本申請要求于2014年4月18日提交的申請號為61/981,240的美國臨時申請的優先權，將其公開內容通過引用并入本文。
技術領域：
本公開內容總體上涉及識別Thomsen-Friedenreich(TF)人腫瘤抗原的人源化抗體，以及利用該單克隆抗體的方法。
背景技術：
：在癌病變期間，在細胞表面上的糖類結構的生物合成中發生變化，并且連接至蛋白質或連接至脂質的若干不同糖類已被識別是腫瘤相關的抗原。Thomsen-Friedenreich(TF)二糖(Galβ1-3GalNAcα)被典型地發現O-連接至絲氨酸或蘇氨酸殘基。TF-Ag(也稱為T抗原)已與若干人類腫瘤相關，包括在胰腺、結腸和乳腺中發現的那些，并且基于此已被稱為泛癌標記(pan-carcinomamarker)。TF-Ag通過用較大的聚糖鏈延伸而從正常成人組織中的免疫系統被隱蔽起來。在癌中，細胞糖基化系統可以被破壞，這導致這些鏈的截短和TF抗原的暴露。可以靶向TF-Ag的新單克隆抗體及其抗體片段是期望的，并且由本公開內容提供。技術實現要素：本公開內容在多個實施方案中包括用于治療TF+癌癥的組合物和方法。在實施方案中，公開內容包括特異性地結合至TF-Ag的部分人源化單克隆抗體(mAbs)或其片段。該mAb或其片段包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈包含選自由以下各項組成的組中的序列：EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVTMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:7)(H1)；EVQLLESGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVTLTADKSSSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTVTVSS(SEQIDNO:8)(H2)；和EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVKQAPGQGLEWIGFISPNTDYTEYNQKFRDKATMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:9)(H3)，和它們的組合。所述輕鏈包含選自由以下各項組成的組中的序列：DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:10)(L1)；L2DIVMTQTPLSLPVTLGQPASISRSSQTIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:11)(L2)；和DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:12)(L3)；和它們的組合。制備和測試了另外的形式H2、H3、L2和L3。這些包括以下：重鏈可變區H2a：QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTVTVS(SEQIDNO:13)重鏈可變區H3a：EGQLLESGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTTYWMHWVKKRPGQGLEWIGFISPNTDYTEYNQKFRDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:14)輕鏈可變區L2a：DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKVDIK(SEQIDNO:15)輕鏈可變區L3a：ELVMTQTPLSLPVNLGDQASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:16).在本公開內容中包括的重和輕可變鏈的組合為：H1-L1；H1-L2；H1-L2a；H1-L3；H1-L3a；H2-L1；H2-L2；H2-L2a；H2-L3；H2-L3a；H3-L1；H3-L2；H3-L2a；H3-L3；H3-L3a；H2a-L1；H2a-L2；H2a-L2a；H2a-L3；H2a-L3a；H3a-L1；H3a-L2；H3a-L2a；H3a-L3；和H3a-L3a。在實施方案中，所述mAb包含人IgG恒定區。在實施方案中，所述mAb或其TF-Ag結合片段綴合至選自由化學治療藥物、毒素和放射性同位素組成的組中的試劑。在另一方面，本公開內容包括用于預防和/或治療個體中的癌癥的方法，其中所述癌癥包含表達TF-Ag的癌細胞。所述方法包括向個體施用(給藥，administer)一種或多種如上所述的mAb或片段，其中所述個體中的癌細胞的生長、或存活、或轉移、或它們的組合在所述施用之后被抑制。在另一方面，提供了包含部分人源化mAb或其片段的藥物組合物。在另一方面，本公開內容提供體外細胞培養物，其中該細胞培養物中的細胞表達所述部分人源化mAb或其片段。在另一方面，本公開內容提供編碼所述mAb及其TF-Ag結合片段的多核苷酸序列，包含這樣的多核苷酸的表達載體和包含這樣的表達載體的體外細胞培養物。在實施方案中，所述mAb或其TF-Ag結合片段由多于一種的表達載體編碼。在實施方案中，提供了制備所述mAb及其TF-Ag結合片段的方法，并且通常包括在體外細胞培養物中表達所述mAb或TF-Ag結合片段、或它們的組合，和從所述細胞培養物分離所述mAb或TF-Ag結合片段、或它們的組合。還提供了包含所述mAb及其TF-Ag結合片段的試劑盒。附圖說明圖1提供了包含在本公開內容中的JAA-F11重鏈可變區和三個VH變體區(H1、H2和H3)的氨基酸序列比對。黑體指示在JAA-F11和所設計的人源化H鏈之間的相同氨基酸；黑體和加陰影的氨基酸指示所設計的人源化鏈和小鼠JAA-F11之間的區別。以黑體和斜體顯示的在位置72的丙氨酸是被保留以避免空間位阻的小鼠殘基。互補決定區(CDR)以斜體排列。編號根據Kabat系統。mJAAF11序列是SEQIDNO:17。H1序列是SEQIDNO:7；H2序列是SEQIDNO:8；H3序列是SEQIDNO:9。圖2描繪了mJAA-F11輕鏈可變區(JAA-F11VH)和三個VL變體區(L1、L2和L3)的氨基酸序列比對。黑體指示小鼠氨基酸或與小鼠序列相同的氨基酸，黑體和加陰影的氨基酸是所設計的人源化JAA-F11變體和小鼠JAA-F11之間的區別。以黑體和斜體顯示的在位置51的亮氨酸是被保留以避免空間位阻的小鼠殘基。mJAAF11序列是SEQIDNO:17。L1序列是SEQIDNO:10；L2序列是SEQIDNO:11；L3序列是SEQIDNO:12。圖3.通過ELISA利用mJAA-F11抑制來確定相對親和力以評估各個hJAA-F11和嵌合抗體與TF-Ag-BSA的結合。誤差棒代表±1標準誤差。圖4.hJAA-F11、嵌合和小鼠JAA-F11(50μg/mL)與10個乳腺癌細胞系的結合。細胞系包括三陰性(HCC70、BT549、MDA-MB-231、MDA-MB-468、DU4475)、ER/PR-陽性(HCC1419、AU565、MDA-kb2)和HER2-陽性(CAMA-1、HCC1428)。對于以上測試的所有細胞系，與hJAA-F11、嵌合或小鼠JAA-F11(在50μg/mL)的結合顯著高于(p≤0.05)(學生T-檢驗)TF-Ag陰性對照骨髓瘤的那些。各個誤差棒代表±1標準偏差。圖5.嵌合抗體和人源化JAA-F11抗體(除了H3L3)引起腫瘤細胞生長的小(～6-11％)但統計學顯著性的抑制。沒有看到細胞增殖的增強。對于在2或1ug/ml的任何抗體都沒有看到顯著性結果。圖6A.小鼠、嵌合和4個hJAA-F11構建體針對TF-Ag陽性人乳腺癌細胞系(BT549)的ADCC活性。結果呈現為相比于細胞的100％溶解在抗體處理的細胞中的百分比細胞溶解。在人細胞系中的所有情況下，H2L2和H3L3顯示比嵌合或小鼠抗體統計學更大的ADCC活性(p<0.05)。這是來自供體#1和供體#2的PBMC上的所有實驗的代表性平均值(多于3個的獨立實驗)。誤差棒表示±1標準誤差。圖6B.在來自供體#1的PBMC上，小鼠、嵌合和4個hJAA-F11構建體針對TF-Ag陽性人乳腺癌細胞系(BT549)的ADCC活性。結果呈現為相比于細胞的100％溶解在抗體處理的細胞中的百分比細胞溶解。在人細胞系中的所有情況下，H2L2和H3L3顯示比嵌合或小鼠抗體統計學更大的ADCC活性(p<0.05)。這是至少3個獨立實驗的平均值。誤差棒表示±1標準誤差。圖6C.在來自供體#2的PBMC上，小鼠、嵌合和4個hJAA-F11構建體針對TF-Ag陽性人乳腺癌細胞系(BT549)的ADCC活性。結果呈現為相比于細胞的100％溶解在抗體處理的細胞中的百分比細胞溶解。在人細胞系中的所有情況下，H2L2和H3L3顯示比嵌合或小鼠抗體統計學更大的ADCC活性(p<0.05)。這是至少3個獨立實驗的平均值。誤差棒表示±1標準誤差。圖6D.小鼠、嵌合和3個hJAA-F11構建體針對4T1TF-Ag陽性小鼠乳腺癌細胞系的ADCC活性。結果呈現為相比于細胞的100％溶解在抗體處理的細胞中的百分比細胞溶解。H3L3和嵌合顯示比小鼠抗體統計學更大的ADCC活性(p<0.05)。誤差棒表示±1標準誤差。ADCC僅利用來自供體#3的PBMC進行一次。圖7.人源化、嵌合和小鼠JAA-F11不誘導補體依賴細胞毒性(CDC)。測試了小鼠、嵌合和2個hJAA-F11構建體針對人HCC1428乳腺癌細胞系的CDC活性。結果呈現為相比于細胞的100％溶解在抗體處理的細胞中的百分比細胞溶解。陽性對照：試劑盒中包括的LDH陽性細胞顯示溶解。誤差棒表示±1標準誤差。圖8.小鼠、嵌合和4個hJAA-F11抗體利用酶免疫測定的內化以測量表面結合。內化通過在37℃或4℃用抗體孵育小鼠4T1乳腺癌細胞進行分析。如預期的，分布圖(pattern)與圖20中對于H3L3所示的ADCC分布圖相反，但對于H2L2是出乎意料的，其誘導ADCC并且內化。小鼠、H2L2、嵌合Ab、H2L3和H1L1顯著性地內化(p<0.05)。誤差棒表示±1標準誤差。圖9.顯示hJAA-F11抗體在攜帶4T1腫瘤的小鼠中的免疫定位的MicroPET圖像。圖10.顯示游離124碘向在攜帶4T1腫瘤的小鼠中的甲狀腺的定位的MicroPET圖像。具體實施方式本公開內容包括特異性地識別TF-Ag的不同的人源化單克隆抗體(mAb)及其片段、制備該mAb的方法和使用該mAb用于預防和/或治療目的的方法，以及用于診斷成像的方法。由本公開內容提供的mAb的氨基酸序列利用新穎方式開發以改變以ATCCC目錄號CRL-2381保藏的雜交瘤所產生的mAb中的氨基酸序列，使得mAb的框架區以保持特異性和降低免疫原性的引導方式結合鼠類和人類免疫球蛋白(Ig)序列二者。所述雜交瘤產生稱為JAA-F11的mAb。在鼠類框架區的情形中引入到JAA-F11序列中的變化導致三個不同重和三個不同輕可變鏈的系綜物(ensemble)，這些鏈可以組合以產生二十五個不同的mAb，其適于抗擊各種各樣的癌癥(包含表達TF-Ag的癌細胞)中的任一種。此外，所述mAb具有所需的特性，使得它們特別適合于在個體中優先誘導不同的抗癌機制。