呼腸孤病毒dsRNA在醫(yī)用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑制備中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了呼腸孤病毒dsRNA在內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑制備中的應(yīng)用。以純化的ReovirusdsRNA為材料制備Reov-dsRNAEnII，直接用于機(jī)體，誘導(dǎo)產(chǎn)生各種內(nèi)源性干擾素，賦予人體抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)體質(zhì)的功能。主要優(yōu)點(diǎn)：A）Reovirus本身不引起人體明顯疾病、無腫瘤源性，顯著安全；B）誘導(dǎo)人體產(chǎn)生干擾素的種類齊全、體內(nèi)濃度高，人源病毒、真核分子高度符合種屬特異性，無免疫排斥和依賴，在人體內(nèi)生物活性和藥理作用極強(qiáng)，高度藥效；C）天然綠色dsRNA生物材料，生態(tài)友好；D）資源能無限再生、用之不竭；E）特殊的病毒dsRNA材料可高通量增殖和提取、現(xiàn)代化制備、造價(jià)低廉。
【專利說明】呼腸孤病毒dsRNA在醫(yī)用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑制備中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于核酸制藥【技術(shù)領(lǐng)域】。呼腸孤病毒(Reovirus)雙鏈RNA核酸(dsRNA)在醫(yī)用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(Endo-1nterferon Inducer, EnII)制備中的應(yīng)用是指利用現(xiàn)代生物技術(shù)體外增殖天然的、可無限再生的、顯著安全的Reovirus綠色資源，高純度提取其dsRNA分子,并最終制備成體內(nèi)用核酸制劑，即醫(yī)用Reovirus dsRNA內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(Reov-dsRNA EnII)。該EnII直接用于人體內(nèi)，誘導(dǎo)人體大量的各種相關(guān)細(xì)胞，如白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫淋巴細(xì)胞以及其他相關(guān)細(xì)胞，高濃度地產(chǎn)生種類齊全的、高度符合種屬特異性的、無免疫排斥和依賴的、在人體內(nèi)生物活性和藥理作用極強(qiáng)的、高度藥效的內(nèi)源性干擾素(Endo-1nterferon,ENIs),從而安全有效地賦予人體抗病毒、抗腫瘤以及廣泛的防病、治病和增強(qiáng)體質(zhì)等功能，亦能用于應(yīng)對(duì)突發(fā)性公共衛(wèi)生事件。

【背景技術(shù)】
[0002]由于具有廣泛的疾病防治功能的干擾素(Interfeixm，IFN)(董長垣主編，《現(xiàn)代分子病毒學(xué)》，武漢大學(xué)出版社，1996年10月)是人類至今所發(fā)現(xiàn)的最好的一類細(xì)胞因子；也由于內(nèi)源性干擾素(Endo-1nterferon, ENI)較外源性干擾素(Exo-1nterferon, EXI)有無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，以及人類至今尚未獲得理想的內(nèi)源件干擾素誘導(dǎo)劑(Endo-1nterferonInducer, EnII)等原因，人類一盲在追求安全的、有效的醫(yī)用EnII。
[0003]1.干擾素及其分類和特性
[0004]IFN是由干擾素誘導(dǎo)劑(Interferon Inducer)刺激誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生的一組多功能的可溶性糖蛋白。通過與細(xì)胞受體結(jié)合，IFN可活化300多種干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs),發(fā)揮多種生物學(xué)活性,包括抗病毒作用、抗腫瘤作用以及增強(qiáng)體質(zhì)的調(diào)理作用。
[0005]國際干擾素命名委員會(huì)(Internat1nal Commiss1n on InterferonNomenclature)規(guī)定，先根據(jù)IFN的動(dòng)物來源進(jìn)行初步分類；再根據(jù)IFN的抗原特性和分子結(jié)構(gòu)的差異分成不同的型。在特定的型內(nèi)，按氨基酸序列或組成差異又可分為若干亞型。于是，根據(jù)氨基酸序列和受體的不同，IFN被分為1、II和III三種類型(Richard E.Randall, Stephen G.1nterferons and viruses:an interplay betweeninduct1n, signalling, antiviral responses and virus countermeasures.Jof GeneralVirology, 2008，89:4-6)。IFN-a、IFN-β、IFN-r 和 IFN-ω 亞型歸于 I 型干擾素，其中IFN- a就有20余個(gè)亞型，IFN- β僅有一個(gè)亞型；IFN_ Y是唯一的II型干擾素，且只有I個(gè)亞型；IFN-λ l(IL-29)、IFN-λ 2 (IL-28a)和 IFN-λ (IL_28b)歸于III型干擾素;IFN_co 是IFN-α家族成員，但是其結(jié)構(gòu)和大小與其它IFN-α略有差異，而其抗原性卻有較大差異。以上分類僅適用于人和小鼠干擾素，其他動(dòng)物干擾素科學(xué)積累尚少。
[0006]根據(jù)產(chǎn)生途徑，干擾素又分為天然IFN和非天然IFN。前者是細(xì)胞接受干擾素誘導(dǎo)劑刺激而直接產(chǎn)生的干擾素；后者是指借助生物工程技術(shù)生產(chǎn)的干擾素。
[0007]天然干擾素種類繁多，各自的分子量不同，抗原性也不同。至今，對(duì)人原細(xì)胞產(chǎn)生的不同干擾素已獲得三種不同的抗原成分，包括白細(xì)胞干擾素抗原(Le)，人成纖維細(xì)胞干擾素抗原(F)和T淋巴細(xì)胞干擾素抗原(T)。簡(jiǎn)言之,Le抗原干擾素即IFN-a ,F抗原干擾素即IFN — β，T-干擾素即IFN- Y。
[0008]根據(jù)來源，IFNs可分為內(nèi)源性干擾素(ENI)和外源性干擾素(EXI)。EXI就是在體外應(yīng)用外源性干擾素誘導(dǎo)劑(Exo-1nterferon Inducer, ExII)刺激離體培養(yǎng)細(xì)胞所生產(chǎn)的或生物工程技術(shù)合成的，而后用于機(jī)體的IFNs ；ΕΝΙ則是用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(Endo-1nterferon Inducer, EnII)于機(jī)體內(nèi)，直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的IFNs。
[0009]2.干擾素功能
[0010]I型干擾素主要參與抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲等作用。
[0011]II型干擾素抗病毒作用比I型IFN弱，除具有抗病毒、抗增殖活性外，其主要生物學(xué)活性為免疫調(diào)節(jié)作用，主要參與誘導(dǎo)MHC類抗原的表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。
[0012]III型干擾素具有抗病毒、抗增殖及體外抗腫瘤等方面作用。
[0013]可見，IFN-Q、IFN-β、IFN-Y均有抗病毒作用，且其抗病毒作用具有廣譜性。其對(duì)細(xì)胞的抗病毒作用是間接的，廣譜的(即非特異性的)(Richard E.Randall, Stephen
G.1nterferons and viruses:an interplay between induct1n, signalling, antiviralresponses and virus countermeasures.J of General Virology，2008，89:4-6)。
[0014]近年來，有關(guān)誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生機(jī)理的研究，IFN抗病毒、抗腫瘤和調(diào)理機(jī)體功能的藥理和生理作用的研究取得了令人滿意的結(jié)果，顯示了其符合機(jī)體自然防御功能的特性。IFN不僅具有抗病毒和抗腫瘤作用，而且具有增強(qiáng)體質(zhì)的調(diào)理作用；既能治療疾病，又能預(yù)防疾?。患饶芸挂阎《?也能抗未知病毒(包括烈性病毒,如SARS-CoV、禽流感病毒)。
[0015]3.干擾素的產(chǎn)生與干擾素誘導(dǎo)劑
[0016]細(xì)胞基因組密碼著各種IFN基因。由于IFN基因抑制物(IFN suppressor)與IFN基因結(jié)合，所以，在一般情況下，IFN基因處于抑制狀態(tài)。能誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生的物質(zhì)統(tǒng)稱為干擾素誘導(dǎo)劑(Interferon inducer)。當(dāng)干擾素誘導(dǎo)劑作用于細(xì)胞膜,便會(huì)解脫IFN基因抑制物與IFN基因的結(jié)合，IFN操縱子開始轉(zhuǎn)錄，合成mRNA，mRNA迅速轉(zhuǎn)移至胞漿，在核糖體上轉(zhuǎn)譯出IFN前體，切除信號(hào)肽后，成熟的IFN分泌到細(xì)胞外。
[0017]研究表明，病毒感染細(xì)胞后，經(jīng)相同機(jī)制可同時(shí)誘生III型和I型干擾素，但兩者表達(dá)量不同(Osterlund P, Veckman V, Siren J, et al.Gene express1n and antiviralactivity of alpha /bela intederons and interleukin-29 in virus-1nfectedhuman myeloid dendritic cells.J Virol, 2005, 79[15]:9608-9617 ；ContoliM, Message SD, Laza-Stanca V, et al.Role of deficient type III interferon-lambdaproduct1n in asthma exacerbat1ns.Nat Med, 2006，12[9]:1023-1026 ;Khaitov MR,Laza-Stanca V, Edwards MR, et al.Respiratory virus induct1n of alpha-, beta—andlambda-1nterferons in bronchial epithelial cells and peripheral bloodmononuclear cells.Allergy, 2009,64 [3]:375-386),表達(dá)的組織也不同,例如,IFN- λ 應(yīng)答主要產(chǎn)生于上皮細(xì)胞，尤其是在肺、皮膚和腸道，而幾乎所有類型的細(xì)胞均能產(chǎn)生I型干擾素(Sommereyns C，Paul S，Staeheli P, et al.1FN-1ambda(IFN-1ambda) is expressedin a tissue-dependent fash1n and primarily acts on epithelial cells in viv0.PLoS Pathog, 2008,4[3]:el000017)o在某些條件下，IFN-入和I型干擾素并不同時(shí)表達(dá)(Doyle SE，Schreckhise H,Khuu-Duong K，et al.1nterleukin-29uses a type Iinterferon-like program to promote antiviral responses in human hepatocytes.Hepatology，2006，44[4]:896-906)。幾乎所有的脊椎動(dòng)物(包括人)細(xì)胞都可產(chǎn)生IFNjS無論在體內(nèi)還是體外，必須由IFN誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)產(chǎn)生。
