本發明涉及一種熱凝膠組合物。該組合物尤其適用于注射至人類或動物中，更尤其是注射到人類中。本發明還涉及治療性預防方法或治療方法，并且涉及美容美體護理(estheticalcare)方法，尤其包括注射本發明的熱凝膠組合物。
背景技術：
：相當眾所周知的是，基于生物聚合物(例如透明質酸)的組合物由于其粘彈性特性而被注射用于例如治療性治療。該類型的組合物特別用于治療尤其由于關節病所帶來的關節疼痛。還已知的是，這些組合物用于實現組織(諸如真皮)的填充。該填充可出于美容美體目的或屬于修復手術治療的范疇。還已知的是，基于殼聚糖(作為生物聚合物)的組合物用于組織修復，尤其是用于修復混合有血液的軟骨的缺損。還已知的是，制備和應用聯合有在生理溫度下引起溶液溶膠-凝膠轉變的試劑的基于殼聚糖的溶液，用于注射至組織和接合處。這樣的組合物可用在例如組織內注射(例如皮下注射、皮內注射)，關節內注射或眼內注射中。通過注射粘性流體其可用于保護或修復呈現出關節病跡象或軟骨損傷的接合處。其可進一步用于填充組織或器官以促進其修復或用增加其體積。為了提供這樣的組合物，通常所產生的技術問題是能夠提供物化性質與組織或注射區域流體的物化性質相近的組合物。然而，由于當該粘性流體的物化性質與所需的物化性質(例如，粘度方面)相近時，這些組合物非常難以注射，或甚至不能注射，這便產生了注射這種粘性流體的問題。在現有的解決方案中，尤其可提及的是美國專利US6344488，其教導了包括殼聚糖的熱凝膠組合物的制備。該組合物也對pH高度敏感，并且根據pH的值可具有溶膠-凝膠轉變的可逆性或不具有該轉變的可逆性。由于溶膠-凝膠轉變的可逆性使得能夠通過升高溫度來進行滅菌，所以是重要的。該組合物還包括相當高濃度的甘油磷酸鹽。然而，應當注意的是，根據該專利的表2，濃度低于1.5％(質量/體積)的殼聚糖在37℃下并不能凝膠化。這是目前不發燒人的平均體溫。所使用的組合物具有2％(m/v)的濃度。有利的是，提供包括更低濃度殼聚糖的組合物。在該專利中所述的組合物具有至高7.05的pH。因此，有利的是，提供pH接近生理pH且包括殼聚糖的組合物來用于目標應用。此外，該專利中所述的熱凝膠似乎不能用蒸汽進行滅菌。因此這是一個主要的缺點。因此，需要提供一種熱凝膠組合物，所述熱凝膠組合物在人類的生理溫度下凝膠化，具有用于治療性應用或美容美體應用的良好粘彈性質。此外，凝膠的組合物，尤其是水凝膠的組合物，無論熱凝膠化與否，可能均不具有小于750mosmol/kg的滲透度。技術實現要素：本發明的目的是解決這些技術問題。本發明的目的特別是提供一種熱凝膠組合物，所述熱凝膠組合物易于注射，同時能夠在人類的生理溫度下凝膠化。這種組合物應當具有尤其在人體或動物體的生理溫度下，例如37℃下在植入后使用來用于治療性應用或美容美體應用的良好的物化性質。更具體地，這種組合物應當能夠具有可根據目標應用進行調節的物化性質，從而盡可能地接近目標治療性目的或美容美體目的所需的性質。本發明的目的還在于提供一種熱凝膠組合物，所述熱凝膠組合物的pH對于目標治療性應用或美容美體應用是可接受的。更具體地，這種組合物應當能夠具有可根據目標應用調節的pH，尤其從而能夠盡可能地接近生理pH。本發明的目的還在于提供一種熱凝膠組合物，所述熱凝膠組合物的滲透度(osmolality)是受控的，例如與用于目標治療性應用或美容美體應用的生理滲透度相近，所述熱凝膠聚合物具有尤其是范圍在100mosm/kg至700mosm/kg之間，且尤其是200mosm/kg至500mosm/kg(還被寫作“mosmol/kg”)之間的滲透度。本發明的目的還在于提供一種組合物，所述組合物的溶膠-凝膠轉變是可逆的，尤其為了在儲存和/或運輸條件下并不需要嚴格控制溫度，和/或為了使所述組合物可通過升高溫度來進行滅菌。本發明的目的還在于提供一種組合物，在所述組合物中，凝膠的內聚力有助于儲存和/或運輸而無需嚴格控制溫度，和/或所述組合物可通過升高溫度來進行滅菌。根據替代方式，本發明的目的還在于提供一種組合物，在所述組合物中，生物聚合物、并且更具體的殼聚糖的含量較低。