例如，取決于重鏈和輕鏈的選擇，本公開內容包括提供用于刺激增強的抗體-依賴性細胞毒性或補體依賴性細胞毒性，或所述mAb的內化。本公開內容的實施方案包括來自JAA-F11mAb的CDR序列。這些是：VH鏈：CDR1：SGYTFTTYWMH；(SEQIDNO:1)；CDR2：FISPNTDYTEYNQKFRD；(SEQIDNO:2)；CDR3：RSFIGYNFDFWGQGT；(SEQIDNO:3)；和VL鏈：CDR1：CRSSQTIVYSNGNTYLEW；(SEQIDNO:4)；CDR2：KVSNRFSGVPD；(SEQIDNO:5)；和CDR3：CFQGSHVPFTGSG；(SEQIDNO:6)。CDR序列放置于修飾的框架序列的情形中。因而，所述mAb及其TF-Ag結合片段包含選自以下的重鏈：H1-EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVTMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:7)；H2-EVQLLESGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVTLTADKSSSTAYMELSSLTSEDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTVTVSS(SEQIDNO:8)；H3-EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMHWVKQAPGQGLEWIGFISPNTDYTEYNQKFRDKATMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:9)和它們的組合；和選自由以下各項組成的組中的輕鏈：L1-DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:10)；L2-DIVMTQTPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:11)；L3-DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:12)和它們的組合。除了前述序列之外，以某些組合制備和測試以下重鏈和輕鏈：重鏈可變區H2a:QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTTYWMHWVRQAPGQGLEWMGFISPNTDYTEYNQKFRDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTVTVS(SEQIDNO:13)重鏈可變區H3a：EGQLLESGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTTYWMHWVKKRPGQGLEWIGFISPNTDYTEYNQKFRDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARSFIGYNFDFWGQGTTLTVSS(SEQIDNO:14)輕鏈可變區L2a：DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKVDIK(SEQIDNO:15)輕鏈可變區L3a：ELVMTQTPLSLPVNLGDQASISCRSSQTIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEADDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQIDNO:16).本公開內容涵蓋包含包括前述序列或由前述序列組成的氨基酸序列的mAb及其TF-Ag結合片段。在實施方案中，本公開內容包括mAb及其TF-Ag結合片段，其中框架和CDR序列由以下各項組成：SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10，SEQIDNO:11，SEQIDNO:12，SEQNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15和SEQIDNO:16。因此，以下25個重鏈和輕鏈組合被此公開內容涵蓋：H1-L1；H1-L2；H1-L2a；H1-L3；H1-L3a；H2-L1；H2-L2；H2-L2a；H2-L3；H2-L3a；H3-L1；H3-L2；H3-L2a；H3-L3；H3-L3a；H2a-L1；H2a-L2；H2a-L2a；H2a-L3；H2a-L3a；H3a-L1；H3a-L2；H3a-L2a；H3a-L3；和H3a-L3a。在實施方案中，本公開內容包括包含H1L1、H2L2、H3L3、H2L3、H2a和L2a，以及H3a和L3a的組合的mAb及其TF-Ag結合片段。在此公開內容中，除了對于以下描述的H和L鏈的組合的結果之外，還制備和測試了H2a-L2a和H3aL3a，并且對于這兩個組合的結果分別類似于對于H2-L2和H3-L3報告的那些結果。H2a-L2a和H3a-L3a組合作為亞克隆程序的結果制備，允許選擇對于TF-Ag具有進一步增強的結合特性的額外亞克隆體(如通過在酶免疫測定(EIA)中的最高反應性確定的)。這些之中，對于內化最佳的是H2L2和H2aL2a，而對于ADCC最佳的是H2L2、H2aL2a、H3L3和H3aL3a。代表性的VH和VL序列經由附圖1和2進一步描述。具體地，圖1提供包括在此公開內容中的JAA-F11重鏈可變區和三個VH變體區(H1、H2和H3)的氨基酸序列比對。黑體指示在JAA-F11和所設計的人源化H鏈之間的相同氨基酸；黑體和加陰影的氨基酸指示所設計的人源化鏈和小鼠JAA-F11之間的區別。以黑體和斜體顯示的在位置72的丙氨酸是被保留以避免空間位阻的小鼠殘基。CDR以斜體排列。編號根據Kabat系統。因此將理解，雖然本文中描述的mAb稱為“人源化”，但它們確實包含某些鼠類殘基，并且因此可以被認為是部分人源化的。圖2描繪了mJAA-F11輕鏈可變區(JAA-F11VH)和三個VL變體區(L1、L2和L3)的氨基酸序列比對。黑體指示小鼠氨基酸或與小鼠序列相同的氨基酸，黑體和加陰影的氨基酸是所設計的人源化JAA-F11變體和小鼠JAA-F11之間的區別。以黑體和斜體顯示的在位置51的亮氨酸是被保留以避免空間位阻的小鼠殘基。根據圖1和2明顯的是，盡管本發明提供的人源化H和L鏈包括與JAA-F11小鼠抗體的區別和它們本身之間的區別，但是某些鼠類氨基酸已被保留以維持該人源化mAb的特異性。本文描述的人源化mAb的片段也包括在本發明中。合適的抗體片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab')2、ScFv和Fv片段。多種技術已被開發用于生產抗體片段并且包括此公開內容的范圍內。在實施方案中，所述mAb或其片段經由重組表達載體生產宿主細胞。本公開內容包括編碼本文描述的氨基酸序列的所有多核苷酸序列、包含這樣的多核苷酸序列的表達載體和包含這樣的表達載體的體外細胞培養物。在實施方案中，細胞培養物是真核細胞。在實施方案中，細胞培養物是哺乳動物細胞。在實施方案中，細胞是CHO細胞。包含所述mAb和/或其TF-Ag結合片段的試劑盒、和/或表達所述mAb和/或其TF-Ag結合片段的細胞培養物由此公開內容提供。通常，試劑盒包括一個以上容納所述mAb和/或其TF-Ag結合片段、或表達它們的細胞的密封容器。使用所述mAb和/或TF-Ag結合片段用于治療和/或成像目的說明書可以包括在試劑盒中。在實施方案中，本公開內容包括制備所述mAb或其TF-Ag結合片段的方法，包括培養包含表達載體或編碼所述mAb或其TF-Ag結合片段的其它多核苷酸序列的細胞，允許所述mAb或其TF-Ag結合片段表達，和從細胞培養物分離所述mAb或其TF-Ag結合片段。編碼所述mAb或其TF-Ag結合片段的核苷酸序列可以利用任何合適的表達載體表達，許多表達載體在本領域是已知的和/或可商購獲得。在一個實施方案中，重鏈和輕鏈在單個表達載體如質粒上表達。在另一個實施方案中，重鏈和輕鏈在同一細胞中的不同質粒上表達，之后該表達的重鏈和輕鏈形成常規mAb結構。得益于本公開內容，所述mAb或其TF-Ag結合片段可以利用常規技術分離和/或純化。在另一方面，本公開內容提供了抑制個體中的癌細胞的生長和/或抑制個體中的癌細胞的轉移的方法，該癌細胞表達TF-Ag分子。所述方法包括向個體施用治療量的人源化mAb和/或其片段，其中所述施用抑制表達TF-Ag的癌細胞的生長和/或抑制其轉移。在實施方案中，實施本發明的方法減小了腫瘤的體積，和/或減少了轉移灶或繼發腫瘤的形成。在實施方案中，所述方法對需要其的個體提供。在實施方案中，有需要的個體已被診斷患有或被懷疑具有發展或癌癥復發或者處于發展或具有癌癥復發的風險。在實施方案中，使用治療有效量的mAb或其TF-Ag結合片段。如本文使用的，術語“治療有效”意指施用的mAb或其TF-Ag結合片段的量為足以抑制TF+癌細胞的生長、存活和/或轉移的量。在多個實施方案中，人源化mAb和/或其片段可以綴合至化學治療劑以能夠經由結合至表達TF-Ag的細胞將該化學治療劑定位至癌細胞。在這樣的抗體綴合物的產生中可用的化學治療劑包括酶活性毒素及其片段。合適的酶活性毒素包括白喉A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α八疊球菌、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻風樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制劑、白樹毒素、邁托毒素、局限曲霉素、酚霉素、新霉素和單端孢霉烯。化學治療劑可以通過任何合適的化學綴合方式共價地連接至所述mAb或其TF-Ag結合片段。在實施方案中，化學治療劑可以包含具有所述mAb或TF-Ag結合片段的融合蛋白的節段。在另一方面，本公開內容提供了用于在個體中鑒別轉移灶、腫瘤或其組合的方法，其中所述轉移灶或腫瘤包含表達TF-Ag的細胞。所述方法包括以下步驟：向個體施用人源化mAb和/或其片段，其中人源化mAb和/或其片段已被綴合至可檢測標記，和檢測所述可檢測標記以鑒別轉移灶、腫瘤或其組合。因此，可將人源化mAb和/或其片段開綴合至可檢測標記如放射活性劑。各種各樣的放射活性同位素可用于綴合至JAA-F11mAb，使得JAA-F11mAb結合的細胞可以被成像或選擇性地破壞。對于表達TF-Ag的細胞的選擇性破壞，JAA-F11mAb可以綴合至高度放射活性原子如In111、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212以及Lu的放射活性同位素。當人源化mAb和/或其片段用于鑒別轉移灶中或腫瘤中表達TF-Ag的細胞時，它們可以包含用于核素研究的放射活性原子例如Tc99m(亞穩锝-99)、I123，或者用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像或“MRI”)的自旋標記，如I123、I131、I124、F19、C13、N15、O17或釓(III)或錳(II)。