[0018]按照干擾素誘導(dǎo)劑的本質(zhì)，可將其分為:病毒IFN誘導(dǎo)劑、雙鏈RNA IFN誘導(dǎo)劑、代謝物IFN誘導(dǎo)劑和一些病原菌IFN誘導(dǎo)劑等。衣原體、立克次體、細(xì)胞內(nèi)毒素、真菌提取物等也能誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生。目前主要是滅活的新城疫病毒(NDV)用作外源性干擾素誘導(dǎo)劑(ExII)。但是，活的病原體是不能用作干擾素誘導(dǎo)劑的，特別不能作為內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(Endo-1nterferon Inducer, EnII),更談不上用于人體。
[0019]4.內(nèi)源性干擾素的優(yōu)點(diǎn)和內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑
[0020]目前所用的外源性干擾素(EXI)在臨床使用時(shí)會(huì)產(chǎn)生系列的毒副作用，如造成白細(xì)胞減少、頭痛、發(fā)熱、肝功能異常、感冒樣綜合征、骨髓抑制、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(如失眠、焦慮、抑郁、興奮、易怒、精神病)等。此外，還有少見的副反應(yīng)，如癲癇、腎病綜合征、間質(zhì)性肺炎和心律失常等；還可能誘發(fā)自身免疫性疾病，如甲狀腺炎、血小板減少性紫癜、溶血性貧血、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡樣綜合征、血管炎綜合征和I型糖尿病等。也由于干擾素的本質(zhì)是一類蛋白多肽，所以EXI應(yīng)用于人體必然會(huì)引起機(jī)體異源反應(yīng)和依賴性。此外，由于EXI應(yīng)用于人體時(shí)種類單一，藥物和生理功能差；而且其制備復(fù)雜、價(jià)格昂貴，保存和運(yùn)輸麻煩，所以，限制了 EXI的大量生產(chǎn)和普及應(yīng)用。
[0021]內(nèi)源性干擾素(ENI)是應(yīng)用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(EnII)于人體內(nèi)，直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的IFNs。在這種情況下，機(jī)體變成了生產(chǎn)干擾素的復(fù)合工廠，以生產(chǎn)各型干擾素，發(fā)揮抗腫瘤、抗感染和調(diào)理作用。ENI是由機(jī)體自身產(chǎn)生的天然的復(fù)合型干擾素，即白細(xì)胞干擾素、纖維母細(xì)胞型干擾素和免疫型干擾素等，由多種不同類型的細(xì)胞誘導(dǎo)生成(Sang-Myeong L, Susan KS, Steven B.Kleiboeker Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus field isolates differ in in vitro interferonphenotypes Veterinary Veterinary.1mmunology and Immunopathology, 2004,102:217-231)。所以，用EnII在人體內(nèi)直接誘導(dǎo)產(chǎn)生的ENI能克服EXI的諸多不足，如:誘生的IFN種類齊全、體內(nèi)濃度高、沒有異源蛋白質(zhì)的免疫原性(即過敏反應(yīng)和排斥反應(yīng))、沒有依賴性、無需提純、造價(jià)低廉、……等。也由于IFNs具有相對(duì)種屬特異性，所以，內(nèi)源性干擾素的抗病毒、抗腫瘤以及調(diào)理功能活性最強(qiáng)。
[0022]可見，具有廣泛的疾病防治功能的IFNs是人類至今所發(fā)現(xiàn)的最好的一類細(xì)胞因子；內(nèi)源性干擾素(ENI)較外源性干擾素(EXI)有無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。然而，欲想得到ENIs，關(guān)鍵是要獲得能安全應(yīng)用于人體的、能有效誘導(dǎo)人體產(chǎn)生ENIs的、造價(jià)低廉的、便于工業(yè)化生產(chǎn)的、不污染環(huán)境的、資源豐富的內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(EnII)。
[0023]一旦獲得了理想的EnII便會(huì)極大地造福人類，直接用于人體，誘導(dǎo)人體大量的各種類型的相關(guān)細(xì)胞高濃度地產(chǎn)生種類齊全的、高度符合種屬特異性的、無免疫排斥和依賴的、在人體內(nèi)生物活性和藥理作用最強(qiáng)的、高度藥效的內(nèi)源性干擾素(ENIs)，從而安全有效地賦予人體廣泛抗病毒、抗腫瘤以及防病、治病和增強(qiáng)體質(zhì)等功能，亦能用于應(yīng)對(duì)突發(fā)性公共衛(wèi)生事件。
[0024]目前用于人體的商業(yè)化EnII主要是多聚肌苷酸(Polyinosinic PolycytidylicAcid, Poly Π:Cl, PIC),為人工合成的小分子雙鏈 RNA(Chadha KC, Dembinski WE, DunnCB, et al.Effect of increasing th1lat1n of the polycytidylic acid strand ofpoly I:poly C on the alpha, beta and gamma interferon-1nducing properties,antiviral and antipmliferative activities.Antiviral Res, 2004，64 [3]: 171-7),國內(nèi)于1983年已用于臨床，作為廣譜抗病毒藥物使用。
[0025]然而，近年發(fā)現(xiàn):P0ly「1:Cl具有很多問題，以致在臨床應(yīng)用上受到極大限制，無法推廣應(yīng)用。Poly「1:Cl在人體和其他靈長類體內(nèi)易被血清核酸酶破壞、誘生IFN產(chǎn)生的效能低(Taniguchi, T, Takaoka, A, A weak signal for strong responses:1nterferon-alpha/beta revisited.Nat.Rev.Mol.Cell.B1l, 2001.2:378 - 386.)。更有文獻(xiàn)報(bào)道:Poly[1:C]會(huì)引起自身免疫性疾病，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱、造血機(jī)能下降、促紅細(xì)胞生成素減少、白細(xì)胞減少、肝脾細(xì)胞破壞、血壓及凝血功能失常、轉(zhuǎn)氨酶升高、腎功能損傷等一系列毒副作用，從而大大限制了 Poly[1:C]的市場(chǎng)和臨床應(yīng)用(聶實(shí)踐、胡冬琴，錯(cuò)位雙鏈核糖核酸的熱原反應(yīng)，中國牛物工稈，2003,23「2l:97-98)。尋找和開發(fā)新的第二代醫(yī)用EnII是全世界牛物醫(yī)學(xué)家們角逐的領(lǐng)域，人類一肓在追求安全而有效的醫(yī)用ΕηΙΙ。
[0026]5.Reovirus dsRNA具備發(fā)展成理想的醫(yī)用EnII的潛能
[0027]人類已認(rèn)識(shí)到:病毒具有誘導(dǎo)IFN的作用、人工合成的dsRNA具有誘導(dǎo)IFN的作用；那么，在理論上講，來自病毒基因組的dsRNA分子應(yīng)該具有發(fā)展成EnII的潛能。同理，來自人Reovirus的dsRNA分子更應(yīng)該具有發(fā)展成EnII的潛能。
[0028]Reovirus基因組由10分子dsRNAs所組成，其分子量為0.5X106-2.7X 16,總分子量14X 106-15X 16,占病毒重量的15%—20%。聚丙烯凝膠電泳(PAGE)技術(shù)可將10分子dsRNAs分析成清晰的電泳圖譜,該圖譜將Reovirus dsRNAs分成大(L)、中(M)、小(S)三個(gè)片段組。(董長垣主編，《現(xiàn)代分子病毒學(xué)》，武漢大學(xué)出版社，1996年10月)。
[0029]Reovirus含10分子分段dsRNA,帶依賴RNA的RNA聚合酶,故提取和純化的dsRNAs沒有感染性；其基因組為雙鏈RNA分子，耐RNA酶(RNAase);該病毒不引起人類重大疾病，為dsRNA病毒，沒有腫瘤源性；系天然病毒，其核酸是天然核酸，毫無影響生態(tài)平衡的后顧之憂(董長垣主編，《現(xiàn)代分子病毒學(xué)》，武漢大學(xué)出版社，1996年10月)。reovirus因其特殊的分子結(jié)構(gòu)，便于離體增殖和純化制備，有利于產(chǎn)業(yè)化。這些特點(diǎn)賦予了 Reovirus極其顯著的醫(yī)用和生物工程價(jià)值。
[0030]國際上,近年已有力地證明了 “dsRNA分子的安全性”。我們已證實(shí)了 Reovirus對(duì)人正常細(xì)胞如人胚肺細(xì)胞、人氣管平滑肌細(xì)胞等無感染性；用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠(非敏感動(dòng)物)作半數(shù)致死量測(cè)定尚未尋找到LD5tl，顯示了該病毒對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的安全性。近十年， 申請(qǐng)人:和國際同行又反復(fù)證明了:人呼腸孤病毒(Reovirus, RV)及其同科成員BTV對(duì)人體十分安全；具有靶向抗人癌作用；該科病毒已被用于發(fā)展靶向溶癌病毒(Oncolytic Virus) (Hu J, Dong CY,Li JK-K, Chen DE and Liang K.Selectivein vitro degradat1n of human cancer cells by Bluetongue virus.ActaOncologica, 2008, 47:124-134 ；Strong JE,Coffey MC, Tang D,Sabinin P,Lee PffK.Themolecular basis of viral oncolysis:usurpat1n of the Ras signaling pathwayby reovirus.ΕΜΒ0.J, 1998, 17 (12):3351-3362 ；J.K.-K.Li, Oncolytic Bluetongueviruses: Promise,progress and perspectives, Frontiers in Microb1l.，2011,2:1-13.)。
[0031]近年， 申請(qǐng)人:又在離體培養(yǎng)的人源細(xì)胞(正常/腫瘤細(xì)胞)上，以目前最好的商業(yè)化的能用于人體的干擾素誘導(dǎo)劑Poly「1:C]為對(duì)照，比較研究了 Reovirus-3和Reovirus裸露dsRNA (Reovirus NdsRNA)的安全性和作為外源性干擾素(Exo-1nterferon, EXI)的潛力，結(jié)果表明:①Reovirus-3對(duì)人源正常細(xì)胞安全Reovirus dsRNA對(duì)離體培養(yǎng)的人正常細(xì)胞安全Reovirus dsRNA能有效地誘導(dǎo)離體培養(yǎng)的人源細(xì)胞(包括正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)產(chǎn)生IFN-β Reovirus dsRNA體外誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)量顯著高于Poly [1: C](Ρ<0.01) Reovirus dsRNA能通過誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN而殺死離體培養(yǎng)的人癌細(xì)胞。
