一種從雞血中提取抗菌肽的方法
【專利摘要】本發明公開了一種從雞血中提取抗菌肽的方法。該方法包括如下步驟：(1)取雞血，進行血細胞破碎后加入木瓜蛋白酶進行酶解；(2)向酶解液中加入乙酸浸提，離心取上清，調節pH至6.0±0.5，獲得雞血抗菌肽粗提物。實驗證明，利用本發明的方法從雞血中提取的抗菌肽對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、綠膿桿菌等常見的致病菌有明顯的抑制作用。本發明為生產抗菌肽提供了一個新的途徑和方法。本發明方法具有操作方便快捷、設備簡單、分離提取率高、成本低的優點，可應用于大規模地從新鮮雞血中分離純化抗菌肽的生產。
【專利說明】一種從雞血中提取抗菌肽的方法

【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及一種提取抗菌肽的方法，特別涉及一種從雞血中提取抗菌肽的方法。

【背景技術】
[0002]目前，隨著傳統抗生素的濫用，細菌耐藥性問題和藥物殘留問題已日趨嚴重一甚至出現超級細菌，而這些問題也直接威脅著人類健康乃至整個生物圈的生態平衡，已引起世界極高度的關注，而尋求一種取代傳統抗生素的無殘留、無耐藥性的新型抗菌藥物已成為當務之急。抗菌肽具有高效的抑菌效果和廣泛而穩定的生物學活性，已經廣泛引起人們的興趣和關注。抗菌肽不僅具有廣譜、高效的抗微生物活性，而因其獨特的抗菌機理不會使微生物產生耐藥性，在機體內無殘留，具廣闊的開發應用前景，抗菌肽的應用必將帶來一場抗生素新的革命。
[0003]我國作為世界養雞業大國，相較于豬血近年來的廣泛應用和成本不斷提高，雞血來源豐富、開發不充分、價格低廉，可以滿足大規模深化加工的需求，具有很強的開發應用及推廣價值。目前在國內外還未見從新鮮雞血中提取抗菌肽的技術和產品。