標記的人源化mAb和/或其片段可以注射入被診斷患有或懷疑具有轉移性疾病的患者中以鑒別轉移灶和/或腫瘤。來自這樣的成像的信息可以用于患者的疾病狀態的診斷或分期。使用的標記可以根據要使用的成像系統進行選擇。例如，銦111、锝99或碘131可以用于平面掃描或單光子發射計算斷層攝像(SPECT)。發射正電子的標記如氟19、碘123和碘124可以用于正電子發射斷層造影術。順磁離子如釓(III)或錳(II)可以用于磁共振成像(MRI)。標記在個體的特定組織內的定位允許包含表達TF-Ag的細胞的轉移灶或腫瘤的定位。在特定位置大于背景的標記的濃度允許鑒別轉移細胞的存在。在一個優選實施方案中，在施用標記的人源化mAb和/或其片段之后，允許合適時間期過去使得未結合的人源化mAb和/或其片段從個體被清除，使得背景標記大大地減少。包含綴合或未綴合的人源化mAb和/或其片段的治療制劑可以通過與藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑(雷明頓制藥科學第16版Osol，A.Ed.(1980))混合，以凍干制劑或水溶液的形式制備。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所采用的劑量和濃度下對受體無毒，并且包括緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六烴季銨；氯化苯甲烴銨；芐索氯銨；苯酚，丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲苯酚)；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、白明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子如鈉；金屬復合物(例如Zn-蛋白質復合物)；和/或非離子表面活性劑如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。人源化mAb和/或其片段可以與藥物組合物中的其它化學治療劑組合。所述人源化mAb和/或其TF-結合片段可以通過任何合適方式施用，包括腸胃外、皮下、腹膜內、肺內和鼻內。腸胃外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內、淋巴管內或皮下施用。另外，人源化mAb和/或其片段可以合適地通過脈沖輸注，例如在減少抗體劑量的情況下施用。優選地，用藥通過注射，最優選靜脈內或皮下注射給予，這部分地取決于施用是否短暫或漫長。在某些實施方案中，人源化mAb和/或其片段施用至被診斷患有或懷疑具有乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌或其它TFAg+癌的個體以抑制癌細胞的轉移或抑制其生長。也可以施用其它化合物如化學治療劑、免疫抑制劑和/或細胞因子。聯合施用可以包括同時施用，使用單獨的制劑或單個藥物制劑，并且還可以包括以任意順序的連續施用，其中優選地在兩種(或所有)活性劑同時地發揮它們的生物活性期間存在一個時間期。人源化mAb和/或其片段可以根據前述治療方法以足以抑制表達TF-Ag的細胞的轉移和/或生長的量施用至人或其它動物。本領域技術人員將理解，藥學上可接受的載體或稀釋劑的形式和特性由與其要組合的活性成分的量、施用途徑和其它熟知變量如個體大小和疾病階段支配。實施例1以下實施例描述了制備和使用此公開內容的人源化mAb，以及所述mAb的物理和功能性質。人源化JAA-F11的設計和構建在驗證小鼠JAA-F11可變區的序列之后，定義CDR以保持對于TF-Ag的特異性和親和力。包含的CDR分別基于序列和結構變化性根據Kabat等[139]和Chothia等[141]二者定義。如果兩個氨基酸含有一對分隔開以下的原子，則認為它們二者在蛋白結構中彼此接觸[138]。關于小鼠JAA-F11的X射線晶體學和計算碳水化合物線程研究[142]鑒別出在距離結合位點內的氨基酸殘基。這些氨基酸以及對于構象結構重要的在輕鏈的位置L23和L88處的兩個半胱氨酸殘基包括在JAA-F11人源化中使用的CDR的最后包容性定義中。人類框架的選擇應用三種不同方式來選擇用于重鏈和輕鏈JAAF11可變區鏈的人類受體抗體框架。設計了重鏈的三個變體(H1、H2、H3)和輕鏈的3個變體(L1、L2、L3)。所述3個重鏈(VH)中的任一個可以與所述3個輕鏈(VL)中的任一個配對以生成總計9個可能的hJAA-F11VH/VL組合變體。為了生成這些變體，單獨地進行BLAST檢索，以針對人類免疫球蛋白序列比較mJAA-F11(小鼠抗體)的VH和VL序列。使用Seaview序列比對程序，將前10個最同源的人類VH和VL序列與mJAA-F11的對應可變區進行比對。對于第一個變體H1和L1，框架區的氨基酸序列基于在前10個最同源的人類IgG可變序列中的各個位置處最經常看到的氨基酸進行選擇。對于變體H2和L2，框架區的氨基酸序列按如下進行選擇：如果在前10個人類序列的任一個中的氨基酸與小鼠免疫球蛋白中的對應氨基酸匹配，則選擇該氨基酸，在剩余位置中，選擇在人類序列中最經常看到的氨基酸。對于第三個變體H3和L3，框架區的氨基酸序列在各個CDR的任一側上含有3個小鼠氨基酸，而該序列的剩余部分由在前10個人類序列中最經常看到的氨基酸組成。還構建了嵌合JAA-F11，其由連接至人類恒定區的整個小鼠JAA-F11可變區構成。制備該嵌合體以驗證正確的小鼠可變區已被克隆和測序并且還在評價人源化JAA-F11抗體時用作陽性對照。預期該嵌合體保持與小鼠JAA-F11相同的結合特性，同時具有人類恒定區。hJAA-F11的模型的評估對最初提出的hJAA-F11構建體評估對結合位點的構象影響。三個重鏈變體(H1、H2、H3)在位置72處具有對于丙氨酸的精氨酸的替代，其可以潛在地引起與周圍氨基酸的嚴重空間相互作用。對于輕鏈變體(L1、L2、L3)，在位置51的亮氨酸被精氨酸替代，這可以導致與周圍氨基酸側鏈的空間位阻。該精氨酸殘基被移除并被原始小鼠JAA-F11框架殘基丙氨酸72(VH)和亮氨酸51(VL)替代，如圖1和2所示。小鼠JAA-F11重鏈和輕鏈可變氨基酸序列與hJAA-F11構建體之間的比對比較如圖1和2所示。當相比于其它H和L序列時，本領域技術人員還將識別在H2a、H3a、L2a和L3a中提供的氨基酸序列中的不同。hJAA-F11變體的免疫原性預測利用我們的人源化變體(CDR移植的)的T20評分預測的免疫原性被預測為極低(表1)。使用T20評分來測量單克隆抗體可變區序列的“人性”。這種評分系統由Gao等人開發[Monoclonalantibodyhumannessscoreanditsapplications.2013.BMCBiotechnology，13:55]，利用超過38,000個人類抗體序列的數據庫。在這種方法中，進行此數據庫的蛋白質BLAST并且試驗人源化Ab針對這些人類序列進行比較。將人源化抗體與前20個人類AbBLAST匹配進行比較并且對與這些序列的相似性進行評分。最高的可能評分為100(與人類最相似的)。當Gao等人在已在臨床上用于人類的超過90個抗體上測試此免疫原性評分方法，并且發現具有高于80的FR&CDR的T20評分的抗體不是免疫原性的，同時僅對于FR序列的T20評分(其高于85)不是免疫原性的時，證實了此方法有效。利用當前hJAA-F11變體的T20值，在患者中預期了極低的免疫原性。這證實該CDR-移植的抗體更加人性并且預期比嵌合體是更低免疫原性的，H1L1變體是CDR-移植的變體中最具人性的，并且所有hJAA-F11變體被預期具有低的免于原性。表1.hJAA-F11構建體的免疫原性的評估。*對于FR和CDR序列，評分>80在人類不是免疫原性的。**僅對于FR序列，評分>85在人類不是免疫原性的。人源化和嵌合JAA-F11變體的表達和生產將hJAA-F11與嵌合的VH和VL基因克隆入兩個不同的哺乳動物表達載體，其分別含有人IgG1重鏈恒定區(6307pAH)和人κ輕鏈恒定區(6714pAN)以生產含有完整IgG1和κ基因的質粒。正確的序列以及在6307pAH和6714pAN表達載體中的克隆VH和VL區各自的取向通過測序確認。在將兩個載體穩定共轉染入CHO-K1細胞之后，利用抗生素G418和嵌合或hJAA-F11的表達，基于新霉素抗性，選擇表達hJAA-F11或嵌合體的穩定克隆體。hJAA-F11候選物的篩選如利用已形成技術，使用用于抗-TF-Ag抗體的ELISA進行。來自對TF-Ag顯示最高反應性的各個人源化JAA-F11H/L組合變體和嵌合JAA-F11的共轉染的克隆體被選擇用于如本文所述的表征。人源化JAA-F11構建體和嵌合JAA-F11個體地通過蛋白A柱色譜從培養上清而被純化。已經生產了嵌合抗體以及H1L1、H2L2、H3L3和H2L3、H2aL3a和H3aL3a。在獲益于本公開內容下，技術人員可以容易地生產涵蓋在本發明中的剩余抗體H和L鏈組合。通過聚糖陣列的化學特異性分析在初始篩選之后，利用功能糖組學協會的聚糖陣列確定hJAA-F11和嵌合JAA-F11變體的化學特異性。將這些數據與對于小鼠JAA-F11獲得的數據進行比較。聚糖陣列分析是一種間接免疫熒光法以確定凝集素和抗體的聚糖結合反應性。利用早期聚糖陣列來證實小鼠JAA-F11的化學特異性。利用這種方法在610個不同聚糖下來分析抗體候選物的反應性。hJAA-F11、H1L1、H2L2、H3L3和嵌合抗體顯示與小鼠抗體相同的良好的結合特異性，包括與Galβ1-3GalNAc-α(TF-Ag)連接結構的結合的限制，以及與α2-3唾液酸化結構的結合的缺乏。聚糖陣列顯示在610個聚糖之中，人源化抗體、嵌合和小鼠JAA-F11僅結合TF-Ag和四個其它含有TF-Ag的糖結構。所測試的440或610糖之中，小鼠JAA-F11、嵌合和hJAA-F11構建體結合的四個另外的糖對于用JAA-F11的腫瘤靶向應該不是生物學有問題的。Neu5Acα2-6(Galβ1-3GalNAcβ、GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcβ和Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcβ未取代的僅在分泌流體、癌癥或其它疾病狀態中發現。Neu5Acβ2-6Galβ1-3GalNAc不是天然結構并且不在人類中。當相比于嵌合和小鼠抗體時，人源化JAA-F11構建體的特異性看起來相同或甚至提高。例如，H2L3顯示在任何添加至TF-Ag下的統計學(p<0.05，通過ANOVA)更少結合，并且H1L1和H2L2不允許二糖被添加至GalNAc的C-6羥基，且這與其它抗體是統計學不同的(p<0.05)。與陣列上超過600個負糖的結合的缺乏表明對于所有這些抗體的可能的靶向能力。不結合的密切相關糖類的重要實例是Galβ1-3GalNAc-β連接結構，表明所述抗體將結合至腫瘤組織并且不結合至中樞神經系統GM1神經節苷脂、NK細胞的無唾液酸-GM1、糖脂的GD1或至外周神經組織的無唾液酸GM1(這些是β-連接的)。