[0032]進(jìn)而，我們成功地建立起了單純皰疫病毒I型(herpes simplex virus tipel,HSV-1)感染昆明鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型;借助該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，以目前最好的商業(yè)化干擾素誘導(dǎo)劑Poly「1: Cl為陽件藥物對(duì)照，系統(tǒng)地開展了 Reovirus dsRNA (Reov-dsRNA)體內(nèi)安全性研究、誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生IFN的有效性及其體內(nèi)誘導(dǎo)內(nèi)源性IFNs的種類研究、Reov-dsRNA體內(nèi)預(yù)防HSV-1感染效果的研究、體內(nèi)抗HSV-1感染治療效果的研究，獲得了一系列極其有價(jià)值的研究結(jié)果。
[0033](I)HE染色病理切片顯示，與既未接種HSV-1也未應(yīng)用Reov-dsRNA的空白對(duì)照組相比，HSV-1感染模型組的腦組織病變明顯，驗(yàn)明了 HSV-1感染模型建立成功。
[0034](2) Reov-dsRNA處理的小鼠，無明顯不良反應(yīng)，提示該病毒dsRNA在機(jī)體內(nèi)是安全的。
[0035](3)借助雙位點(diǎn)夾心酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中干擾素水平結(jié)果顯示:
[0036](A)單純應(yīng)用Reov-dsRNA能有效地高水平誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生各種干擾素，其中，IFN-a (234.45±4.328pg/ml)、IFN-β (13.684±0.533ng/ml)、IFN-y (236.846±11.003pg/ml)；
[0037](B)以空白動(dòng)物為對(duì)照，Reov-dsRNA和poly [1:C]都能有效地誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生內(nèi)源性干擾素，如 IFN- a、IFN- β、IFN- y (P〈0.05)；
[0038](C) Reov-dsRNA 體內(nèi)誘導(dǎo) IFN- a、IFN- β、IFN- y 水平顯著地高于 poly [1: C](Ρ〈0.05)；
[0039](D)與未用Reov-dsRNA的病毒模型組比較，預(yù)防組動(dòng)物產(chǎn)生IFN- a、IFN- β、IFN-y的水平顯著地高于病毒模型組，差異有顯著性(Pl〈0.05)。
[0040](E)與未用Reov-dsRNA的病毒模型組比較，治療組動(dòng)物產(chǎn)生IFN- a、IFN- β、IFN-y的水平顯著地高于病毒模型組，差異有顯著性(P2〈0.05)。
[0041](4)統(tǒng)計(jì)分析Reov-dsRNA預(yù)防HSV-1感染組與poly[1:C]預(yù)防HSV-1感染組小鼠死亡率，結(jié)果顯示:Reov-dsRNA預(yù)防HSV-1感染組死亡率顯著低于poly [1: C]預(yù)防HSV-1感染組(P〈0.05)，提示Reov-dsRNA具有良好的預(yù)防HSV-1感染的效果。
[0042](5)統(tǒng)計(jì)分析Reov-dsRNA治療HSV-1感染組與poly [1: C]治療HSV-1感染組小鼠死亡率，結(jié)果顯示:Reov-dsRNA治療HSV-1感染組死亡率顯著低于poly[1:C]治療HSV-1感染組(P〈0.05)，提示Reov-dsRNA具有良好的治療HSV-1感染的效果。
[0043](6)統(tǒng)計(jì)分析Reov-dsRNA預(yù)防HSV-1感染組與Reov-dsRNA治療HSV-1感染組小鼠死亡率，結(jié)果顯示:Reov-dsRNA治療HSV-1感染組死亡率高于Reov-dsRNA預(yù)防HSV-1感染組(Ρ〈0.05)，提示Reov-dsRNA預(yù)防HSV-1感染的效果優(yōu)于Reov-dsRNA治療HSV-1感染的效果。
[0044]由上，可以得出以下結(jié)論:
[0045](I) Reov-dsRNA在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)是安全的；
[0046](2) Reov-dsRNA能夠在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)高效誘生IFN- a、IFN- β、IFN- Y，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，發(fā)揮良好的預(yù)防單純皰疹病毒感染的作用；
[0047](3) Reov-dsRNA能夠在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)高效誘生IFN- a、IFN- β、IFN- Y，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，發(fā)揮良好的治療單純皰疹病毒感染的作用；
[0048](4) Reov-dsRNA 對(duì) HSV-1 感染的預(yù)防效果優(yōu)于 poly [1:C]；
[0049](5) Reov-dsRNA 對(duì) HSV-1 感染的治療效果優(yōu)于 poly [1: C]；
[0050](6)似乎是，Reov-dsRNA預(yù)防HSV-1感染的效果優(yōu)于Reov-dsRNA治療HSV-1感染的效果。
[0051]以上研究結(jié)果清楚地提示 申請(qǐng)人::Re0V-dSRNA具備發(fā)展成理想的醫(yī)用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(EnII)的潛能，即具有顯著的發(fā)展成新型抗病毒藥物的潛能。
[0052] 申請(qǐng)人:研究Reov-dsRNA作為EnII,無論體內(nèi)還是體外，詢以Polv「1:Cl為對(duì)照:無論在理論上,還是.在體內(nèi)、體夕卜研究結(jié)果上，Reov-dsRNA EnII均4尤于Poly「1: Cl。 申請(qǐng)人:考慮，其原因可能是(A)Poly [1:C]為人工合成的dsRNA,而Reovirus dsRNA則是天然的 dsRNA ； (B) Poly [1:C]為較小分子 dsRNA，而 Reovirus dsRNA 則是大分子 dsRNA ； (C)Reov-dsRNA EnII來自Reovirus,如前所述,其分子大小和結(jié)構(gòu)特征(10分子dsRNAs, L、M和S三個(gè)片段組，G+C含量)等特殊條件密切相關(guān)。
[0053]6.dsRNA分子誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IFNs的細(xì)胞分子機(jī)理已很成熟
[0054]前面，我們已就干擾素、干擾素誘導(dǎo)劑、IFNs的產(chǎn)生、以及IFNs的各種重要生理功能、……等作了介紹。有關(guān)其細(xì)胞分子機(jī)理也研究得很清楚:首先是，干擾素誘導(dǎo)劑作為配體，作用于特定的細(xì)胞受體，通過細(xì)胞信號(hào)通路將信息傳遞到細(xì)胞核，以激活人類基因組編碼的各種IFN基因，表達(dá)各種不同的干擾素，并釋放到細(xì)胞外。其次是，釋放到細(xì)胞外的干擾素作為配體，與靶細(xì)胞特異性受體結(jié)合，通過信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒等生物功能作用。
[0055]Reov-dsRNA和Poly [1: C]的本質(zhì)都是dsRNA分子，均能誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生。近年已證實(shí)，TLR3 (Toll like receptor3)和RIG-1/MDA5細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是識(shí)別dsRNA、誘導(dǎo)I型IFN表達(dá)的重要分子。TLR3主要表達(dá)于免疫細(xì)胞，定位于細(xì)胞內(nèi)涵體(endosome)膜上的模式識(shí)別受體(pattern recognit1n receptor, PRR),識(shí)別經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞囊泡的dsRNA分子，誘導(dǎo)I型IFN表達(dá)。RIG-1 /MDA5定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的PRR，識(shí)別胞質(zhì)內(nèi)dsRNA，通過不依賴 TLR3 的方式誘導(dǎo) IFN 合成。(Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov R, et al.，Recognit1n of double-stranded RNA and activat1n of NF—kappa B by toll-likereceptor3.Nature, 2001, 413
[6857]: 732-738)。目前已發(fā)現(xiàn)有二條途徑介導(dǎo) TLRs (Tolllike receptors)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，一為髓樣分化因子 88 (myeloid differentiat1n factor88MyD88)依賴性途徑(Akashi S，Shimazu R, Ogata H, et al., Cutting edge:cell surfaceexpress1n and lipopolysaccharide signaling via the toll-like receptor 4—MD—2complex on mouse peritoneal macrophages.J.Tmmunol.2000, 164[7]:3471-3475)；另一條為 MyD88 非依賴性途徑(Kawai T, Adachi O, Ogawa Τ, et al., Unresponsiveness ofMyD88-deficient mice to endotoxin.1mmunity, 1999，11 [I]: 115-122) oMyDSS 分子是大多數(shù)TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的接頭分子，但是，MyD88功能缺失并不能完全終止所有的TLRs信號(hào)。所以，TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)必然還存在MyD88非依賴信號(hào)途徑。TLRs是單次跨膜受體，胞外區(qū)有LRRs (leucine-rich repeats)結(jié)構(gòu)域,識(shí)別特定的病原相關(guān)分子模式(PAMP)配體,如病原體組份、病原體產(chǎn)物、dsRNA等；胞內(nèi)區(qū)是TLR向下游傳遞信號(hào)的核心元件。TLRs家族成員的胞外區(qū)結(jié)構(gòu)的差異性較大，是結(jié)合不同配體的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。在已知的11個(gè)TLRs中，只有TLR3 識(shí)別外源 dsRNA、誘導(dǎo) I 型 IFN 合成(Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov R, et al.，Recognit1n of double-stranded RNA and activat1n of NF—kappa B by toll-likereceptor3.Nature, 2001, 413