【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種從雞血中提取抗菌肽的方法。
[0005]本發明所提供的從雞血中提取抗菌肽的方法，具體可包括如下步驟:
[0006](I)取雞血，進行血細胞破碎(目的是釋放血紅蛋白)后加入木瓜蛋白酶進行酶解；
[0007](2)向酶解液中加入乙酸浸提，離心取上清，調節pH至6.0±0.5(如6.0)，獲得雞血抗菌肽粗提物。
[0008]在所述方法的步驟(2)之后，還可包括如下步驟(3):
[0009](3)將所述雞血抗菌肽粗提物上樣于S^hadex G-100凝膠柱，采用洗脫液進行洗脫，收集具有抗菌活性的洗脫峰。
[0010]在所述方法的步驟(3)之后，還可包括如下步驟(4):
[0011](4)將步驟(3)收集的具有抗菌活性的洗脫峰上樣于S^hadex G_25凝膠柱，采用洗脫液進行洗脫，收集洗脫峰，獲得雞血抗菌肽。
[0012]在所述方法的步驟(1)中，所述木瓜蛋白酶與所述雞血的配比可為1750-35000U:10ml (如1750-3500U:100ml，具體如3500U:1OOmL);所述酶解的溫度可為70~90°C (如700C )，時間可為4~6h (如4h)。另外，在本發明中，所述進行血細胞破碎具體通過采用組織搗碎機攪拌所述雞血實現的。
[0013]在本發明中，所述木瓜蛋白酶的酶活為3500U/mg。相應的，所述木瓜蛋白酶與所述雞血的配比可為 0.5-10mg:100ml (如 0.5-lmg:100ml，具體如 Img:1OOmL)。
[0014]在所述方法的步驟(2)中，所述向酶解液中加入乙酸具體可為:向所述酶解液中加入等體積的5% (體積百分含量)的乙酸水溶液；所述浸提具體可為:4~37°C (如4°C~10°C，再如 4°C )震蕩 16-20h (如 16h);所述離心為:6600g-10000g (如 1000g) 4 ~10°C (如 4°C )離心 20min ~30min (如 20min)。
[0015]在所述方法的步驟(3)中，所述洗脫液具體可為:pH為6.0的濃度為0.2mol/L的乙酸鈉水溶液；所述洗脫的速度具體可為10.0mL/cm2.h。
[0016]在本發明的一個實施例中，步驟(3)的洗脫過程中共產生兩個洗脫峰，所述具有抗菌活性的洗脫峰實際為第二個洗脫峰。所述抗菌活性具體體現為抗如下細菌中的至少一種:大腸桿菌(如ACTT 25922)、綠膿桿菌(如ACTT 27853)、嗜水氣單胞菌(Genebank IDSequence ID:gb|KJ156374.11)。
[0017]在所述方法的步驟(4)中，所述洗脫液具體可為:pH為6.0的濃度為0.2mol/L的乙酸鈉水溶液；所述洗脫的速度具體可為10.0mL/cm2.h。
[0018]在本發明的一個實施例中，步驟(4)的洗脫過程中只產生一個洗脫峰，該洗脫峰即為純化后的雞血抗菌肽樣品。
[0019]在所述方法的步驟(3)中，S印hadex G-100凝膠柱的柱長度和柱內徑比為8:1。具體而言，本發明中所采用的Sephadex G-100凝膠柱為Pharmacia公司產品,其產品目錄號為17-0061-02)。所述上樣的上樣量為1ml ;所述洗脫的洗脫體積為1-1.5L。
[0020]在所述方法的步驟(4)中，Sephadex G-25凝膠柱的柱長度和柱內徑比為8:1。具體而言，本發明中所采用的Sephadex G_25凝膠柱為Pharmacia公司產品,其產品目錄號為17-0033-1。所述上樣的上樣量為1ml ;所述洗脫的洗脫體積為1_1.5L。
[0021]在上述方法中，所述雞血即可為新鮮的雞血，也可以為經冷凍后融化的雞血。
[0022]利用如上所述方法提取得到的雞血抗菌肽也屬于本發明的保護范圍。
[0023]所述雞血抗菌肽在如下任一中的應用也屬于本發明的保護范圍:
[0024](al)制備抗微生物制劑；
[0025](a2)制備動物飼料添加劑。
[0026]活性成分為所述雞血抗菌肽的抗微生物制劑或動物飼料添加劑也屬于本發明的保護范圍。
[0027]以上所有的所述微生物均可為細菌或病毒。在本發明中，所述微生物具體為如下細菌中的至少一種:大腸桿菌(如ACTT 25922)、綠膿桿菌(如ACTT 27853)、嗜水氣單胞菌(如 Genebank ID Sequence ID 為 gb KJ156374.11 的嗜水氣單胞菌)。
[0028]實驗證明，利用本發明的方法從雞血中提取的抗菌肽對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、綠膿桿菌等常見的致病菌有明顯的抑制作用。具體而言，本發明具有以下優點:1、本發明方法實現了從雞血中提取具有較強抗菌活性的多肽物質，為生產抗菌肽提供了一個新的途徑和方法。2、采用本發明方法提取的抗菌肽，屬于天然提取物，具有天然、無毒、無污染、無殘留、無副作用、高效抗菌、抗病毒、促生長和調節免疫等廣泛而穩定的功能特點。3、與同類方法相比，本發明方法操作方便，設備簡單，提取周期短，而且分離提取率高。4、本發明所開發產品的原料來源豐富，生產成本低，可以使雞血得到高值化利用。因此本發明的應用不僅可以帶來良好的經濟效益，而且還具有良好的生態效益，進而還具有重要的公共衛生學意義，符合構建節約環保型社會的理念。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1為雞血抗菌肽粗提物經S^hadex G-100凝膠柱的層析曲線圖。
[0030]圖2是雞血抗菌肽S^hadex G-100凝膠柱洗脫液對大腸桿菌的抗菌實驗效果圖。其中，阿拉伯數字表示圖1中對應的管數表示陰性對照(0.2mol/L的醋酸鈉洗脫液)。
[0031]圖3是雞血抗菌肽粗提物經S^hadex G-100凝膠柱層析洗脫后收集的有效抑菌成分經Sephadex G-25凝膠柱的層析曲線圖。
[0032]圖4是雞血抗菌肽S印hadex G_25凝膠柱洗脫液對大腸桿菌的抗菌實驗效果圖。其中，阿拉伯數字表示圖3中對應的管數；“ + ”表示20000IU的青鏈霉素表示陰性對照(0.2mol/L的醋酸鈉洗脫液)；“Y”表示雞血抗菌肽粗提物(實施例1步驟3獲得的液體)；“8Ν2”表示S印hadex G-100凝膠柱層析洗脫后收集的有效抑菌成分經過濃縮之后的Sephadex G_25的上樣液；五角星表示Sephadex G-100凝膠柱層析洗脫后收集的有效抑菌成分(即經S印hadex G-100凝膠柱層析后收集的第9_16管)。