熟知的TF-Ag在正常組織上的伸長通過β1-3N-乙酰基葡糖胺基-轉移酶在Gal上添加GlcNAcβ1-3形成GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα-Sp8，或通過2-3唾液酸轉移酶形成Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc(唾液酸-TF)或利用第二唾液酸轉移酶形成Neu5Ac2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAc(二唾液酸-TF)進行，所有這些不結合小鼠、嵌合或人源化JAA-F11。因此對于JAA-F11或hJAA-F11構建體，不預期正常組織結合。相對親和力分析四種hJAA-F11和嵌合抗體與TF-Ag的相對結合親和力通過比較小鼠抗體在酶免疫測定中與人源化抗體競爭的能力來確定。在此測定中，將3μg的各個人源化Ab與小鼠抗TF-Ag抗體(mJAA-F11)的系列稀釋液混合。人抗-TF-Ag與TF-Ag涂覆板的結合利用特異性抗-人IgG物種測量。將用來抑制1μg的hJAA-F11至50％所需的小鼠mJAA-F11的量外推并用作相對親和力的量度。用于抑制所需的小鼠抗體的量越高，抗體的相對親和力越高。結果概括在圖3以及表2和3中。表2顯示由不同抗體與1μg的此人源化抗體競爭所需的小鼠JAA-F11的半數最大抑制濃度(IC50)。H2L2顯示在抗體中對TF-Ag具有最高相對親和力，小鼠抗體的IC50為2.31μg。表7顯示針對彼此ANOVA–Tukey事后檢驗對于各個抗體計算的p-值。可以看出，當相比于hJAA-F11和嵌合抗體的每一個(除了H2L3，其中其達到顯著性(p＝0.057))，H2L2抗體的這種提高的親和力差異是統計學顯著性的(p<0.05)(表3)。H2L3與H1L1、H2L2、H3L3和嵌合抗體不是顯著性地不同的。H1L1、H3L3和嵌合抗體的相對親和力彼此不是顯著性不同的。表2.hJAA-F11和嵌合JAA-F11抗體對于TF-Ag的相對親和力a顯示三個獨立實驗的平均值±1SD。表3.對重復的IC50測定進行ANOVA分析以比較不同抗體的IC50之間的差異。P<0.05顯著性的(加陰影的).P-值(Tukey)H2L2H2L3H3L3H1L1H2L20.0570.0020.00H2L30.0570.3300.071H3L30.0020.330.908H1L10.000.0710.908嵌合體0.000.0930.9481.00hJAA-F11的生物反應性、特異性和活性的分析3hJAA-F11和嵌合JAA-F11抗體結合至人腫瘤細胞系。hJAA-F11和嵌合JAA-F11抗體與多種人乳腺腫瘤細胞系的結合利用全細胞ELISA評估。TF-Ag陽性小鼠哺乳動物腫瘤4T1細胞系用作陽性對照而P3-X63-Ag8骨髓瘤細胞系用作TF-Ag陰性對照。在不同的三天進行測定并利用對照細胞系一次一式四份地測定3至4中細胞系。如果由于hJAA-F11或嵌合JAA-F11(在50μg/mL)所致的相對結合顯著高于(p≤0.05)TF-Ag陰性對照骨髓瘤的相對結合，則認為該細胞系是陽性的。結果顯示在圖4中。測試的癌細胞系由乳腺癌的不同亞組(激素受體陽性或陰性、Her2-陽性或陰性和三陰性)組成。測試的雌激素受體(ER)和孕酮受體(PR)陽性細胞系是CAMA-1和HCC-1428。測試了兩個Her2/neu受體陽性細胞系HCC-1419和AU-565。測試的三陰性乳腺癌(TNBC)細胞系是HCC-70、MDA-MB-231、MDA-MB-468、DU-4475和BT-549。一個細胞系MDA-kb2表達雄激素受體但是雌激素受體陰性的。這些乳腺癌細胞系之前已使用小鼠JAA-F11考察并且全部對于TF-Ag表達是陽性的。在此公開內容中，結果顯示hJAA-F11和嵌合JAA-F11抗體結合至考察的全部10個乳腺癌細胞系，確認TF-Ag在這些細胞系上的表達。在不同乳腺癌亞組之中，目前還沒有用于治療TNBC患者的靶向療法。獲得的數據表明TF-Ag在靶向侵襲性TNBC的治療作用以及hJAA-F11抗體治療和增加乳腺癌患者的存活(而不管受體狀態)的用途。表4概述了乳腺癌的類型以及所測試的各個細胞系的TF-Ag的表達。表4.在全細胞ELISA中測試的乳腺癌細胞系的表格。表格顯示了激素受體、Her2/neu受體和TF-Ag的表達。三陰性(黑體)、ER/PR陽性(斜體)和HER2-陽性(黑體且斜體)。MDA-kb2*對于雌激素受體是陰性的但表達雄激素受體。細胞系雌激素受體孕酮受體Her2/neu受體TF-Ag表達HCC-70---+BT-549---+MDA-MB-231---+MDA-MB-468---+DU-4475---+CAMA-1++-+HCC-1428++-+HCC-1419--++AU565--++MDA-kb2*---+人源化JAA-F11在體外抑制癌細胞的增殖由于一些抗-TF-Ag抗體已顯示引起腫瘤細胞增殖，所以確定不同構建體對細胞增殖的影響很重要。選取測量代謝活性的MTT測定作為用于氚標記的胸腺嘧啶脫氧核苷直接增殖測定的代用品。相比于沒有抗體的對照，人源化、嵌合和小鼠JAA-F11抗體對癌細胞生長的影響通過已知的方法在4ug/ml的抗體得到確定。數據顯示在圖5中。嵌合抗體和人源化JAA-F11抗體(除了H3L3)引起了腫瘤細胞生長的小(～6-11％)但統計學顯著性抑制。沒有看到細胞增殖的增強。人源化JAA-F11誘導ADCC在以下改變下根據標準技術，基于乳酸脫氫酶(LDH)釋放測定，利用CytoTox96(非放射活性細胞毒性測定；Promega，Madison，WI)，在人乳腺腫瘤細胞系上進行抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。從EDTA抗-凝固全血分離新鮮人外周血單核細胞用于以效應器與靶標比率為100:1與人源化抗體和4T1小鼠乳腺癌細胞一起使用。利用LDH的釋放來定量細胞毒性。圖6A顯示在人乳腺癌細胞系BT549上比較的由小鼠、嵌合、H1L1和H3L3抗體促進的ADCC的量。實驗重復多于三次。在所有實驗中，H2L2和H3L3顯示比人細胞系中的嵌合或小鼠抗體顯著更大的(p<0.5)ADCC。超過20％的帶有TF-Ag的BT549和HCC70靶細胞由在200μg/mL的H2L2和H3L3抗體以100:1效應器對靶標(E:T)比率溶解。同樣，在小鼠4T1細胞系上的所有實驗中，盡管測試的所有抗體誘導小于10％的ADCC，但H3L3抗體顯示比嵌合或小鼠抗體顯著更大的(p<0.05)ADCC。這表明當前H2L2和H3L3抗體對于免疫治療是最佳選擇。相反，小鼠JAA-F11在任何試驗中都不顯示統計學顯著性的ADCC能力。來自三個單個PBMC供體的ADCC結果顯示在圖6B、6C和6D中。人源化JAA-F11不誘導CDC使用人乳腺癌細胞HCC-1428細胞作為靶細胞，通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放測定來確定hJAA-F11和嵌合抗體介導補體依賴性細胞毒性(CDC)的能力。提供有試劑盒的LDH陽性對照用作陽性對照并顯示溶解。小鼠JAA-F11、嵌合體、H1L1、H3L3、H2L3抗體不誘導補體依賴性細胞毒性，因為沒有發現溶解，如圖7中所示。人源化JAA-F11內化入癌細胞人源化和嵌合JAA-F11到4T1乳腺腫瘤細胞中的內化通過兩種方法確定，即利用在將細胞在4℃或37℃孵育之后測量和比較表面結合的酶免疫測定，和利用LAMP-1(溶酶體相關膜蛋白，一種溶酶體標記物)和用于核染色的DAPI染色的免疫熒光顯微鏡法。在酶免疫測定中，如圖8所示，小鼠、H2L2、嵌合體、H2L3和H1L1抗體顯著地內化，具有的p-值分別為0.001、0.002、0.001、0.002和0.014。然而，H3L3抗體沒有顯示顯著內化(p＝0.16)并且這是預期的，因為H3L3顯示比嵌合或小鼠JAA-F11顯著更大的(p<0.5)ADCC。在免疫熒光實驗中，與酶免疫測定一致，小鼠、嵌合、H2L2、H2L3抗體顯示內化并且與LAMP-1和H3L3的共定位顯示沒有內化的膜染色。此數據證實了利用表面酶免疫測定獲得的結果。將預期，顯示較高ADCC活性的抗體將顯示較低的內化，因為細胞表面上的抗體存在對于ADCC功能是需要的。內化測定已在hJAA-F11、嵌合體和mJAA-F11上進行。H3L3顯示與此預期的一致，具有低量的內化但相對高的ADCC。H1L1、H2L3、嵌合體和mJAA-F11都顯示統計學顯著性內化并且沒有良好進行ADCC。對于HEL2抗體觀察到未預期的結果，其類似于H3L3誘導高ADCC，但相比于嵌合體和其它人源化抗體顯示最高的內化百分比活性。免疫熒光內化實驗開始使用5μg/mL的抗體進行并使用在0.1μg/ml的抗體濃度重復，內化的抗體甚至在此低濃度如此做。以上數據表明，由于高百分比的內化，以及此內化的快速速率，所以嵌合體、H2L2和H2L3構建體具有被用作抗體-藥物綴合物的潛能。聚糖特異性、相對親和力/內化、ADCC和CDC數據概括在下表5中。表5.小鼠、人源化和嵌合JAA-F11的內化、ADCC和聚糖特異性的概括。MicroPET成像MicroPET成像在一只小鼠上系列地進行，各個小鼠注射有124碘-hJAA-F11H2L2抗體以及游離124碘。在24、48、72、96、168和192小時進行成像。圖9顯示在不同時間點注射有124碘-hJAA-F11H2L2抗體的小鼠的冠狀圖，而圖10是注射游離124碘的對照小鼠。放射標記的抗體由腫瘤的攝取在注射后24/48/72和96小時進行觀察。抗體的攝取還在48小時在脾臟中看到(圖9)。帶有4T1TF-Ag陽性腫瘤的陰性對照小鼠(其僅接受游離124碘)顯示，在整個研究中，除了定位至甲狀腺，沒有定位至任何器官或腫瘤(圖10)。完全鼠類JAA-F11對于乳腺癌患者中的被動體液免疫療法和藥物綴合物療法具有潛力。然而，由于在人中小鼠抗體的使用已顯示受人抗-鼠類抗體(HAMA)響應的形成和患者體內短暫半衰期的限制，所以人源化是期望的以降低小鼠JAA-F11抗體的免疫原性而且還允許其在循環中保持較長時間。從前述結果的描述將認識到，此公開內容尤其提供了一種用于小鼠JAA-F11mAb的人源化以及在小鼠、嵌合和人源化JAA-F11抗體之間的比較和對比的新方式。mJAA-F11部分地通過CDR移植人源化。如將有本領域技術人員認識到的，傳統上，通過CDR移植的人源化利用單個人抗體受體框架[Jones等人.Replacingthecomplementarity-determiningregionsinahumanantibodywiththosefromamouse.1986.Nature321：522–525]。因此，人框架序列選自現有人胚系基因。相反，在本公開內容中，使用三種新的且不同的方式來選擇人受體抗體框架，用于重鏈和輕鏈JAAF11可變區鏈，產生重鏈的三個變體(H1、H2、H3)和輕鏈的三個變體(L1、L2、L3)。如以上討論的，三個重鏈中的任一個(VH)可以與3個輕鏈中的任一個(VL)配對而生成總計9個可能的hJAA-F11VH/VL組合變體。還產生了具有完全小鼠可變區以及人IgG1和κ恒定區的嵌合JAA-F11，并用作對照。一個問題是在定義CDR和FR區中使用的方式是否將降低人源化抗體的免疫原性。使用由Gao等人開發[Monocolonalantibodyhumannessscoreanditsapplications.2013.BMCBiotechnology，13:55]且用已經在患者中應用的90個抗體的分析驗證的T20評分方法來預測人源化JAA-F11變體的免疫原性。