[6857]:732-738)。
[0056]視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I(RIG-1)也是細(xì)胞內(nèi)識(shí)別病毒dsRNA的一種受體，屬含DexD/H box的dsRNA解旋酶家族成員。RIG-1的C端是解旋域,可以借助解旋酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合人工合成的或病毒的dsRNA，并以ATP酶依賴的方式解開dsRNA。N端是2個(gè)串聯(lián)的半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域(CARD)，誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)需要RIG-1。但是，RIG-1并不參與IFN-β下游的信號(hào)通路(Kato H, Sato S，Yoneyama M, et al., Cell type-specific involvementof RIG-1 in antiviral response.1mmunity, 2005，23 [I]: 19 ?28)。MDA5 又是.一個(gè)能結(jié)合dsRNA、激活I(lǐng)RF_3(IFN regulatory factor3)、誘導(dǎo)IFN表達(dá)的信號(hào)分子(Kata
H,Takeuchi O, Sato S，et al.,Differential roles of MDA5and RIG-1 helicases in therecognit1n of RNA viruses.Nature, 2006, 441
[7089]:101 ?105)。
[0057]I型干擾素是連接天然免疫和獲得性免疫的關(guān)鍵樞紐分子。不同的TLRs誘導(dǎo)產(chǎn)生I型干擾素能力并不相同，不同的DC細(xì)胞亞群產(chǎn)生I型干擾素的能力也不一樣。
[0058]7.干擾素受體及其信號(hào)通道
[0059]產(chǎn)物IFN釋出胞外，作為配體，與靶細(xì)胞特異性受體結(jié)合，激活與受體胞漿端相連的“兩面神”激酶(Janus kinases, JAKs)，JAKs再磷酸化激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激動(dòng)子(signal transducers and activators of transcript1n, STATs)中的酪氨酸殘基，使信號(hào)放大。磷酸化激活的STATs酪氨酸殘基與磷酸化酪氨酸的Src同源區(qū)2(SH2)形成同二聚體和異二聚體。異二聚體和同二聚體都可與IRF結(jié)合，組成不同的三聚體。不同的三聚體與IFN激活的調(diào)節(jié)序列(IFN stimulated regulatory elements, ISREs)結(jié)合以分別驅(qū)動(dòng)IFN-α/β調(diào)控的基因表達(dá)或IFN-γ調(diào)控的基因表達(dá)。近年的研究工作已經(jīng)搞清，是 dsRNA 依賴蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent Protein Kinase, PKR)和2' -5'寡聚腺苷酸合成酶(OAS)參與IFN介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)(Smith E J, Marie
I,Prakash A, et al.1RF3and IRF7phosphorylat1n in virus-1nfected cells does notrequire double-stranded RNA-dependent protein kinase R or Ikappa B kinase butis blocked by Vaccinia virus E3L protein.J B1l Chem, 2001，276[12]:8951?8957)。
[0060]dsRNA分子及其誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究成績也為安全而有效地應(yīng)用Reov-dsRNA EnII誘導(dǎo)人體內(nèi)源性IFNs，賦予人體自身安全有效地抗病毒、抗腫瘤，廣泛地防病、治病，增強(qiáng)體質(zhì)等功能以及用于應(yīng)對(duì)突發(fā)性公共衛(wèi)生事件提供了可靠的理論依據(jù)。
[0061]8.小結(jié)
[0062] 申請(qǐng)人:的前期應(yīng)用基礎(chǔ)理論研究成績結(jié)合上述系列的基礎(chǔ)理論研究成績?yōu)? 申請(qǐng)人:提出的本發(fā)明專利申請(qǐng)奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)條件。本發(fā)明提供的正是這樣一種全新的優(yōu)于 Poly [1:C]的 Reov-dsRNA EnI10


【發(fā)明內(nèi)容】

[0063]本發(fā)明正是基于:IFNs是人類至今所發(fā)現(xiàn)的最好的一類細(xì)胞因子，具有廣泛的疾病防治功能；內(nèi)源性干擾素(ENI)較外源性干擾素(EXI)有無可比擬的優(yōu)點(diǎn)；欲想得到ENI，關(guān)鍵是要獲得能安全應(yīng)用于人體的、能有效誘導(dǎo)人體產(chǎn)生ENIs的、造價(jià)低廉的、便于工業(yè)化生產(chǎn)的、不污染環(huán)境的、資源豐富的EnII ;目前用于人體的商業(yè)化EnII，Poly [1: C]，有很多問題，以致在臨床應(yīng)用上受到極大限制；尋找和開發(fā)新的第二代醫(yī)用EnII是全世界生物醫(yī)學(xué)家們角逐的領(lǐng)域，人類一直在追求安全而有效的新的醫(yī)用ΕηΙΙ。
[0064]本發(fā)明將呼腸孤病毒雙鏈RNA(Reovirus dsRNA)應(yīng)用于制備內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(Endo-1nterferon Inducer, ΕηΙΙ),即形成 Reov-dsRNA ΕηΙΙ。本 Reov-dsRNA EnII 極具臨床應(yīng)用前景，直接注射人體，在人體內(nèi)遵循自身防御反應(yīng)方式的條件下，誘導(dǎo)人體產(chǎn)生各種內(nèi)源性干擾素(Endo-1nterferon，ENIs)，賦予人體抗病毒病治療、抗病毒病預(yù)防、抗腫瘤的治療和聯(lián)合治療、以及廣泛的防病、治病和增強(qiáng)體質(zhì)的功能，以及用于應(yīng)對(duì)突發(fā)性公共衛(wèi)生事件等重要作用。本專利提供的這種全新的優(yōu)于Poly [1:C]的Reov-dsRNA EnII不僅具有高度的安全性和高效性、適合人類之急需，而且造價(jià)低廉、便于工業(yè)化生產(chǎn)、不污染環(huán)境、資源豐富。
[0065]該EnII具有如此重要醫(yī)用功能，主要在于它的天然分子結(jié)構(gòu)。只要我們能有效地高效地增殖Reovirus、高效高純度地提取其dsRNA核酸、并最終制備成體內(nèi)用核酸制劑等，即可成為全新的、更安全的、更有效的、天然的、可無限產(chǎn)業(yè)化的、人類急需的ΕηΙΙ，造福人類。
[0066]本發(fā)明的技術(shù)要點(diǎn):
[0067](I)借助體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)增殖Reovirus ；
[0068](2)提取高純度的Reovirus dsRNA分子；
[0069](3)制備成能直接用于人體的Reov-dsRNA ΕηΙΙ。
[0070]凡能滿足獲得高純度Reovirus dsRNA并制備成Reov-dsRNA EnII的技術(shù)方法均能達(dá)此目的。例如，本專利 申請(qǐng)人:前期采取了如下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目標(biāo)，其基本步驟是:
[0071]1.所用細(xì)胞及其培養(yǎng):以世界衛(wèi)生組織推薦為生產(chǎn)人用疫苗的理想細(xì)胞，非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary, CH0)、幼倉鼠腎傳代細(xì)胞(BHK-21)為病毒擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞在37°C、5% CO2UO%小牛血清、DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。
[0072]2.Reovirus培養(yǎng)增殖:待細(xì)胞長至80% -90 %匯合時(shí)，棄培養(yǎng)液，用ρΗ7.4的I XPBS洗滌貼壁細(xì)胞1-2次，接種Reovirus懸液1.0ml于培養(yǎng)瓶，37°C吸附1-2小時(shí)后，棄病毒液，以含2%小牛血清的添加DMEM培養(yǎng)基在37°C，5% CO2條件下維持培養(yǎng)。隨后每12小時(shí)光鏡下觀察一次，至細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，即當(dāng)CPE達(dá)90%時(shí)收獲增殖的Reovirus的培養(yǎng)細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液。
[0073]3.Reovirus的初提取和Reovirus dsRNA的純化制備:
[0074]橡皮墊帚刮下已棄去培養(yǎng)液的帶毒細(xì)胞，收集在無菌試管中；加入10倍體積DEPC水，充分溶解帶毒細(xì)胞；_20°C反復(fù)凍融3次，12000-15000rpm,離心10_15min，收集上清；飽和硫酸銨沉淀上清后4000rpm離心30min，含病毒沉淀備作dsRNA純化用。
[0075]采用TRIzoI法提取制備Reovirus dsRNA。等體積PBS(pH7.4)溶解含病毒沉淀，裝透析袋；DEPC水透析，徹底除去硫酸氨后轉(zhuǎn)入EP管；加9.5倍體積Trizol，裂解病毒；力口
0.2倍體積氯仿到裂解病毒液；12000g,離心12-15min,取上層水相收集Reovirus RNA ;等體積異丙醇沉淀Reovirus RNA ;棄上清,75%乙醇洗漆沉淀,風(fēng)干；DEPC水溶解ReovirusRNA, _20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0076]4.提取Reovirus基因組dsRNA的鑒定:
[0077](I)采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，分析電泳圖譜鑒定Reovirus 基因組 dsRNA。
[0078](2)提取Reovirus dsRNA純度鑒定:結(jié)合(A)采用紫外分光光度法(根據(jù)0D260/0D280比值)和(B)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)結(jié)合電泳凝膠背景蛋白染色技術(shù)判斷所提取Reovirus dsRNA 的純度。
[0079](3)采用紫外分光光度法測(cè)定dsRNA含量，根據(jù)dsRNA濃度=OD260 X稀釋倍 X 50 ( μ g/ml)公式計(jì)算 Reovirus dsRNA 濃度。
