能評分結束后，大鼠行頸椎脫白處死，快速分離出腦組織，腹面向上，放入腦模，以大腦視交叉為中心，做冠狀切片6片(視交叉前面取兩片，視交叉后面四片)，每片2mm，腦切片置于1% TTC溶液中避光室溫孵育20min，然后用4%多聚甲醛室溫固定2h，置換清水后，平鋪掃描儀上掃描入電腦。用image J軟件計算梗塞百分t匕，公式如下:
[0060]矯正腦梗死體積) = [LT-(RT-RI)]/LTX 100% (LT:左側大腦半球體積，RT:右側大腦半球體積，R1:梗死部分體積)。 [0061](4)數據統計:以神經功能評分和腦梗死率的測定作為定量考察指標，分析亞甲藍組與對照組大鼠的差別。采用單因素方差分析，用P值判斷統計學差異。
[0062]3、結果:
[0063]神經功能評分
[0064]亞甲藍的三個劑量組(A，B, C)與對照組(N)相比，神經功能總評分分數均顯示下降，表明經不同劑量亞甲藍治療后，大鼠的神經功能得到不同程度的改善(如下表所示)。
[0065]表.亞甲藍對永久性腦缺血大鼠神經功能的影響
[0066]
【權利要求】
1.亞甲藍在制備增強人或動物對抗急性腦缺血損傷的藥物和保健品方面的應用。
2.亞甲藍作為添加劑或輔料在制備增強人或動物對抗急性腦缺血損傷的食品和保健品方面的應用。
3.根據權利要求1和2所述的應用，其中所說的急性腦缺血損傷為由腦動脈粥樣硬化造成的栓塞，或由纖維素、血小板、白細胞、膽固醇結晶所組成的微栓子形成的微栓塞，或由血液粘度和凝固性的血液成分改變以及由心臟病引起的血流動力學改變造成的腦供血不足，在一定時間(腦缺血3天)內得不到溶栓治療，或錯過黃金治療期對腦組織造成的損傷。該損傷既包括神經功能的改變，也包括腦組織的病變。
4.根據權利要求1和2所述的應用，其中所說對抗急性腦缺血損傷為對抗急性腦缺血后引起的永久性缺血(非缺血再灌注)損傷的能力。包括神經功能的改善，以及腦組織病變的減 緩。
【文檔編號】A61P9/10GK104027338SQ201410252319
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】吳麗穎, 范明, 朱玲玲, 邸瑤, 趙彤, 何云凌, 丁學鋒, 吳奎武, 黃欣, 趙永岐, 劉淑紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所