人源化JAA-F11變體的T20評分全都高于(被提高)(>85)嵌合JAA-F11(<85)，表明重和輕可變鏈通過所有三種本發明方法的人源化生成將比嵌合變體更低免疫原性的hJAA-F11變體。我們人源化小鼠JAA-F11并且五個抗體已使用CHO-K1細胞生產，嵌合體和4個hJAA-F11構建體H1L1、H2L2、H3L3和H2L3。因此，在獲益于本公開內容下，技術人員可以制備任何可用的其它四種可能的VH和VL組合。通過CDR移植的抗體人源化可以引起親和力下降或者抗原結合的喪失，這可能是由于CDR構象和抗原結合位點受人源化抗體中的一些框架氨基酸殘基的變化負面影響所致。CDR由與框架區和其它CDR相互作用的殘基組成。除了CDR氨基酸與順序地附近的氨基酸的相互作用之外，可以直接或間接影響抗原結合的一些框架殘基包括Vernier區域殘基和在VL/VH界面處的殘基。Vernier區殘基是在CDR下方的β-片框架中的殘基，其提供用于環結構的構象的基礎。在輕鏈上的Vernier殘基在位置2、4、35、36、46、48、49、64、67、69和71處，而在重鏈上，它們被鑒別在位置2、27、28、29、30、47、48、49、67、69、71、73、78、93、94和103處。在VL/VH界面處的殘基已由Chothia和同事鑒別出來[ChothiaC等人，可變結構域的包裝。1989.J.Mol.Biol.186:651-63]，并且在輕鏈的位置34、36、38、44、46、87、89、91、96和98處，以及在重鏈的位置35、37、39、45、47、91、93、95、100-100K和103處。我們顯示了在本公開內容中使用的用于選擇人FR和CDR的方式相對于嵌合和小鼠JAA-F11，不會負面地改變人源化JAA-F11對于TF-Ag的親和力。當定義CDR時，已包括了結合位點的至內的殘基以確保對于TF-Ag的親和力和特異性被保持。這些殘基在重鏈上的位置H31、H32、H33、H35、H50、H52、H53、H54、H95、H96、H97、H98和H100處，以及在輕鏈上的位置L27d、L28、L30、L32、L34、L50、L89、L91、L92和L96處。然而，根據相對親和力研究，雖然所有的人源化抗體保持對于TF-Ag的親和力，但我們觀察到在抗體之間的親和力方面的差異。相對親和力研究揭示H2L2抗體是具有最高親和力的抗體，接著是H2L3抗體。在抗體之中，H2L2抗體對于TF-Ag具有最高相對親和力，需要超過2mg的小鼠抗體用于抑制1mg的H2L2抗體。H2L3抗體還具有比H1L1和嵌合抗體更高的親和力，盡管不是顯著性的，而H1L1、H3L3和嵌合抗體對于TF-Ag的相對親和力彼此之間不是顯著性不同的。這些在親和力方面的提高可以歸屬于不同人源化變體之間的一些殘基的變化。變體之間的差異在以下列于表6和6B中。表6A.重鏈可變H1、H2、H3和小鼠序列之間的差異。**指示Vernier區域位置。*指示此位置在我們修飾的CDR的4個氨基酸內。表6B.輕鏈可變L1、L2、L3和小鼠序列之間的差異位置L1L2L3小鼠1天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸谷氨酸2**纈氨酸纈氨酸纈氨酸亮氨酸7絲氨酸蘇氨酸絲氨酸蘇氨酸14蘇氨酸蘇氨酸蘇氨酸天冬酰胺17谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺天冬氨酸18脯氨酸脯氨酸脯氨酸谷氨酰胺36***苯丙氨酸苯丙氨酸酪氨酸酪氨酸37*谷氨酰胺谷氨酰胺亮氨酸亮氨酸39*精氨酸精氨酸精氨酸賴氨酸45精氨酸精氨酸精氨酸賴氨酸81谷氨酸谷氨酸谷氨酸天冬氨酸83纈氨酸纈氨酸纈氨酸亮氨酸**指示Vernier區域位置。*指示此位置在我們修飾的CDR的4個氨基酸內。如以上提及的，影響抗原結合的框架殘基包括Vernier區域和VL/VH界面殘基。當比較人源化構建體時，本公開內容的mAb保留大多數的Vernier區域和VL/VH界面殘基，其對于結合位點構象可能很重要，然而形成了一些變化以生成較低免疫原性的人源化變體而發生。改變的氨基酸在Vernier區域中或在VH/VL界面中，并且已對CDR的4個氨基酸(順序地)內的氨基酸形成變化，如通過星號指示的。在三個構建體之間不同的重鏈序列上有四個Vernier區域位置，即位置48、67、69和73。H2保留小鼠殘基但在八個位置5、11、69、73、75、82b、83和85處在H1和H3構建體之間不同。在這八個殘基中，兩個是Vernier區域殘基，在位置69和73處。同時，H2和H1在兩個Vernier區域位置處(即在殘基48和67處)具有替代，其在H3上保持為小鼠殘基。由于在H1L1和H3L3之間的親和力方面沒有差異，所以這表明在48和67處的Vernier區域位置會不可能對于親和力差異有貢獻，因為它們在H3中保持，但在H1中改變。然而，與H1和H3不同，H2保留在位置69和73處的小鼠Vernier區域殘基，表明在這兩個Vernier區域位置處的變化對親和力方面的差異有貢獻。相比于H1和H3，在CDR2下方的這兩個Vernier區域殘基可能具有增強的H2結合。在人源化構建體之間不同的氨基酸之中，位置69和108與結合位點最接近。在H2中的位置69的氨基酸(如同在小鼠抗體中)是亮氨酸，而其它人源化構建體二者都具有蛋氨酸。在H2和小鼠抗體之間的差異之中，在氨基酸38、48、66、67和109處的變化與CDR最接近并還可能影響親和力。由于H2L2具有比H2L3更高的親和力，所以L2和L3的比較可以進一步有助于描述對于此差異的原因。對于VL/VH殘基沒有變化并且在輕鏈上的大多數Vernier區域殘基在3個人源化構建體之間保持，除了Vernier位置2和36。與L3不同，但與小鼠抗體一樣，較高親和力L2在Vernier位置36具有苯丙氨酸而不是酪氨酸。在位置36和37處的氨基酸可以以有利方式影響構象，因為它們在結合位點的內，并且是位置24-35中的部分氨基酸，其被發現在GalNAc的還原端處的α連接需要的保持中很重要。許多正常組織具有與TF-Ag不相同但非常相似的結構如Galβ1-3GalNAc-β連接結構，其通常存在于中樞神經系統(在NK細胞上)和外周神經組織中，因此良好特異性的保持是在此人源化中的關鍵特征。相比于小鼠抗體，hJAA-F11H1L1、H2L2、H3L3和嵌合抗體保留相同或提高的抗原結合的良好特異性，包括與Galβ1-3GalNAc-α(TF-Ag)連接結構的結合的限制，以及基于聚糖陣列與α2-3唾液酸化結構的結合的缺乏。當針對超過600個不同糖進行測試時，人源化JAA-F11構建體的特異性看起來相同甚至提高。小鼠JAA-F11和所有人源化構建體僅與5個糖反應，即TF-Ag和3個具有連接至GlcNAc的一個額外的糖1-6(在2個中NeuAc，和在第三個中的GlcNAc)的三糖或與具有連接1-6至GlcNAc的2個額外的糖GalGlcNAc的糖反應。例如，當相比于嵌合和小鼠抗體時，H2L3顯示在所有4個結合至JAA-F11的其它糖上較少的結合，而H1L1和H2L2與結合至JAA-F11的四糖沒有結合。盡管這4個結合至JAA-F11的其它糖還不知曉在正常組織上被表達，但是對于靶標結構增加的特異性總是期望的。這證實在人治療中對于所有這些抗體的可能的靶向能力。由于相比于其它構建體，H2L3具有增加的結合特異性，如通過與所述4個糖中的3個的較少結合顯示的，所以H2和H3之間差異可能引起此差異。已經在親和力部分討論的變體之間的差異可能是對于此提高的特異性的原因。H2L3與H2L2的不同在于其與NeuAcalpha2-6(TF-Ag)和GlcNAcβ2-6(TF-Ag)降低的結合。在沒有意圖受理論限制的情況下，據信當相比于H3L3和小鼠抗體時，H1L1和H2L2根本不結合至四糖的原因可能不得不處理這些抗體之間的共有差異。H1和H2都具有在位置48處的蛋氨酸，其是Vernier區域位置并且順序地在CDR的4個氨基酸內。此蛋氨酸不是小鼠和H3抗體的異亮氨酸。在本公開內容中，全細胞EIA結果突顯了hJAA-F11和嵌合JAA-F11抗體結合三陰性乳腺癌細胞系的能力。獲得的數據表明TF-Ag在靶向所有乳腺癌而尤其是侵襲性三陰性乳腺癌(TNBC)中的潛在治療作用，因為在目前對于這些類型的癌癥還沒有靶向療法。結合TF-Ag的一些凝集素和抗體引起表達TF-Ag的腫瘤細胞的增加的增殖。這被認為通常與凝集素或抗體是否結合在還原端的α和β異頭物二者(增殖引起的)或僅α異頭物(抑制性的)。而小鼠JAA-F11僅結合α異頭物并且不會引起腫瘤細胞的增殖，確定人源化構建體是否對腫瘤細胞具有此作用很重要。人源化JAA-F11和嵌合抗體在體外不會引起癌細胞的增殖，相反，類似于小鼠JAA-F11的作用，觀察到小鼠4T1和人癌細胞生長的小(～6–11％)但顯著的抑制。由于ADCC是抗體消除腫瘤細胞的主要機制之一，并且對于抗體被用于癌癥治療是很重要的，所以考察了人源化JAA-F11變體誘導ADCC的能力。利用一些但不是全部的人源化構建體，觀察到了ADCC活性，并且在三個個體的PBMC下觀察到。H2L2和H3L3抗體二者誘導比小鼠4T1和人乳腺癌細胞系二者的嵌合或小鼠抗體顯著更大的ADCC，表明當前H2L2和H3L3抗體可以是用于直接被動免疫療法的優選選擇。小鼠JAA-F11在任一試驗中不顯示任何統計學顯著性ADCC能力。抗體用于殺死腫瘤細胞的另一種效應器功能是CDC。人源化、嵌合和小鼠JAA-F11抗體都不誘導CDC，但這種CDC活性的缺乏不排除其作為免疫治療劑的用途，事實上已發現Herceptin僅誘導微不足道量的CDC，并且這不是其作用模式中的一種。利用Rituxan的數據實際上顯示補體結合抑制NK細胞結合并降低功效。抗體可以潛在地用來以抗體-藥物綴合物的形式將藥物或毒素攜帶入細胞。因此，我們評估了人源化JAA-F11變體在結合至癌細胞上的TF-Ag后內化的能力。小鼠JAA-F11之前已顯示在1小時內內化。利用酶免疫測定，我們證實了小鼠、H2L2、嵌合、H2L3和H1L1抗體顯著地內化到小鼠4T1乳腺癌細胞中而H3L3抗體不顯示顯著內化。活細胞熒光顯微鏡法確認了從酶免疫測定獲得的結果。我們預期顯示較高ADCC活性的抗體將顯示較低的內化并且來自兩個內化測定的結果顯示與此預期一致，因為H3L3抗體表現出比小鼠或嵌合抗體更大的ADCC但不顯著內化。然而，H2L2，即使它在ADCC測定中良好進行，但內化好。這兩者如何可以在相同抗體下發生的機制還未被理解，但一種可能性在于在CHO細胞中不同生產速率可以導致不同的巖藻糖基化率，所以如果H2L2較低巖藻糖基化，則它可能在該時間期間在ADCC更好進行，其在細胞表面，即使它被內化。這些結果顯示嵌合、H2L2和H2L3構建體具有被用作抗體-藥物綴合物的潛力。小鼠124I-JAA-F11抗體已顯示在小鼠中定位至TF-Ag乳腺腫瘤。標記的JAA-F11抗體保持結合至4T1腫瘤持續至少20天和對于人三陰性乳腺腫瘤持續24天，暗示JAA-F11可以用來發現轉移和治療帶有TF-Ag的腫瘤。為了測試碘-124標記的人源化抗體是否將在小鼠中定位至人乳腺腫瘤，利用具有最高親和力的人源化抗體，H2L2變體(其內化和進行ADCC)。成像顯示優先腫瘤攝取，其中在甲狀腺和在脾臟中的攝取在后一個實驗中利用冷兔免疫球蛋白阻斷。MicroPET成像顯示放射標記的人源化抗體在24小時內被腫瘤吸收并且直至96小時可以看到。