[0080]5.生理鹽水制備成Reov-dsRNA EnII注射劑型，經(jīng)肌內(nèi)注射使用。
[0081]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0082](I) Reov-dsRNA EnII顯著地優(yōu)于目前所用的最好的商業(yè)化的Poly [1: C],能非常安全地運(yùn)用于人體。Reovirus為dsRNA病毒，對(duì)人類安全，不引起人類任何重大疾?。辉摬《竞侄蝑sRNA，帶依賴RNA的RNA聚合酶，故提取和純化的Reovirus dsRNAs沒有感染性；Reovirus為dsRNA病毒,沒有腫瘤源性；近年人類研究的偉大成果更是結(jié)論，dsRNA分子對(duì)人類安全，大分子dsRNA可誘導(dǎo)干擾素，小分子dsRNA誘導(dǎo)RNA干涉(RNAi)。所以，本發(fā)明的全新的Reov-dsRNA EnII能非常安全地應(yīng)用于人體。
[0083](2)本發(fā)明Reov-dsRNA EnII的臨床效果顯著地優(yōu)于目前所用的最好的商業(yè)化的Poly[1:C]。Poly[1:C]為人工合成的小片段dsRNA分子，誘生IFN的能力低，伴有許多副作用，且價(jià)格昂貴，市場(chǎng)受到極大的限制。本發(fā)明在研究Reov-dsRNA EnII過程中，無論體內(nèi)還是.體夕卜，均以Poly「1:Cl為對(duì)照:無論在理論上,還是.在體內(nèi)、夕卜實(shí)驗(yàn)結(jié)果上，Reov-dsRNAEnII 均優(yōu)于 Poly「1: Cl。
[0084](3)Reov-dsRNA EnII為新的理想的天然核酸藥物，具有廣泛的治療藥物作用和生理調(diào)節(jié)功能。IFNs是人類至今所發(fā)現(xiàn)的最好的一類細(xì)胞因子，不僅具有抗病毒和抗腫瘤作用，而且具有增強(qiáng)體質(zhì)的調(diào)理作用。本發(fā)明制備的Reov-dsRNA EnII是醫(yī)用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑，直接應(yīng)用于人體，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生種類齊全的內(nèi)源性干擾素(ENIs)。在這種情況下，機(jī)體變成了生產(chǎn)干擾素的復(fù)合工廠，以生產(chǎn)復(fù)合型干擾素，發(fā)揮抗腫瘤、抗感染和調(diào)理作用。這種ENIs是天然干擾素，所以，用EnII在人體內(nèi)直接誘導(dǎo)產(chǎn)生的ENIs能克服外源性干擾素的諸多不足。Reov-dsRNA EnII在人體內(nèi)誘生的IFN種類齊全、體內(nèi)濃度高、沒有異源蛋白質(zhì)的免疫原性(即過敏反應(yīng)和排斥反應(yīng))、沒有依賴性；可用作治療用藥，也可以作為預(yù)防用藥；既可用于抗病毒病治療，也可用于抗病毒病預(yù)防；既能抗已知病毒，也能抗未知病毒(包括烈性病毒，如SARS-CoV、禽流感病毒)；既能抗病毒治療，也能抗腫瘤治療(包括聯(lián)合抗腫瘤治療)，具有廣泛的防病、治病和增強(qiáng)體質(zhì)的功能，以及用于應(yīng)對(duì)突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的重要作用。也由于IFNs具有相對(duì)種屬特異性，所以，由Reov-dsRNA EnII在體內(nèi)誘導(dǎo)的ENIs抗病毒、抗腫瘤以及調(diào)理功能活性最強(qiáng)。本發(fā)明制備的EnII用于人體完全遵循機(jī)體產(chǎn)生干擾素的防御反應(yīng)法則，能更有效誘導(dǎo)ENIs的產(chǎn)生。
[0085](4)Reov-dsRNA EnII理所當(dāng)然地也能用作Reov-dsRNA外源性干擾素誘導(dǎo)劑(ExII)。
[0086](5)全新的理論基礎(chǔ)。由于近年關(guān)于dsRNA分子作為配體與靶細(xì)胞特異性受體，如TLR3，相互作用及其細(xì)胞信號(hào)通路研究的成績積累，使dsRNA與靶細(xì)胞相互作用的后果及其細(xì)胞分子機(jī)理的成熟，為直接應(yīng)用Reov-dsRNA EnII于人體，誘導(dǎo)各種在體細(xì)胞產(chǎn)生IFNs (即ENIs)奠定了理論基礎(chǔ)。Reov-dsRNA EnII體內(nèi)誘導(dǎo)ENIs的作用機(jī)理是應(yīng)用Reov-dsRNA分子通過上述機(jī)理直接調(diào)控人源細(xì)胞干擾素基因的表達(dá)。這是一個(gè)全新的理論體系，揭示了裸露的病毒基因組dsRNA無須用轉(zhuǎn)基因技術(shù)而直接通過注射的方式應(yīng)用于人體，并安全而有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生各種ENIs，發(fā)揮其藥理和生理作用。
[0087](6)具有顯著的資源優(yōu)勢(shì)。Reovirus dsRNA是一種全新的對(duì)人安全的天然的可無限再生的綠色生物材料，取之不盡，用之不竭。Reov-dsRNA EnII正是以之為資源而提取制備的天然內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑。
[0088](7)以Reovirus資源制備天然dsRNA EnII,便于離體增殖和純化制備,無需提純、造價(jià)低廉，有利于產(chǎn)業(yè)化，生產(chǎn)成本低，有利于市場(chǎng)供給。
[0089](8)由于Reov-dsRNA EnII體內(nèi)誘導(dǎo)ENIs產(chǎn)生的速度快、安全、高效、造價(jià)低廉，所以，既能用于臨床疾病的常規(guī)預(yù)防和治療，也可用于應(yīng)對(duì)突發(fā)性公共衛(wèi)生事件。
[0090](9)本發(fā)明制備的EnII市場(chǎng)很大。 申請(qǐng)人:的前期工作已經(jīng)展示了理想的EnII的醫(yī)學(xué)價(jià)值和市場(chǎng)前景。Reov-dsRNA EnII具有誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生的生理功能，具有廣泛抗病毒和抗癌的作用，而病毒性疾病和腫瘤性疾病這兩類疾病都是目前對(duì)人類健康和生命威脅最大的疾病。從近年新的病毒病等(如:AIDS、SARS、禽流感、結(jié)核等)的出現(xiàn)和流行來看，新的傳染病的預(yù)防顯得特別重要，由此可見Reov-dsRNA EnII的用武之地。所以,Reov-dsRNAEnII既在新、老傳染病預(yù)防和治療上有廣闊的市場(chǎng)，又具有應(yīng)對(duì)突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的重大價(jià)值，比如說，它是抗乙型肝炎的首先藥物，可見一斑。由于ENI較EXI有無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，所以，理想的Reov-dsRNA EnII將會(huì)占據(jù)IFN生產(chǎn)相關(guān)的極大市場(chǎng),并會(huì)極大地?cái)U(kuò)大現(xiàn)有IFN市場(chǎng)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0091]圖1.呼腸孤病毒(Reovirus)結(jié)構(gòu)示意圖。病毒呈球形，雙層衣殼，基因組分段排列在單層內(nèi)衣殼內(nèi)。
[0092]圖2.增殖感染vero細(xì)胞的呼腸孤病毒3型(Reovirus-3)超微切片電鏡圖。
[0093]圖3.體外培養(yǎng)Reovirus dsRNA基因組10% PAGE圖譜。A為未感染病毒的vero細(xì)胞提取物；B&C均為感染Reovirus的vero細(xì)胞提取物，顯示10分子dsRNA條帶；D為
1.0kb DNA marker (購自加拿大 Fermentas 公司)。
[0094]圖4.未感染HSV-1的Vero細(xì)胞。在熒光顯微鏡下，未感染HSV-1的Vero細(xì)胞未見綠色熒光，在紫外光下可見細(xì)胞呈梭形，排列規(guī)則，生長茂盛，未見細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。
[0095]圖5.綠色熒光蛋白標(biāo)記的單純皰疹病毒I型(HSV-1)感染vero細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)用綠色熒光蛋白標(biāo)記的HSV-1增殖感染培養(yǎng)的Vero細(xì)胞，發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光。此圖像也明顯呈現(xiàn):感染HSV-1的veix)細(xì)胞收縮、變圓、脫落等細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。
[0096]圖6.HSV-1感染小鼠模型腦組織勻漿接種Vero細(xì)胞的病毒增殖圖像。取HSV-1感染小鼠模型腦組織勻漿接種Vero細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞發(fā)出清晰的綠色熒光，說明=HSV-1感染小鼠模型建立成功，并從模型動(dòng)物大腦組織成功分離到HSV-1。此圖像也明顯呈現(xiàn):感染HSV-1的veix)細(xì)胞收縮、變圓、脫落等細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。
[0097]圖7.HSV-1增殖感染vero細(xì)胞顯微觀察結(jié)果。被感染的vero細(xì)胞發(fā)出綠色熒光；綠色熒光的密度和強(qiáng)度直接反應(yīng)了 HSV-1復(fù)制增殖的量。本圖7的右下角紫色圖為未接種HSV-1的體外培養(yǎng)vero細(xì)胞(見圖4);上面3張圖為感染了 HSV-1的體外培養(yǎng)vero細(xì)胞；下面左下角和中間2張圖為小鼠模型腦組織勻漿接種于Ve1細(xì)胞，綠色熒光表明大量HSV-1在Vero細(xì)胞增殖。
[0098]圖8.正常腦組織石蠟切片，HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察圖像。從圖8中可見正常的腦組織，結(jié)構(gòu)層次清晰，無充血或者炎性細(xì)胞浸潤。(放大倍數(shù)見圖中標(biāo)尺)
[0099]圖9.HSV-1接種小鼠腦病變組織病理學(xué)光學(xué)顯微鏡照片I，顯示HSV-1感染小鼠模型建立成功。圖9中可見:大量的核被深染的單核炎性細(xì)胞聚集并粘附在血管壁上，且呈現(xiàn)向周圍組織擴(kuò)散的傾向。(放大倍數(shù)見圖中標(biāo)尺)
[0100]圖10.HSV-1接種小鼠腦病變組織病理學(xué)光學(xué)顯微鏡照片2，表明HSV-1感染小鼠模型建立成功。圖10中可見:大量的核深染的單核炎性細(xì)胞聚集在腦組織，形成灶狀。(放大倍數(shù)見圖中標(biāo)尺)
[0101]圖11.HSV-1接種小鼠腦病變組織病理學(xué)光學(xué)顯微鏡照片3，表明HSV-1感染小鼠模型建立成功。圖11中可見:大片腦組織壞死，腦細(xì)胞裂解；細(xì)漿釋出，細(xì)胞邊界不清，染成紅色，模糊一片；胞核深染、濃縮、碎片散在紅色細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。(放大倍數(shù)見圖中標(biāo)尺)