【具體實施方式】
[0033]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0034]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0035]實施例1、從雞血中提取雞血抗菌肽
[0036]一、從雞血中提取雞血抗菌肽時酶解浸提相關條件的確定
[0037]從雞血中提取雞血抗菌肽時進行酶解浸提的大體流程如下:取雞血一破碎紅細胞一加入木瓜蛋白酶(酶活為3500U/mg，以下出現的所有木瓜蛋白酶的酶活均與此相同)進行酶解一向酶解液加入等體積的5%乙酸(體積百分含量，溶劑為水)浸提一離心取上清調pH 6.0得雞血抗菌肽的粗提物。
[0038]為了提高提取效率和提取質量，本發明的發明人對“酶解”和“浸提”兩個步驟進行了參數優化。具體如下:
[0039]1、酶解時間的優化
[0040](I)從雞屠宰場收集新鮮雞血，組織搗碎機攪拌均勻(同樣可以將采集的雞血冷凍待用時融化后再按上步驟進行)，此步驟的目的是破碎血細胞，釋放血紅蛋白，凍融之后效果更佳。
[0041](2)向步驟(1)處理過的雞血中加入木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶與雞血的配比為Img木瓜蛋白酶/10ml雞血原液，混勻，在70°C條件下酶解(酶解時間設置如下:lh、2h、3h、4h、5h、6h和7h)，以得到雞血血紅蛋白多肽。
[0042](3)向步驟⑵的酶解液加入等體積的5%乙酸(體積百分含量，溶劑為水)，4°C震蕩浸提16h，8000r/min (相當于1000g) 4°C離心20min，留取上清，調其pH值至6.0，即為雞血抗菌肽的粗提物。
[0043](4)采用瓊脂糖彌散方法(檢測菌在瓊脂平板上的終濃度為106CFU/ml)對不同酶解時間對應的雞血抗菌肽的粗提物(20 μ L)進行檢測，檢測其對大腸桿菌ACTT25922株的抗菌作用。
[0044]結果如表1所示，可見酶解時間為4_6h時，效果相對較好。
[0045]表1不同酶解時間(T)對提取抗菌肽效果的影響

【權利要求】
1.一種從雞血中提取抗菌物質的方法，包括如下步驟: (1)取雞血,進行血細胞破碎后加入木瓜蛋白酶進行酶解； (2)向酶解液中加入乙酸浸提，離心取上清，調節pH至6.0±0.5，獲得雞血抗菌物質的粗提物。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于:在步驟(2)之后還包括如下步驟(3): (3)將所述雞血抗菌物質的粗提物上樣于S^hadexG-1OO凝膠柱，采用洗脫液進行洗脫，收集具有抗菌活性的洗脫峰。
3.根據權利要求1所述方法，其特征在于:在步驟(3)之后還包括如下步驟(4): (4)將步驟(3)收集的具有抗菌活性的洗脫峰上樣于S^hadexG-25凝膠柱，采用洗脫液進行洗脫，收集洗脫峰，獲得所述雞血抗菌物質。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，所述木瓜蛋白酶與所述雞血的質量配比為1750-35000U =10ml ;和/或 步驟(1)中，所述酶解的溫度為70~90°C，時間為4~6h。
5.根據根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述向酶解液中加入乙酸為:向所述酶解液中加入等體積的體積百分含量為5%的乙酸水溶液；和/或 步驟⑵中，所述浸提為4~37°C震蕩16-20h ;和/或 步驟(2)中，所述離心為6600~10000g4°C離心20~30min。
6.根據根據權利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述洗脫液為pH為6.0的濃度為0.2mol/L的乙酸鈉水溶液；和/或 所述洗脫的速度為10.0mL/Cm2.h。
7.根據權利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，所述洗脫液為pH為6.0的濃度為0.2mol/L的乙酸鈉水溶液；和/或 所述洗脫的速度為10.0mL/Cm2.h。
8.利用權利要求1-7中任一所述方法提取得到的雞血抗菌物質。
9.權利要求8所述的雞血抗菌物質在如下任一中的應用: (al)制備抗微生物制劑； (a2)制備動物飼料添加劑。
10.抗微生物制劑，其活性成分為權利要求8所述的雞血抗菌物質；或 動物飼料添加劑，其活性成分為權利要求8所述的雞血抗菌物質。
【文檔編號】A61P31/04GK104164467SQ201410389532
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月8日 優先權日:2014年8月8日
【發明者】佘銳萍, 胡鳳姣, 吳橋興 申請人:中國農業大學