這樣的在患者中的放射定位可以用來發現轉移并且還用來在直接被動免疫療法或抗體-藥物綴合物療法之前確定在具體患者中是否存在任何脫靶結合。Thomsen-Friedenreich抗原(TF-Ag)存在于多于80％的若干人癌瘤(包括乳腺癌)。其在腫瘤粘附和轉移中具有功能作用，所以抗體靶向TF-Ag的能力表明作為免疫治療劑、作為用于殺死癌細胞和用于抑制轉移的抗體-藥物綴合物的可能用途。對于TF-Ag具有其獨特高特異性的JAA-F11抗體保持作為用于治療乳腺癌和其它癌癥的被動抗TF-Ag反應的巨大潛力。在我們的人源化方式中，我們保持了此獨特特異性并且已利用人源化JAA-F11變體可能使其增強。實施例2此實施例提供用來獲得本文中描述的結果的材料和方法的描述。JAA-F11CDR之前已被預測。我們進行了小鼠JAA-F11抗體的克隆和測序以確認重鏈和輕鏈可變區二者的氨基酸序列。為了在人中具有治療益處，抗體應保持其對于其靶抗原的特異性同時不產生抗-小鼠免疫反應。我們選擇了CDR移植方式以保留小鼠JAA-F11的CDR以便保持對于TF-Agα的特異性和親和力。使用Chothia和Kabat方法以及X射線晶體結構和計算碳水化合物線程來選擇CDR。為了選擇用于重鏈和輕鏈JAAF-11可變區鏈中的每一個的人受體抗體框架，針對整個非冗余人(智人)Genbank數據庫，在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE＝Proteins進行了蛋白(BLASTP)檢索，以鑒別與小鼠JAA-F11最同源的人抗體。將所有非智人蛋白序列、人源化抗體和噬菌體展示序列從BLASTP結果消除。所得的前十個與JAA-F11的重和輕可變鏈序列中的每一個最同源的序列被選擇作為用于人源化JAA-F11(hJAA-F11)的潛在人受體抗體框架。使用SeaView序列比對程序來比對所述十個潛在人受體可變重鏈或輕鏈框架序列與小鼠JAA-F11可變重鏈或輕鏈區序列。從所述10個最相似人免疫球蛋白序列的蛋白BLAST選擇構建三個重鏈(H1、H2和H3)和三個輕鏈(L1、L2和L3)可變區。然后將來自小鼠JAA-F11的最后CDR通過三種不同方法中的一種移植到人框架區上，生成3個不同重鏈和3個不同輕鏈。在第一種方法中，(a)重鏈H1和輕鏈L1FR序列設計成含有在前十個所選人FR序列之中的各個位點中的最經常出現的人氨基酸。在第二種方法中，(b)重鏈H2和輕鏈L2設計成含有在各個位點中在所述前十個所選人FR序列之中最經常出現的人氨基酸，除非氨基酸存在于在小鼠JAA-F11中看到的所匹配的前十個人FR的任一個中，然后將該氨基酸保持為與在小鼠JAA-F11中一樣。在第三中方法中，(c)在重鏈H3或輕鏈L3中，保持在小鼠JAA-F11的CDR1、CDR2和CD3之前和之后的三個FR殘基并且剩余的殘基是如在變體H1或L1中的在人序列中最經常出現看到的氨基酸。這些設計的重可變鏈中的任一個可以與類似地設計的輕可變鏈配對，例如H1/L1、H1/L2、H1L3、H2L1、H2L3等。還構建了嵌合JAA-F11，其中整個小鼠JAA-F11可變區連接至人IgG1恒定區。這是提供應具有小鼠抗體的原始特異性和親和力同時具有人恒定區的基線，以用作用于評價人源化變體的陽性對照。hJAA-F11的模型的評估評估多種hJAA-F11構建體的構象效應。簡言之，將提出的多種hJAA-F11構建體的重和輕可變鏈序列與JAA-F11序列進行比對。將對于可以潛在地引起與周圍氨基酸的嚴重空間相互作用的各個人源化變體的框架中的任何氨基酸殘基移除并用原始小鼠JAA-F11框架殘基替代。使用T20評分預測hJAA-F11變體的免疫原性盡管人源化和完全人抗體被認為是非免疫原性的并且對于人使用是安全的，但是完全人和人源化抗體的免疫原性已在患者中報道。為了確定所選擇的序列是否具有低免疫原性，通過T20評分方法進行免疫原性分析。利用超過38,000人抗體序列的數據庫，由Gao等人開發的T20評分分析儀計算單克隆抗體可變區序列的“人性”。在此方法中，進行蛋白BLAST檢索并且將試驗人源化Ab首先針對所有這些人序列進行比較。然后將人源化抗體與前20個人AbBLAST匹配進行比較并對與這些序列的相似性進行評分。對于人源化抗體的T20評分從前20個匹配人序列的百分比同一性的平均值獲得。最高的可能評分為100(與人最相同的)。作為用于此方法與患者中的免疫原性的關系的構思的證據，Gao等人利用T20評分比較了要么被批準用于臨床使用要么處于臨床開發(小鼠、嵌合(來自小鼠)、人源化(n＝22)和全人抗體序列)的多個階段的超過90個抗體的在患者體內的免疫原性結果，并且發現具有高于80的FR&CDR序列的T20評分的Ab不是免疫原性的，并且利用僅對于FR序列的T20評分，高于85的那些不是免疫原性的。對于人源化JAA-F11變體的T20評分使用在abanalyzer.lakepharma.com/的T20Cutoff人數據庫計算。密碼子優化和基因合成。在設計人源化JAA-F11VH和VL變體氨基酸序列之后，手動地選擇對應核苷酸序列用于灰倉鼠(Cricetulusgriseus)(CHO)細胞蛋白生產最佳的密碼子使用并且合成和插入pUC57質粒(一種常用克隆載體)。哺乳動物表達載體中的hJAA-F11和嵌合JAA-F11可變重鏈(VH)和輕鏈(VL)基因的亞克隆和測序。在人巨細胞病毒(CMV)啟動子和氨比西林(Amp)和組氨醇脫氫酶(hisD)盒的控制下，將hJAA-F11VH基因亞克隆和插入含有人IgG1重鏈引導子/恒定區的表達載體(pAH6307)。在人CMV啟動子和新霉素磷酸轉移酶(neoR)盒的控制下，將VL基因插入到含有人κ輕鏈引導子/恒定區的表達載體(pAN6714)。類似地，使嵌合JAA-F11VH和VL表達并且在隨后分析中用作陽性對照。人源化和嵌合JAA-F11變體的表達和生產。共轉染入CHO-K1細胞。將粘附性中華倉鼠卵巢(CHO-K1；ATCC#CCL-61，Manassas，VA)細胞培養18小時，然后在加濕空氣中在37℃和5％二氧化碳(CO2)在補充有10％胎牛血清(FCS；Hyclone)的Ham’sF12培養基(CorningCellgro，Manassas，VA)中轉染，并在50-80％融合率時收獲。將哺乳動物6307pAH(VH)和6714pAN(VL)表達載體通過電穿孔(GenePulserSystem(Bio-Rad，Hercules，CA)共轉染入CHO-K1細胞。簡言之，使用PvuI限制酶(Promega，Madison，WI)將各個質粒線性化并將5μg的各個質粒加入至在0.4cm電穿孔池(Bio-Rad，Hercules，CA)中500μL總體積的冷Ham’sF12培養基(CorningCellgro，Manassas，VA)中的5x106CHO-K1細胞。容納混合物的池在960μF和250mV電穿孔。然后轉染混合物用預溫熱非選擇性培養基(Ham’sF12，補充有10％FCS)稀釋至1x105個細胞/mL的濃度。然后將兩百微升以1x104個細胞/孔的密度鋪板到96-孔組織培養板(BDBioscience，SanJose，California)中。轉染的細胞在組織培養孵育器中在37℃和5％CO2孵育。在72小時，從96-孔組織培養板移除非選擇性培養基并用200μl的含有700μg/mlG418(Gibco，LifeTechologies，GrandIsland，NY)、5mM的組氨醇(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)和10mMofHEPES緩沖液(CorningCellgro，Manassas，VA)的Ham’sF12(加10％FCS)選擇性培養基替代，并且允許克隆體生長多至3周。用質粒6307pAH和6714pAN轉染的CHO-K1細胞將繼續生長，而未轉染的CHO-K1細胞將不生長。對于接下來的14至21天，每2-4天，替換所述選擇性培養基以除去死亡細胞的碎片并且允許抗性細胞的克隆體在選擇性培養基中生長。培養上清通過酶聯免疫測定(ELISA)的分析在選擇之后的14-21天之間，收集來自96-孔板的CHO-K1培養上清并通過酶聯免疫測定(ELISA)對抗體進行分析。簡言之，將100μL的培養上清加入至Immulon1B-介質結合96-孔微滴定板(ThermoScientific，Milford，MA)，該板已用在包被緩沖液(0.1MNa2CO3，在pH9.6)中的1.25μg/mL的TF-Ag-BSA綴合物包被并用TBS-brij(pH7.2)洗滌五次。還將在無菌PBS中的凈化的小鼠JAA-F11(1mg/mL)的1:500稀釋液加入到在各個板上的2-3個孔以用作陽性對照。在37℃的2小時孵育之后，將板洗滌五次并將在1％BSA-PBST緩沖液(1:10,000)中的100μL的抗-人IgG-堿性磷酸酶綴合物二抗(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)加入到用于轉染的細胞的各個孔中，而將在1％BSA-PBST緩沖液中的抗-小鼠IgG-堿性磷酸酶綴合物二抗(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)的1:1000稀釋液用于小鼠JAA-F11對照孔。在室溫孵育1小時之后，將板洗滌五次，然后將100μL的磷酸酶底物(磷酸對硝基苯酯(pNPP))(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)加入至各個孔。在室溫的一小時孵育之后，使用板讀數器在405nm對板進行讀數，以篩選對于TF-Ag的IgG抗體的存在。作為空白，在一抗孵育接著二抗孵育和底物孵育期間使用HAM’sF12(加10％FCS)培養基。穩定克隆體的傳代和生產在開始選擇后14-21天，對于抗-TF-Ag抗體的初始篩選之后，選擇具有最高吸光度讀數的10-12個克隆體并轉移到24-孔組織培養板中用于擴展。來自這些克隆體的培養上清然后通過ELISA分析。將給出最高吸光度讀數的4個克隆體轉移至T25組織培養瓶，擴展并通過ELISA再次對于抗-TF-Ag抗體進行篩選以確保這些克隆體仍然生產對于TF-Ag反應性的抗體。然后將這4個克隆體轉移至T75組織培養瓶、擴展、對于抗-TF-Ag抗體再篩選并將細胞儲存冷凍在液氮中。然后將具有最高抗-TF-Ag結果的克隆體進一步擴展并傳代2-3次以確保該細胞系是穩定的。來自以上獲得的最佳克隆體的用于各個hJAA-F11重鏈和輕鏈組合的穩定個體細胞克隆體通過有限稀釋的亞克隆而產生。簡言之，細胞在T75組織培養瓶中生長至匯合，收獲并計數并且以0.3個細胞/孔接種到在選擇性培養基中的96-孔板的各個孔中。7-10天后在顯微鏡下仔細檢查這些板并且標記顯示細胞的單個焦點的孔并進行監控直至看到足夠的生長密度。來自這些標記孔的上清通過ELISA測試抗-TF-Ag抗體。給出最高吸光度讀數的4個克隆體如上所述進行擴展以獲得親本克隆體。對給出最高吸光度的亞克隆體進行擴展并用于在T200NuncTM細胞培養Tripleflask(ThermoFisherScientific，Inc.)中生產上清。對于各個人源化變體JAA-F11在Tripleflask培養瓶中的生產，將細胞培養3周，之后收獲1升的培養上清。生產嵌合JAA-F11的克隆體如所述人源化JAA-F11變體的相同方式進行處理。