[0102]圖12.Reov-dsRNA EnII 誘導(dǎo) 3 種干擾素(IFN-α ,IFN-β ,IFN-y)效果研究結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析圖。圖12中:I為生理鹽水(NS)組;2為Reov-dsRNA EnII組；3為Poly[1:C]組。從圖12可見:以空白對(duì)照(NS)組的干擾素為本底，與NS對(duì)比，Reov-dsRNA EnII和Poly [1: C]均能有效誘導(dǎo)3種IFNs，使各種IFNs水平顯著上調(diào)；與Poly [1:C]對(duì)比，Reov-dsRNA EnII誘導(dǎo)各種IFNs效果顯著高于Poly [1: C]，提示了 Reov-dsRNA EnII極大的應(yīng)用潛能。
[0103]圖13.Reov-dsRNA EnII 預(yù)防 HSV-1 感染實(shí)驗(yàn)研究中 Reov-dsRNA EnII 誘導(dǎo) 3 種干擾素(IFN-α、IFN-β、IFN- y)效果的統(tǒng)計(jì)分析圖。圖13中:1為生理鹽水(NS)組；2為Reov-dsRNA+HSV-Ι組；3為Poly [1: C]+HSV-1組。從圖13可見:以空白對(duì)照(NS)組的干擾素為本底，Reov-dsRNA+HSV-Ι組和Poly [1: C]+HSV-1組表達(dá)3種IFNs的產(chǎn)生量顯著地高于NS組。這就表明，Reov-dsRNA和Poly [1: C]都能有效地誘導(dǎo)各種干擾素的表達(dá)，使各種IFNs水平顯著上調(diào)；并且，與Poly[1:C]對(duì)比，Reov-dsRNA誘導(dǎo)各種IFNs的效果顯著高于Poly[1:C]。這就為在病毒入侵前用Reov-dsRNA EnII建立起抗病毒感染的免疫機(jī)制，抵抗病毒入侵致病提供了實(shí)驗(yàn)室理論依據(jù)；亦為使用Reov-dsRNA EnII應(yīng)對(duì)突發(fā)性公共衛(wèi)生事件提供了實(shí)驗(yàn)室理論依據(jù)。
[0104]圖14.Reov-dsRNA EnII 治療 HSV-1 感染實(shí)驗(yàn)研究中 Reov-dsRNA EnII 誘導(dǎo) 3 種干擾素(IFN-α、IFN-β、IFN- y )效果的統(tǒng)計(jì)分析圖。圖14中:1為僅用HSV-1感染組；2為HSV-1+Reov-dsRNA組；3為HSV-1+Poly [1: C]組。從圖14可見:與僅用HSV-1感染的組I比較，先用HSV-1造成感染后再用Reov-dsRNA治療的組2 (HSV-1+ReovdsRNA組)和先用HSV-1造成感染后再用Poly [1:C]治療的組3 (HSV-1+Poly [1: C]組)表達(dá)3種IFNs的產(chǎn)量極為顯著地增高。這就表明，Reov-dsRNA和Poly[1:C]都能有效地在HSV-1感染后誘導(dǎo)各種干擾素的表達(dá)，使各種IFNs水平顯著上調(diào)；并且，與Poly [1: C]對(duì)比，Reov-dsRNA誘導(dǎo)各種IFNs的效果顯著高于Poly [1: C]。這就為在病毒入侵感染后應(yīng)用Reov-dsRNA EnII進(jìn)行治療，實(shí)現(xiàn)抗病毒病提供了實(shí)驗(yàn)室理論依據(jù)；亦為使用Reov-dsRNA EnII治療未知病毒感染提供了實(shí)驗(yàn)室理論依據(jù)。
[0105]圖15.分別應(yīng)用Reov-dsRNA ΕηΙΙ、Poly[1:C]、HSV-1后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中3種干擾素(IFN-α ,IFN-β、IFN-Y)產(chǎn)量的比較研究統(tǒng)計(jì)分析圖。圖15中:1為HSV-1應(yīng)用組、2為Poly[1:C]應(yīng)用組、3為Reov-dsRNA EnII應(yīng)用組。從圖15可見:HSV-1誘導(dǎo)3種干擾素(IFN-a、IFN-β、IFN- Y )的作用最低；Poly[1:C]誘導(dǎo) 3 種干擾素(IFN-a、IFN-β、IFN- y)的作用顯著比 HSV-1 強(qiáng)；Reov_dsRNA EnII 誘導(dǎo) 3 種干擾素(IFN- a、IFN- β、IFN- y )的作用最強(qiáng)，顯著超過了 Poly[1:C]。這就顯著提示了:Re0V-dsRNA EnII的創(chuàng)新性、科學(xué)價(jià)值、以及顯著的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0106]圖16.以HSV-1為本底作空白對(duì)照，Poly[1:C]作陽性藥物對(duì)照，研究Reov-dsRNAEnII預(yù)防HSV-1感染時(shí)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生IFN-α、IFN-β、IFN-y效果的統(tǒng)計(jì)分析圖。圖16中:1為僅用HSV-1處理組；2為Poly [1:C]+HSV-1處理組，即先用Poly [1:C]處理，后用HSV-1攻毒；3為Reov-dsRNA+HSV-Ι處理組，即先用Reov-dsRNA EnII處理，后用HSV-1攻毒。該研究旨在探討Reov-dsRNA EnII預(yù)防HSV-1感染作用的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究Reov-dsRNA EnII誘導(dǎo)3種干擾素(IFN-a ,IFN-β ,IFN-y)產(chǎn)生與其預(yù)防HSV-1感染的關(guān)系。從圖16可見:HSV-1有一定的體內(nèi)誘導(dǎo)3種干擾素(IFN-a ,IFN-β、IFN-Y)的效果；以HSV-1為本底作空白對(duì)照，進(jìn)一步獲得Poly [1:C]體內(nèi)誘導(dǎo)3種干擾素的作用比HSV-1顯著強(qiáng)；Poly[1:C]+HSV-l為陽性藥物對(duì)照，再進(jìn)一步獲得Reov-dsRNA EnII體內(nèi)誘導(dǎo)3種干擾素的作用顯著超過了 Poly[1:C]，在三者中體內(nèi)誘導(dǎo)3種干擾素的作用最強(qiáng)。這就更進(jìn)一步提示了:Reov-dsRNA EnII的創(chuàng)新性、科學(xué)價(jià)值、以及顯著的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0107]圖17.以HSV-1為本底作空白對(duì)照，Poly[1:C]作陽性藥物對(duì)照，研究Reov-dsRNAEnII治療HSV-1感染時(shí)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生IFN-a、IFN-β、IFN-y效果的統(tǒng)計(jì)分析圖。圖17中:1為僅用HSV-1處理組；2為HSV-l+Poly[1:C]處理組，即先用HSV-1感染動(dòng)物，后用Poly [1:C]治療；3為HSV-1+Reov-dsRNA EnII處理組，即先用HSV-1感染動(dòng)物，后用Reov-dsRNA EnII治療。該研究旨在探討Reov-dsRNA EnII治療HSV-1感染作用的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究Reov-dsRNA EnII誘導(dǎo)3種干擾素(IFN-a ,IFN-β、IFN-Y )產(chǎn)生與其治療HSV-1感染作用的關(guān)系。從圖17可見:HSV-1有一定的體內(nèi)誘導(dǎo)3種干擾素(IFN-a、IFN-β、IFN- y )的效果；以HSV-1為本底作空白對(duì)照，進(jìn)一步獲得Poly [1:C]體內(nèi)誘導(dǎo)3種干擾素的作用比HSV-1顯著強(qiáng)；HSV-l+Poly[1:C]為陽性藥物對(duì)照，再進(jìn)一步獲得Reov-dsRNAEnII體內(nèi)誘導(dǎo)3種干擾素的作用顯著超過了 Poly[1:C]，在三者中體內(nèi)誘導(dǎo)3種干擾素的作用最強(qiáng)。同樣地，該研究更進(jìn)一步提示了:Re0V-dSRNA EnII的創(chuàng)新性、科學(xué)價(jià)值、以及臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0108]圖18.不同研究組3種干擾素(IFN- α、IFN- β、IFN- Y )表達(dá)水平比較研究柱狀圖。圖18中:*表示各研究組與空白對(duì)照組比較，P < 0.05廣表示各研究組與HSV-1感染模型組比較，P < 0.05 ;Δ表示 Reov-dsRNA+HSV-Ι 組與 Poly [1: C]+HSV-1 組比較，P < 0.05 ；ΛΛ表示 HSV-1+Reov-dsRNA 組與 HSV-l+Poly[1:C]組比較，P <0.05。

【具體實(shí)施方式】
[0109]基于本發(fā)明專利要求是“呼腸孤病毒dsRNA (Reovirus dsRNA)在醫(yī)用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑(EnII)制備中的應(yīng)用”，這種Reov-dsRNA EnII將通過注射直接應(yīng)用于人體，誘導(dǎo)人體產(chǎn)生各種內(nèi)源性干擾素(Endo-1nterferons,ENIs),從而賦予人體抗病毒、抗腫瘤以及廣泛的防病、治病和增強(qiáng)體質(zhì)的功能，亦能用于應(yīng)對(duì)突發(fā)性公共衛(wèi)生事件。所以，本節(jié)將以具體的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。在此，我們強(qiáng)調(diào)如下實(shí)施例僅用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
[0110]實(shí)施例1.呼腸孤病毒(Reovirus)擴(kuò)增用vero細(xì)胞和其他敏感細(xì)胞的培養(yǎng)傳代細(xì)胞系的復(fù)蘇及培養(yǎng)傳代(以veix)細(xì)胞為例)
[0111]1.1Vero細(xì)胞培養(yǎng)與增殖
[0112]采用DMEM培養(yǎng)基，加10%小牛血清，調(diào)pH至7.0-7.4，置37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，增殖Vero細(xì)胞，步驟如下。
[0113]1.1.1從液氮罐中取出非洲綠猴腎細(xì)胞(Veix)細(xì)胞)凍存管，迅速置于預(yù)先調(diào)好溫度的37°C水中水浴，輕輕晃動(dòng)凍存管，使凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液Imin內(nèi)迅速完全融化。
[0114]1.1.2融化后將凍存管進(jìn)行離心，將凍存管放入離心機(jī)，800-1000rpm，10_20min，使細(xì)胞完全沉淀；吸棄上清液，加入1.5mL DMEM培養(yǎng)液，吹打使沉淀重新懸浮。
[0115]1.1.3再次將凍存管離心，800-1000rpm，10-20min，使細(xì)胞完全沉淀；吸棄上清，加入含10 % (v/v)小牛血清的DEME培養(yǎng)液，吹打沉淀分散細(xì)胞；用同樣的培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液，使終濃度為(0.8-1.2) X 103_4細(xì)胞/mL。
[0116]1.1.4按每8_121^細(xì)胞懸液接種一培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)液，371:，5 % CO2 (v/v)條件下靜置培養(yǎng)；24小時(shí)后換DMEM培養(yǎng)液，以除去未貼壁的細(xì)胞和細(xì)胞碎片。
[0117]1.1.5每天裸眼觀察培養(yǎng)液的變化，鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長狀態(tài)，每I?2天換上述DMEM培養(yǎng)液一次。
[0118]1.1.6待細(xì)胞生長鋪滿瓶底80%以上即可進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，棄去培養(yǎng)液，用無鈣鎂磷酸鹽平衡緩沖液(1XPBS，pH7.4)洗細(xì)胞2-3次；加入