人源化和嵌合JAA-F11變體的純化人源化和嵌合JAA-F11變體上清使用蛋白4B、快速流動親和柱(Sigma-Aldrich，StLouis，MO)純化。為了制備蛋白A柱，將在緩沖液A(0.02MNaH2PO4，0.15MNaCl，pH至8.0)中的樹脂的1:1懸浮液倒入柱中。裝好柱之后，將其用20柱體積(CV)的緩沖液A洗滌。將一升的CHO-K1細胞培養上清以3500rpm離心30分鐘從而清除死細胞或碎片，然后過濾。將過濾的上清上樣到ProteinA柱上并允許以1mL/min的流速通過重力滴落。然后該柱用10CV的緩沖液A洗滌。抗體使用3CV的緩沖液B(0.2MNa2HPO4，0.1M檸檬酸，pH3.9)從蛋白A柱洗脫。將洗出液用0.1MNaOH小心地中和以最小化低pH對抗體的影響。蛋白A柱用20-30CV的緩沖液A再平衡并在2-8℃儲存。各個柱對于同一抗體使用多達五次。如后續測定所需的，在有或沒有苯酚紅的情況下，針對1X磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或RPMI培養基，將純化的抗體在4℃透析過夜(Slide-A-LyzerDialysisCassette；ThermoScientific)。在透析之后，將抗體用0.22μm濾器(Corning)過濾并且蛋白濃度通過如以下詳述的Bio-Rad蛋白測定來確定。將抗體儲存在4℃并使用ELISA檢查與TF-Ag的結合。Bio-Rad蛋白測定抗體濃度使用Bio-Rad蛋白測定來確定，該Bio-Rad蛋白測定基于Bradford染料結合方法。簡言之，將染料試劑用蒸餾水以1:4比率稀釋并使用Whatman濾紙#1過濾。使用1XPBS緩沖液制備已知蛋白標準物(1.44mg/mLγ球蛋白，Bio-Rad，Hercules，CA)和人源化抗體樣品的系列稀釋液。將10μL的各個標準物和樣品溶液一式三份地置于微滴定板的孔中。然后將兩百微升的稀釋染料試劑使用多通道移液管加入至所有孔，并在沒有形成氣泡的情況下通過上下吸移充分混合。將該板在室溫孵育指示5分鐘至1小時。然后在板讀數器(Bio-TekInstruments)上在595nm讀出吸光度。人源化和嵌合JAA-F11抗體的化學特異性和親和力的分析化學特異性的確定多種hJAA-F11構建體和嵌合JAA-F11的化學特異性使用印刷聚糖陣列確定。將此與之前對于小鼠JAA-F11獲得的數據進行比較。所述聚糖陣列是一種間接免疫熒光方法，描述于功能糖組學協會(ConsortiumforFunctionalGlycomics)網站。分析各個構建體與610個不同聚糖的反應性。簡言之，將印刷陣列用抗體連續孵育，洗滌，并用FITC標記的二抗孵育。在洗滌之后，在PerkinElmerMicroscanarrayXL4000中讀出圖像并儲存tiff文件圖像并且使用ImageneV.6圖像分析軟件進行圖像分析。各個結合聚糖的相對結合被表示并歸一化至原始聚糖TF-Ag的結合。使用ANOVA進行相對結合能力的比較和統計學分析。相對親和力的確定hJAA-F11與TF-Ag的相對親和力結合使用與小鼠JAA-F11抗體和嵌合JAA-F11抗體的競爭性抑制ELISA進行分析。簡言之，在1.25ug/mLTF-Ag包埋的96-孔板(ThermoScientific，Milford，MA)上，將3μg/mLhJAA-F11或嵌合JAA-F11在不同濃度的小鼠JAA-F11(10、8、6、4、2ug/mL)存在下孵育。結合的抗體通過用抗-人IgG二抗和底物的孵育進行檢測并且吸光度讀數如在這些材料和方法中所述獲得。確定并比較抑制3μg/mL人源化或嵌合抗體的結合達50％所需的小鼠抗體的量。抑制所需的小鼠抗體的量越高，抗體的相對親和力越高。使用ANOVA來比較各個人源化抗體和嵌合抗體的相對親和力。hJAA-F11的生物效能的分析與人類乳腺腫瘤細胞系的結合的評估hJAA-F11與多種人類乳腺腫瘤細胞系的結合使用全細胞ELISA分析。帶有TF-Ag的小鼠乳房腫瘤4T1細胞系用作陽性對照，而作為用于生產JAAF11雜交瘤的融合伴侶的P3-X63-Ag8骨髓瘤(ATCC號：CRL-1580)細胞系用作TF-抗原陰性對照。通過使用學生T檢驗將各個抗體與各個細胞系的反應性與該抗體與骨髓瘤細胞的反應性進行比較來確定陽性結合。為了標準化數據，通過用骨髓瘤細胞的吸光度讀數除試驗細胞系的吸光度讀數來表示與各個細胞系的結合。細胞制備使用非酶細胞傾卸裝置(Mediatech，Inc.VA，USA)收獲4T1乳腺腫瘤和骨髓瘤細胞系。為了防止細胞成團，將培養基、緩沖液和試劑在使用之前預先溫熱。對于粘附性細胞，將培養基從培養皿移除并將細胞用沒有鈣和鎂的1XDulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)(MediatechInc.，Cellgro)漂洗。將五毫升的細胞裂解液加入至各個瓶，然后在37℃孵育10分鐘。從這些瓶汲取液體以去除細胞。對于非粘附性骨髓瘤細胞，也從這些瓶汲取液體并將培養上清以1000xG離心10min。將細胞團粒再懸浮在細胞裂解液中并在37℃孵育10min。在孵育之后，將20mL的1XDPBS加入至細胞中并反覆地吸移以除去團塊。然后將細胞懸浮液以1000xG離心10分鐘。將上清倒出并將團粒再懸浮在5mLDPBS中。細胞使用臺盼藍染色和血球計進行計數。將細胞稀釋以獲得1×106個存活細胞/ml。將兩百微升的細胞懸浮液(2×105個細胞)置于5ml聚苯乙烯四管中。將兩百微升的4％甲醛溶液加入至各個管并在室溫孵育20min，之后以1500xG離心10min。將上清一次性小心地倒出，細胞在DPBS中洗滌，接著離心和倒出。將兩百微升的PBS-吐溫1％BSA(w/v)加入至各個管并在4℃儲存過夜或直至兩周。在細胞上的酶免疫測定將兩百微升的50μg/mL的小鼠JAA-F11、hJAA-F11或嵌合JAA-F11抗體加入至容納以一式四份測試的不同細胞系的管并在37℃孵育兩小時。用200μL的1XPBS-0.1％吐溫20-1％BSA處理的一組管用作用于所測試的各個細胞系的陰性對照。將這些管用3mL的洗滌緩沖液(1XPBS吐溫，無疊氮化物)洗滌三次，然后以1500xG離心10分鐘。在各個清洗之間將上清小心地倒出。將兩百微升的在PBS-吐溫-1％BSA中的抗-小鼠IgG(γ-鏈-特異的)辣根過氧化物酶二抗(1:1000，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)或抗-人IgG(γ-鏈-特異的)辣根過氧化物酶二抗(1:2000，SigmaAldrich，St.Louis，MO)加入至相應管，然后在室溫(RT)孵育1小時。在孵育之后，傾倒管并洗滌三次，并在洗滌之間以1500xG離心。然后將兩百微升的鄰苯二胺二鹽酸鹽底物(OPD；Sigma，St.Louis，MO)溶液加入至各個管并在室溫孵育1小時。在孵育之后，通過加入100μL的終止液(1NH2SO4)使反應終止并以1500xG離心10分鐘。接下來，從各個管移出200μL的上清并轉移至微滴定板中相應孔。使用微板讀數器(MicroplateAutoreader，型號EL311，Bio-TekInstruments，Inc.)在490nm讀出吸光度并且未反應的OPD底物用作空白。對于不同的細胞系，各個相應平均空白(僅具有PBS-吐溫-1％BSA的管)從它們的相應平均OD扣除從而得到最終的光學讀數。各個實驗重復3次。hJAA-F11對于體外癌細胞增殖的影響為了考察人源化和嵌合JAA-F11抗體對癌細胞生長的影響，進行體外3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑(噻唑藍，MTT)增殖分析。將4T1小鼠乳腺腫瘤細胞和人乳腺腫瘤細胞在變化量的JAA-F11、人源化和嵌合JAA-F11(4、2和1μg/mL)存在下以10次重復地以1x104個細胞/孔接種到96-孔板中。當以此細胞密度鋪板時，細胞在它們在72小時的生長曲線的線性部分。在沒有抗體的培養基中生長的細胞用作正常生長對照。單獨的培養基用作空白。在37℃的細胞生長68小時之后，將10μL的四唑鹽MTT(5mg/ml)加入至各個孔，并將這些板返回至孵育器持續另外的4小時。在孵育結束時，在各個孔中所得的甲瓚產物通過添加120μL的二甲亞砜(DMSO，FisherScientific)溶解，然后在570nm測量各個孔的吸光度(MicroplateAutoreader，型號EL311，Bio-TekInstruments，Inc.)。抗體依賴性細胞毒性測定為了考察hJAA-F11抗體的效應器功能，進行抗體依賴性細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)分析。使用人外周血單核細胞(PBMC)作為效應器細胞和人乳腺腫瘤細胞系作為靶細胞，以效應器與靶(E:T)比率為100:1，通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放測定(CytoTox96非放射活性細胞毒性測定；Promega，Madison，WI)來確定ADCC。使用Ficoll-Paque，通過密度梯度離心，從全血制備PBMC。將在紫頂病EDTA真空抽血管(purple-topEDTAvacutainer)中收集的全血與等體積的預溫熱無菌DPBS混合。然后將二十毫升稀釋的血液輕輕地成層到在50mL圓錐管中的15mL的Ficoll-PaquePlus(GEHealthcare)。將樣品在室溫下不間斷地以1300rpm離心30-40min。接下來，收集PBMC層并將無菌的PBS加入至該PBMC至總體積為40mL。然后將該混合物在18°至22℃以1000rpm離心10min以除去任何污染Ficoll和血小板/血漿蛋白。拋棄上清，將細胞重新懸浮在新鮮的無菌PBS中，并且重復離心步驟。將細胞重新懸浮在RPMI1640培養基(10％FCS)中并使用血球計和臺盼藍計數。將靶細胞(1x104；30μl)和PBMC(1x106；30μl)加入到96-孔U形底板中并在組織培養孵育器中在37℃用hJAA-F11或嵌合抗體(200μg/mL；30μL)孵育17小時。在完成所述17小時孵育之前的四十五分鐘，將10μL的裂解液(x10)加入至容納靶細胞最大LDH釋放對照(靶細胞和培養基)和體積校正對照(僅培養基)的孔。在孵育結束時，將板以1000rpm離心4分鐘。然后將五十微升等分試樣從所有孔轉移至新的平底96-孔板。接下來，將50μL的重構底物混合物加入至這些孔的每一個。將板用金屬箔覆蓋并在室溫孵育30分鐘。反應利用向各個孔添加50μL的終止液而終止，并使用微板讀數器(MicroplateAutoreader，型號EL311，Bio-TekInstruments，Inc.)記錄在490nm的吸光度。細胞毒性利用以下公式計算：細胞毒性(％)＝100×[(E-SE)]/[(M-SE)]，其中對于各個條件，測量底物的吸光度。條件為如下；E是實驗孔，SE是在沒有抗體對照(用效應器細胞和PBS孵育的靶細胞)的情況下的自發釋放，M是通過用10X裂解液溶解的靶細胞確定的最大釋放。補體依賴性細胞毒性(CDC)測定使用HCC1428乳腺腫瘤細胞(CRL-2327，Manassas，VA)作為靶細胞種群，通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放測定(CytoTox96非放射性細胞毒性測定；Promega，Madison，WI)來確定CDC。以試劑盒提供的含有牛心臟LDH的LDH陽性樣品用作陽性對照。在比較兔、幼兔和豚鼠補體的細胞毒性的背景水平之后，將凍干的豚鼠血清(CL3112，CedarlaneLaboratories，Burlington，NC)用作補體的來源并根據制造商說明書重構。在測定中使用的最佳細胞濃度為1x104個細胞/50μL/孔。使用的抗體針對無苯酚紅的RPMI培養基透析。對于實驗孔，在圓底96-孔培養板中，在四個組中將50μl的HCC1428細胞懸浮液、20μl的補體稀釋液(以1:20的最終稀釋液)和30μL的抗體(最終濃度在100μg/ml)在各個孔中混合。包括了容納靶細胞和沒有抗體的補體的對照孔以控制由用作補體來源的血清介導的任何細胞毒性以及LDH的自發釋放。將板以1000rpm離心4分鐘，然后在37℃用5％二氧化碳孵育2小時。在完成所述2小時孵育之前的四十五分鐘，將10μL的裂解液(x10)加入至容納靶細胞最大LDH釋放對照和體積校正對照的孔。在孵育結束時，將板以1000rpm離心4分鐘。然后將五十微升等分試樣從所有孔轉移至新的平底96-孔板。接下來，將50μL的重構底物混合物加入至各個孔。將板用金屬箔覆蓋并在室溫孵育30分鐘。利用向每個孔添加50μl的終止液使反應終止，然后使用微板讀數器(MicroplateAutoreader，型號EL311，Bio-TekInstruments，Inc.)記錄在490nm的吸光度。細胞毒性利用以下公式計算：細胞毒性(％)＝100×[(E-SE)]/[(M–SE)]，其中對于各個條件，測量底物的吸光度。條件為如下；E是實驗孔的吸光度，SE是在有補體但沒有抗體(用補體和培養基孵育靶細胞)的情況下的自發釋放，并且M是用10X裂解液裂解的靶細胞的釋放。細胞內化測定人源化和嵌合JAA-F11到4T1乳腺腫瘤細胞中的內化通過兩種方法分析，即利用在2個孵育溫度4℃和37℃測量的表面結合的酶免疫測定和免疫熒光顯微鏡法。內化的酶免疫測定法測試小鼠4T1乳腺癌細胞系對于JAA-F11、hJAA-F11或嵌合JAA-F11的內化。將五十萬(5x105)個細胞接種到6-孔板的全部六個孔中并生長至匯合。對于所測試的各個抗體，準備兩個板。從各個板移除培養基并將1mL的抗體(200μg/mL)加入至各個板的3個孔，并將1mL的PBS稀釋液加入至剩余的3個孔。將一組板在37℃孵育以允許內化并且另一個板在4℃孵育。在1小時孵育之后，移除培養基并將這些孔用1mL的無苯酚紅的RPMI培養基洗滌4次。接下來，將1mL的2％低聚甲醛加入至各個孔并將這些板在室溫孵育20分鐘以固定細胞。然后這些板用無苯酚紅的RPMI培養基洗滌4次。接下來，加入1mL在1％BSA/PBS中的抗-小鼠或抗-人類IgG(γ-鏈-特異的)堿性磷酸酶二抗(1:5000，Sigma，St.Louis，MO)并將板在37℃孵育1小時。然后將板無苯酚紅的RPMI培養基洗滌4次并加入1mL的磷酸對硝基苯酯底物(pNPP)并在黑暗中孵育1小時。在1小時孵育之后，將來自各個孔的200μL轉移至96-孔板的相應孔并使用微板讀數器(MicroplateAutoreader，型號EL311，Bio-TekInstruments，Inc.)在405nm記錄吸光度。未反應的底物用作空白。對一式三份的孔求平均值，并將單獨培養基空白的平均光密度從含有抗體的孔減去。百分比內化使用以下公式計算：％內化＝100*[1-(37℃樣品-37℃空白)/(4℃樣品-4℃空白)]免疫熒光顯微鏡法在此方法中，在10％FCSRPMI1640培養基中，以3x105個細胞的密度，在兩個6-孔組織培養板的孔中，將4T1乳腺癌細胞接種到蓋玻片上，并在37℃和5％CO2培養24小時。從板移除培養基并將1.5mL的在無血清的RPMI1640培養基中稀釋的試驗抗體(5μg/mL)加入至相應孔。將兩個板在4℃放置20分鐘以允許用于抗體的表面結合。在20分鐘孵育之后，將蓋玻片從所述板中的一個轉移到一個新的6-孔板中。從第二個板移出抗體稀釋液并加入預溫熱的無血清RPMI1640培養基并將該板在組織培養孵育器中在37℃孵育1小時。將來自第一板的蓋玻片用冰冷5％BSA/PBS洗滌兩次，用1XPBS漂洗一次，然后用4％低聚甲醛溶液(Affymetrix)在室溫固定15min。在37℃孵育1小時之后，將來自第二板的蓋玻片轉移至一個新的6-孔板，洗滌，漂洗和固定。在1XPBS中三次洗滌之后，將兩個板中的細胞用在PBS中的0.1％TritonX-100、0.1％脫氧膽酸鈉在室溫滲透10min。接下來，細胞用1XPBS漂洗三次，然后在室溫在5％BSA/PBS孵育30分鐘。然后在室溫，蓋玻片用以在5％BSA/PBS中的1μg/mL的稀釋液的兔抗-溶酶體膜蛋白1(LAMP1；Abcam，24170)抗體孵育1小時。然后蓋玻片用1XPBS漂洗三次并用在5％BSA/PBS中以1:500的稀釋的抗-小鼠IgG-Alexa647和抗-兔IgGAlexa488(小鼠JAA-F11蓋玻片)以及抗-人IgG-Alexa647和抗-兔IgGAlexa488(嵌合和hJAA-F11)二抗(MolecularProbes，Invitrogen)孵育。使用抗-兔IgGAlexa488二抗以檢測抗-LAMP1抗體。將蓋玻片在黑暗中在室溫孵育1小時。在孵育后，將細胞在黑暗中用1XPBS漂洗三次。將蓋玻片在細胞面朝下地放置在顯微鏡載玻片上的具有DAPI培養基的SlowfadeGold試劑(MolecularProbes，LifeTechnologies)上，并用指甲油密封。細胞用AxioImager熒光顯微鏡(Zeiss)分析。捕獲圖像并利用AxioVisionRelease4.8.2軟件分析。用來測試人源化JAA-F11檢測帶有TF-Ag的乳腺腫瘤的功效的體內研究利用從上述體外生物學研究獲得的H2L2人源化JAA-F11抗體，在小鼠中進行免疫定位研究以測試碘-124標記的人源化抗體是否將定位至小鼠中的TF-Ag乳腺腫瘤。hJAA-F11(H2L2)抗體的[124]碘標記人源化JAA-F11抗體的[124]碘標記使用BoltonHunter方法進行。在碘化之前，將人源化抗體首先使用水溶性BoltonHunter試劑(Sulfo-SHPP)(ThermoScientific，RockfordIL，USA)修飾。簡言之，將1.9mg的hJAA-F11抗體溶解于修飾緩沖液(200mM硼酸鹽緩沖液，pH9.0)。將5mg的水溶性BoltonHunter試劑在使用前立即溶解于1mL修飾緩沖液。然后將100μL的水溶性BoltonHunter試劑溶液加入至抗體樣品并在定期混合下在冰上孵育3小時。未反應的水溶性BoltonHunter試劑通過針對磷酸鹽緩沖鹽水(PBS：0.1M磷酸鈉，150mM氯化鈉)透析而除去。在此中間步驟，人源化抗體含有連接至該抗體的一些賴氨酸的連接基團，并且其穩定達2周。然后將修飾的hJAA-F11抗體使用Chizzonite間接標記法[158]進行標記。簡言之，將Pierce預包埋的碘化管(ThermoFisher，Rockford，IL，USA)用1mL的高Tris碘化緩沖液(0.125MTris-HCl，pH6.8，0.15MNaCl)預潤濕。將緩沖液倒出然后將100μL的高Tris碘化緩沖液直接加入至該管的底部，隨后加入280μL的(4.59milliCurie)在0.02MNaOH溶液中的124I碘化鈉(IBAMolecular，Richmond，VA)。使用放射性同位素校準器CRC12(Capintec)得到初始計數。測量混合物的pH以確保其處于pH7中性。在室溫的6分鐘活化之后，將活化的碘化物加入至之前修飾的huJAA-F11溶液。在9分鐘孵育期之后，加入50μL的清除緩沖液(在Tris碘化緩沖液中的10mg酪氨酸/mL；25mMTris，pH7.5，0.4MNaCl)并將混合物孵育5分鐘。清除緩沖液的目的是除去與緩沖液中的酪氨酸反應的游離碘。然后，將1mL的Tris/NaCl/EDTA緩沖液(25mMTris-HCl，pH7.5，0.4MNaCl，5mMEDTA，0.05％疊氮化鈉)加入至反應混合物。然后將樣品加入至已用Tris/NaCl/EDTA緩沖液預先平衡的10mL脫鹽柱。樣品管用0.5mLTris/NaCl/EDTA緩沖液洗滌并將洗液加入至柱。樣品以500μL的十五個餾分洗脫，各自使用Tris/NaCl/EDTA緩沖液，并對放射活性進行測試。放射標記有效性在具有最高活性的餾分上通過高效液相色譜(HPLC)確定。將放射標記的抗體在標記的2小時內注入動物。為了確保標記的人源化JAA-F11保持其TF-Ag反應性，還進行放射免疫測定。動物和腫瘤模型這個研究中的動物依照實驗動物護理和使用委員會(IACUC)條例安置和利用。所有方案由布法羅大學的IACUC批準。通過在右乳頭之一下方皮下地注入在0.1mLD-PBS中的5x104個細胞，將4T1小鼠乳腺癌細胞移植到7-8周齡雌性Balb/C小鼠中。將小鼠分成2個組并在腫瘤移植后10-14天通過尾靜脈注射[124I]-hJAA-F11(n＝13)和游離124124(n＝7)，然后經過生物分布研究和顯微-PET成像。對來自2個組的每一個的一只小鼠成像并在整個研究中跟蹤。在注射標記的抗體后所有小鼠接受0.2g/L碘化鉀水溶液并在整個研究中作為甲狀腺阻斷方案。生物分布研究通過在注射放射標記的抗體后72、96、168和192小時腹膜內地注射0.1mL戊巴比妥鈉(FatalPlus)處死小鼠。在各個時間點，處死接受標記的抗體的三只小鼠和具有游離碘的兩只小鼠。收獲血液、肌肉、脾臟、肺、腎、心臟、肝、小腸和大腸、胃、腦、皮膚、腫瘤組織、骨、尾、食管、甲狀腺和卵巢，并放入到預稱重的5ml聚丙烯管中。將這些管再稱重以獲得各個組織/器官的實際重量。將所有管加蓋并使用γ計數器測量放射活性。對于各個組織的放射性攝取根據如在附件2中的以下公式計算為注射劑量/克組織(％ID/g)：Micro-PET成像在使用已知的技術注射之后24、48、72、96、168和192小時，標記的抗體在一只小鼠(各自來自兩個組)中的定位使用microPET照相機Focus(SiemensConcordeMicrosystems)通過microPET成像確定。簡言之，在掃描之前，將小鼠用O2/異氟醚(1％-3％異氟醚)麻醉，然后在microPET掃描儀的臺架中以臥姿成像。將發射掃描窗口設置在350至750keV之間。對于每只小鼠進行30分鐘的掃描。放射免疫測定為了確定放射標記抗體的免疫反應性，進行放射免疫測定(RIA)。將微滴定板用在包埋緩沖液中的100μL的1.25μg/mLTF-Ag-BSA綴合物包埋。將緩沖液從孔移除并用1％BSA/PBS-吐溫洗滌。將一百微升的放射標記的hJAA-F11在1％BSA/PBS-吐溫中的系列稀釋液加入至孔并允許在室溫結合1小時。在孵育之后，使用多通道移液管，通過手動地用1％BSA/PBS-吐溫將孔洗滌三次而移除未結合的抗體。通過在室溫用200μL的1M乙酸/0.15MNaCl緩沖液(pH2.4)孵育30分鐘而從板除去結合的hJAA-F11。在孵育之后，將來自各個孔的100μL溶液加入到單獨的聚丙烯試管中并使用γ計數器測量放射活性。盡管本發明已通過具體實施方案進行了描述，但是對于本領域技術人員來說常規改變將是明顯的并且這樣的改變也預計在本發明的范圍內。當前第1頁1 2 3