0.25% (w/v)胰蛋白酶溶液6-10滴；轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶溶液能浸潤整個(gè)細(xì)胞面；置于37°C培養(yǎng)箱溫育數(shù)分鐘，光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞收縮變圓后，小心棄去胰蛋白酶溶液。
[0119]1.1.7加入含10% (v/v)小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打附著在瓶壁上的細(xì)胞，使之全部脫落到培養(yǎng)液中，形成細(xì)胞懸液。
[0120]1.1.8向細(xì)胞懸液中補(bǔ)加含10% (v/v)小牛血清的DMEM培養(yǎng)基至終體積15-25mL，平均分裝細(xì)胞懸液到2_3個(gè)新培養(yǎng)瓶中。
[0121]1.2細(xì)胞經(jīng)傳代后的培養(yǎng)
[0122]采用含10% (v/v)小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37°C，5% (v/v) CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，即為傳代。
[0123]實(shí)施例2.Reovirus (見圖1、圖2)增殖
[0124]2.1選取狀態(tài)良好的vero細(xì)胞，待細(xì)胞匯生達(dá)80% -90 %匯合時(shí)，吸棄培養(yǎng)液；用 ρΗ7.4 的 I X PBS (NaCl:8g、KCl:0.2g、Na2HPO4:1.44g、KH2PO4:0.24g、H20:800ml ;鹽酸調(diào)pH7.4，補(bǔ)H2O到1000ml)洗滌貼壁細(xì)胞2-3次。
[0125]2.2 按 2-4M0I (multiplicity of infect1n)接種呼腸孤病毒(Reovirus)于培養(yǎng)細(xì)胞；37°C吸附病毒I?2小時(shí)后，棄病毒液，加含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37°C，5%CO2 (v/v)條件下維持培養(yǎng)。
[0126]2.3隨后每12小時(shí)光鏡下觀察一次，至細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變效應(yīng)，即CPE達(dá)90%時(shí)收獲病毒感染的貼壁細(xì)胞瓶，置-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0127]實(shí)施例3.Reovirus毒力測(cè)定
[0128]3.1取出_20°C保存?zhèn)溆肦eovirus感染細(xì)胞，反復(fù)凍融病毒3次，釋放病毒成Reovirus 懸液。
[0129]3.2用lXPBS(pH7.4)對(duì)Reovirus懸液作10 X梯度稀釋，即梯度從10°_1(Γ8，稀釋時(shí)注意，每個(gè)梯度稀釋完成后更換槍頭。
[0130]3.3胰蛋白酶消化Reovirus后，加入15ml細(xì)胞培養(yǎng)液以分散細(xì)胞。
[0131]3.4血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)(Iml細(xì)胞數(shù)=每格平均細(xì)胞數(shù)X4X106X稀釋倍數(shù))得細(xì)胞量為3.86 X 108/ml，每孔加入100 μ I細(xì)胞懸液。
[0132]3.5 96孔板置于37°C，5% CO2(v/v)條件下孵化12小時(shí)后，吸去培養(yǎng)液，加入梯度稀釋的病毒液，每個(gè)梯度6孔，每孔100 μ 1，注意每個(gè)梯度加液時(shí)需更換槍頭。
[0133]3.5用封口膜將96孔板結(jié)合處封閉，置于37°C，5% CO2 (v/v)條件下孵化，每12小時(shí)觀察一次，記錄細(xì)胞病變孔數(shù)，使用Reed-Muench方法計(jì)算TCID5tl (TCID5tl的對(duì)數(shù)=大于50%的陽性百分比的最高稀釋對(duì)數(shù)+距離比例X稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)的差)為4.86X 106/mL.
[0134]實(shí)施例4.Reovirus初提取
[0135]4.1棄去Reovirus致細(xì)胞病變的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，橡皮墊帚刮下帶毒細(xì)胞，集中收集在無圃試管中；
[0136]4.2加入10倍體積焦碳酸二乙酯(DEPC)水，使帶毒細(xì)胞充分溶解；
[0137]4.3-20°C反復(fù)凍融 3 次，12000-15000rpm，4°C離心 10_15min，棄沉淀，收集上清；
[0138]4.4上清液加飽和硫酸銨，使硫酸銨終濃度為70% (按I份病毒上清加3份飽和硫酸銨)，于25°C (或室溫)沉淀2個(gè)小時(shí)，然后4000rpm離心30min，取含病毒沉淀，備作病毒dsRNA純化用。
[0139]實(shí)施例5.TRIzol 法提取制備 Reovirus RNA
[0140]5.1等體積I XPBS (pH7.4)溶解上述含病毒沉淀，裝透析袋；
[0141]5.2用DEPC水于4°C透析24-48小時(shí)，期間每隔3-6小時(shí)換DEPC水一次，以徹底除去硫酸氨后轉(zhuǎn)入EP管；
[0142]5.3加9.5倍體積Trizol Reagent漩渦震蕩30秒，裂解病毒，待溶液清亮后，冰浴8-12分鐘；
[0143]5.4加0.2倍體積氯仿到裂解病毒液，攪拌溶液，冰育10_15min ；
[0144]5.5 用 12000g，4°C，離心 12-15min，取上層水相收集 Reovirus RNA 于 EP 管中；
[0145]5.6加入等體積異丙醇于EP管，充分混勻，冰孵育lOmin，10000-12000g, 4°C，離心8_12min,管底可見無色透明Reovirus RNA沉淀
[0146]5.7棄上清，加入0.8-1.2ml75%乙醇，顛倒數(shù)次洗滌沉淀；
[0147]5.8 12000g, 4°C,離心 4_6min,棄上清，留沉淀 Reovirus RNA,風(fēng)干；
[0148]5.9 加適量 DEPC 水溶解 Reovirus RNA，_20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0149]實(shí)施例6.制備Reovirus dsRNA的鑒定評(píng)價(jià)
[0150]6.1采用常規(guī)10-12%聚丙烯凝膠電泳技術(shù)(PAGE)解析Reovirus基因組圖譜，以鑒定 Reovirus dsRNAs。用 TBE 緩沖液(1 Ommol/T, Tris~Cl, pH7.4, lmmol/L EDTA)配制10-12%聚丙烯凝膠,膠厚1.5mm ;用電泳緩沖液(89mmol/L Tris-硼酸,2mmol/L EDTA,pH8.0)作電極緩沖液；Reovirus dsRNA待測(cè)樣品加1/6體積的6X負(fù)載緩沖液(Loadingbuffer:0.25%溴酚藍(lán)，(λ 25%二甲苯腈藍(lán)，40w/v%蔗糖)，混勻后按每孔3μ g dsRNA上樣。以7V/cm電壓進(jìn)膠，4V/cm電壓分離。電泳4?5小時(shí)，0.5 μ g/ml溴化乙靛(EB)染色30?60min,去離子水漂洗后,紫外燈下分析結(jié)果。
[0151]6.2紫外分光光度法評(píng)價(jià)制備Reovirus dsRNA的純度。由于本專利所測(cè)對(duì)象Reovirus dsRNA是天然的大分子dsRNA,非人工合成的寡核苷酸或引物,其CG含量比較均勻，所以，UV分光光度法可以理想地用于純度測(cè)定。
[0152]6.2.1取2μ I制備的_20°C儲(chǔ)存的Reovirus dsRNA，經(jīng)空白液稀釋至50 μ 1，作為待測(cè)樣品，借助UV分光光度計(jì)分別測(cè)定0D23(1、OD260, OD280, OD320等四個(gè)點(diǎn)的值，用以聯(lián)合分析待測(cè)樣品純度。
[0153]6.2.2計(jì)算出0D26(i/0D28(i比值，以評(píng)估提取Reovirus dsRNA的純度，比值大于或等于2.0者為合格。純凈的RNA樣品，比值大于2.0。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。如果0D26(i/0D28(i比值在1.8-2.0之間，說明樣品純度達(dá)標(biāo)，OD260的數(shù)值有效；否則，OD26tl的值判為無效。自-20°C儲(chǔ)存的Reovirus dsRNA取出2μ 1，再用DEPC水作25倍稀釋后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD26tl和OD28tl值，分別為:0D26(I = 0.428 ；OD280=0.207。所提取的 Reovirus dsRNA 純度為 A26(l/A28。值=2.0676,說明提取的 ReovirusdsRNA純度較高。
[0154]6.2.30D23(!表不樣品中存在多肽、苯酹、碳水化合物等的污染。純凈的樣品,OD32tl —般是O。我們制備品Reovirus dsRNA要求OD320為O。
[0155]6.3制備Reovirus dsRNA的進(jìn)一步純度評(píng)價(jià)。
[0156]6.3.1結(jié)合前述提取的Reovirus dsRNA的PAGE圖譜背景分析所提取的ReovirusdsRNA純度，評(píng)估其他核酸的存在。
[0157]6.3.2借助前述PAGE，采用蛋白多肽染色，以顯示PAGE圖譜背景有無蛋白多肽污染或污染程度。
[0158]實(shí)施例7.制備Reovirus dsRNA濃度的測(cè)定及其含量計(jì)算
[0159]對(duì)Reovirus dsRNA純品用UV分光光度計(jì)測(cè)定其OD26tl值，以計(jì)算出純化樣品的濃度，并計(jì)算出所制備Reovirus dsRNA的含量。
[0160]自-20°C儲(chǔ)存的Reovirus dsRNA取出2 μ 1，再用DEPC水作25倍稀釋后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD26tl = 0.428，那么，低溫儲(chǔ)存的Reovirus dsRNA溶液濃度=OD260 X稀釋倍數(shù) X 50 = 0.428X25X50 = 535.0 μ g/mL = 0.535mg/mL ;_20°C儲(chǔ)存的 8.65L(8650.48mL)溶液中 Reovirus dsRNA 含量=0.535mg/mLX8650.48mL = 4627mg = 4.628g。
[0161]實(shí)施例8.單純皰疹病毒I型(HSV-1)增殖
[0162]能敏感增殖單純皰疹病毒I型(HSV-1)的任何細(xì)胞都可以作為其增殖細(xì)胞。此實(shí)施例7以Vero細(xì)胞為例。
[0163]8.1選取處于對(duì)數(shù)生長期的培養(yǎng)細(xì)胞(如Vero細(xì)胞、!fep-2細(xì)胞、….等)，待細(xì)胞匯生達(dá)80% -90%匯合時(shí)，吸棄培養(yǎng)液；I XPBS (pH7.4)洗滌貼壁細(xì)胞2_3次。
[0164]8.2接種HSV-1病毒液1.0ml于培養(yǎng)瓶中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，讓病毒液覆蓋細(xì)胞。
[0165]8.3于37°C作病毒吸附I小時(shí)，吸棄剩余病毒液；添加含2%小牛血清的維持培養(yǎng)液培養(yǎng)。
[0166]8.4置37°C，5% CO2培養(yǎng)24小時(shí)。待細(xì)胞出現(xiàn)，如細(xì)胞脹大、變圓、脫落等，明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)時(shí)，收集病毒培養(yǎng)液。
[0167]8.5將病毒培養(yǎng)液于-20°C反復(fù)凍融3次，以充分釋出病毒，成為HSV-1懸液，800-1000rpm,離心8_15min，無菌收獲病毒上清液，TCID50技術(shù)檢測(cè)病毒滴度約為17TCID50M，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0168]實(shí)施例9.單純皰疹病毒I型(HSV-1)毒力測(cè)定
[0169]能敏感增殖HSV-1的任何細(xì)胞都可以作為該病毒效價(jià)測(cè)定的細(xì)胞。此實(shí)施例8亦以Vero細(xì)胞為例。
[0170]9.1傳代的Vero細(xì)胞，胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，吹打均勻。
[0171]9.2吸取少量細(xì)胞懸液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整到合適的數(shù)量級(jí)。
[0172]9.3吸取細(xì)胞懸液，按每孔ΙΟΟμ I加入96孔板，37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)。
[0173]9.4用維持液對(duì)HSV-1原液(10°)用lXPBS(pH7.4)作對(duì)數(shù)稀釋，以成10°、10'10_2、10' 10_4、10_5、10' 10' 10_8、10_9等，每作一個(gè)稀釋度更換一根吸管，以防病毒滴度后延。
[0174]9.5待細(xì)胞在96孔板底部長成單層后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入稀釋的病毒液ΙΟΟμ I ；96孔板周圍孔全部加1XPBS(PH7.4)，每稀釋度加6個(gè)復(fù)孔。
[0175]9.6培養(yǎng)板置37°C吸附1.5-2.0小時(shí)后，吸棄病毒液，加入不含血清的細(xì)胞維持液；置37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)，每12小時(shí)觀察細(xì)胞病變，記錄每個(gè)梯度細(xì)胞病變孔數(shù)。
[0176]9.7計(jì)算比距，用Reed-Muench方法計(jì)算TCID50 (TCID50的對(duì)數(shù)=大于50 %的陽性百分比的最高稀釋對(duì)數(shù)+距離比例X稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)的差)，獲得病毒濃度為106-108TCID5Q/ml，無菌生理鹽水稀釋成105TCID5(l/ml，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0177]實(shí)施例10.HSV-1感染動(dòng)物模型的建立
[0178]10.1 60只昆明小鼠(4周齡)，雌雄各半，隨機(jī)分成6組，每組10只，隔離飼養(yǎng)。
[0179]10.2增殖的HSV-1 (105TCID50/ml)用無菌生理鹽水(0.9% )對(duì)數(shù)梯度稀釋成10'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ-5 五個(gè)梯度。
[0180]10.3每組小鼠對(duì)應(yīng)一個(gè)梯度，酒精棉球消毒后每只動(dòng)物沿右側(cè)眼角至耳后根連線中點(diǎn)進(jìn)針，顱內(nèi)注射30 μ I ;對(duì)照組注射無菌生理鹽水30 μ I。
[0181]10.4持續(xù)供給食物和水，觀察小鼠的進(jìn)食、體重、毛色等變化，以及腹部是否腫大變色、是否有顫抖抽搐現(xiàn)象的出現(xiàn)；每天記錄觀察，統(tǒng)計(jì)死亡率，觀察14天,按Reed-Muench方法計(jì)算半數(shù)致死量LD5tlt5本次實(shí)驗(yàn)表明，3Χ 12TCID5tl的HSV-1能使實(shí)驗(yàn)小鼠在14天內(nèi)半數(shù)死亡(LD5tl)。
[0182]實(shí)施例11.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理
[0183]11.180只小鼠隨機(jī)分為8組，分別作不同的處理。
[0184]組I (空白對(duì)照組)，用生理鹽水作對(duì)照，編號(hào)AO ；
[0185]組2 (HSV-1對(duì)照組)，只用HSV-1感染作對(duì)照，編號(hào)Al ;
[0186]組3 (Reov-dsRNA 對(duì)照組)，只用 Reov-dsRNA EnII 作對(duì)照，編號(hào) A2 ;
[0187]組4(Poly[1:C]陽性藥物對(duì)照組)，只用陽性藥物Poly [1: C]作對(duì)照，編號(hào)A3 ；
[0188]組5 (Reov-dsRNA+HSV-Ι 組)，Reov-dsRNA EnII 預(yù)防 HSV-1 感染組，即先用Reov-dsRNA ΕηΙΙ，后用 HSV-1 攻毒，編號(hào) BI ；
[0189]組6 (HSV+Reo-dsRNA 組)，Reov-dsRNA EnII 治療 HSV 感染組，即先用 HSV-1 感染，后用Reov-dsRNA EnII抗病毒治療，編號(hào)B2 ；
[0190]組7 (Poly [1: C] +HSV組)，陽性藥物Poly [1: C]預(yù)防HSV-1感染對(duì)照組，即先預(yù)防用陽性藥物Poly [1: C]，后用HSV-1攻毒，編號(hào)Cl ；
[0191]組8(HSV-l+Poly[1:C]組)，陽性藥物Poly [1: C]治療HSV-1感染對(duì)照組，即先用HSV-1感染，后用陽性藥物Poly[1:C]治療，編號(hào)C2。
[0192]11.2處理與觀察。
[0193]11.2.1對(duì)于預(yù)防研究組(B1、Cl)，每組在病毒感染前12小時(shí)與24小時(shí)腹腔注射給藥 2 次,每次每只小鼠 100 μ g Reov-dsRNA EnII 或 Poly [1: C]。
[0194]11.2.2對(duì)于治療研究組(B2、C2)以及HSV-1對(duì)照組(Al)在顱內(nèi)注射50LD50/mlHSV-1懸液30 μ I后，分別于24小時(shí)、48小時(shí)各組每只小鼠注射100 μ g Reov-dsRNA EnII或Poly[1:C]。
[0195]11.2.3對(duì)于對(duì)照組(A0、A1、A2、A3)除了實(shí)驗(yàn)處理外，在各實(shí)驗(yàn)組其余處理時(shí)間，各對(duì)照組動(dòng)物均施用等量的生理鹽水注射，以保證所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物刺激相同。
[0196]11.2.4觀察7天，取腦組織作組織病理學(xué)分析，以及其他相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。
[0197]實(shí)施例12.受試動(dòng)物HSV-1感染臨床表現(xiàn)
[0198]HSV-1感染小鼠后第二天小鼠開始出現(xiàn)感染的早期癥狀，進(jìn)食減少、體重急劇下降、消瘦、活動(dòng)減少、雙眼微閉、身體蜷縮顫抖；個(gè)別小鼠有前肢不斷搔動(dòng)鼻子與眼睛的中段；第三天開始有小鼠死亡，小鼠顫抖加劇并伴有抽搐的癥狀。
[0199]實(shí)施例13.受試小鼠血清干擾素(IFN-α/β/γ)水平的測(cè)定(結(jié)果見表I)
[0200]13.1受試小鼠取血及血清制備
[0201]13.1.1左手拇指食指抓住小鼠耳朵及頸部皮膚，小指與無名指固定小鼠尾巴及后肢；中指將小鼠的左前肢壓住，剪去胡須，將小鼠頭部朝下；
[0202]13.1.2用鑷子按住眼睛兩側(cè)，使小鼠眼睛充血而眼球突出，再用鑷子夾去眼球；
[0203]13.1.3收集血液并輕輕按壓心臟部位，盡量多的收集血液，每只大概能收集0.6 ?Iml ；
[0204]13.1.4當(dāng)血液不再流出時(shí)，頸脊髓離斷處死小鼠；
[0205]13.1.5將收集好的血液置于室溫兩小時(shí)，4°C過夜；
[0206]13.1.6待血液凝固，血清析出后，2500-3200rpm,離心8_12min,收集血清到另一個(gè)EP管，-20°C凍存，備用。
[0207]13.2受試動(dòng)物血清干擾素水平測(cè)定(按說明書操作)
[0208]本試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定小鼠血清中IFN- α、IFN- β、IFN- Y等干擾素的水平。操作程序如下:
[0209]13.2.1取出ELISA試劑盒，于室溫(20~25°C )放置15~30分鐘。實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)在室溫(20~25°C )內(nèi)進(jìn)行。
[0210]13.2.2分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μ I ;在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μ 1，然后再加待測(cè)樣品10μ I (樣品最終稀釋度為5倍)。除空白孔外，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μ I。輕輕晃動(dòng)混勻，37°C溫育60分鐘。
[0211 ] 13.2.3棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液(預(yù)先稀釋)，振蕩30秒，棄去洗滌液，輕輕拍打并用吸水紙吸干液體，如此重復(fù)3次，拍干。
[0212]13.2.4每孔先加入顯色劑A50 μ 1，再加入顯色劑B50 μ 1，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面晃動(dòng)混勻，37 °C暗室顯色15分鐘。
[0213]13.2.5取出酶標(biāo)板，每孔加終止液(30%-40%濃度氫氧化鈉)50μ 1，終止反應(yīng)(此時(shí)可見藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)，注意不要起泡。
[0214]13.2.6測(cè)OD值:以空白孔為對(duì)照調(diào)零，加終止液后15分鐘內(nèi)，在450nm波長處測(cè)各孔的吸光度值(0D值)。
[0215]13.2.7根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程；再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。由于樣品在測(cè)試前已經(jīng)稀釋了 5倍，所以最后得到的樣品濃度應(yīng)該乘以5倍的稀釋度(實(shí)際操作采用的對(duì)比稀釋)。
[0216]表1.各研究組小鼠血清IFN- α、IFN- β、IFN- Y濃度測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析表(x ±S)

【權(quán)利要求】
1.呼腸孤病毒dsRNA在醫(yī)用內(nèi)源性干擾素誘導(dǎo)劑制備中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104174029SQ201410346988
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2014年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月21日
【發(fā)明者】董長垣, 陳冬娥, 聶志平, 鄧庚糧, 劉軍 申請(qǐng)人:武漢星垣生物技術(shù)有限公司, 董長垣