該含量基于所述組合物的總質量，以殼聚糖的質量計，應當小于5％，優選小于2％。本發明的目的進一步在于提供一種組合物，所述組合物可用作粘彈性補充劑，并且尤其能夠被注射至滑液，或者與滑液混合。本發明的目的尤其在于提供一種重建的滑液，即，使接合處的性質恢復的組合物，尤其通過使該組合物具有在運動期間吸收沖擊的能力且至少在靜止時潤滑的能力。本發明的目的進一步在于提供一種組合物，所述組合物在與滑液的混合液中，且尤其在與人類的滑液的混合液中具有良好的性質。有利地，本發明的目的在于提供一種組合物，所述組合物在炎性環境下尤其對靜止時彈性模量G’和粘性的保持方面具有良好耐降解性。令人驚喜的是，本發明能夠解決上述提及的一個或若干個問題。令人驚喜的是，發現當組合物包括殼聚糖時可制備這種熱凝膠組合物，其中，所述殼聚糖具有N-乙酰基葡萄糖胺單元、葡萄糖胺單元、以及不是N-乙?；咸烟前穯卧娜〈钠咸烟前穯卧匀〈哪枖迪鄬τ谌繂卧哪枖祦肀硎?，所述取代的殼聚糖優選地具有范圍在10％至50％之間的葡萄糖胺單元的取代度。根據具體實施方式，所述葡萄糖胺單元為D-葡萄糖胺單元(D-葡萄糖胺單元、取代的D-葡萄糖胺單元、N-乙?；?D-葡萄糖胺單元以及可選地取代的N-乙?；?D-葡萄糖胺單元)。根據替代方式，所述殼聚糖具有N-乙?；?D-葡萄糖胺單元、D-葡萄糖胺單元，以及不是N-乙?；?D-葡萄糖胺單元的D-葡萄糖胺單元，以及可選地取代的N-乙?；?D-葡萄糖胺單元?！安皇荖-乙?；?D-葡萄糖胺單元的取代的D-葡萄糖胺單元”是指在取代后該取代的D-葡萄糖胺單元并不形成N-乙?；?D-葡萄糖胺單元。根據替代方式，取代的殼聚糖僅具有D-葡萄糖胺單元的取代。根據另一替代方式，取代的殼聚糖同時具有D-葡萄糖胺和N-乙?；?D-葡萄糖胺單元的取代，并且其中，根據替代方式，所述取代基團僅共價結合至殼聚糖的氨基，或者根據另一替代方式，所述取代基團同時共價結合至殼聚糖的氨基和羥基。根據實施方式，以D-葡萄糖胺單元的摩爾數相對于取代的殼聚糖的全部單元的摩爾數(取代的或未取代的D-葡萄糖胺和取代的或未取代的N-乙酰基-D-葡萄糖胺單元)來表示，D-葡萄糖胺單元的取代度范圍在0.1％至0.5％。根據特定替代方式，發現，可選地在凝膠劑的存在下，例如多元醇或糖鹽，并且更具體地甘油磷酸鹽的存在下，以葡萄糖胺單元(在該葡萄糖胺單元上，取代基團通過共價鍵連接)的摩爾數相對于取代的殼聚糖的葡萄糖胺和N-乙酰基-葡萄糖胺單元的總摩爾數表示的葡萄糖胺單元的取代度在0.1至0.5范圍時能夠有利地使取代的殼聚糖在尤其適用于目標應用的pH和溫度的范圍下溶解。更簡單地，可通過起始試劑相對于殼聚糖的摩爾比或質量比來表示取代度，下文將對此進行闡述。根據替代方式，取代的殼聚糖由于其取代度而在例如用磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖至pH7的水溶液中是可溶的，該溶液包括相對于總溶液質量的1質量％取代的殼聚糖濃度，且pH在8℃下測量。根據替代方式，尤其當取代的殼聚糖具有兩性性質時，存在取代的殼聚糖不溶的窄pH范圍。根據現有技術，通過加入凝膠劑，例如多元醇或糖鹽，更具體地甘油磷酸鹽來避免這種特殊情況，從而取代的殼聚糖在本發明所關注的相關pH下是可溶的。通過取代殼聚糖，能夠制備溶解于pH在寬范圍內變化的水性溶液中的取代的殼聚糖的溶液，而未取代的殼聚糖僅在低于5.5至6.5的pH下可溶。取代的殼聚糖的水性溶液可通常具有范圍在6.5至8.5之間的pH。根據本發明，該溶液是可凝膠化的。因此，溶膠-凝膠轉變或凝膠化可在中性pH或在生理pH，諸如介于7和8.5之間的pH下實現，而殼聚糖在pH7下是不溶的，氨基的pKa為約5.5(并且因此氨基在pH7下不能質子化，從而不帶電荷)。因此，在改變殼聚糖的溶解曲線的取代基的存在下，取代的殼聚糖具有在不同pH下溶解的能力。令人驚喜地，能夠制備這樣的熱凝膠組合物：該熱凝膠組合物具有取代的殼聚糖，并且尤其具有低濃度殼聚糖，尤其具有非常低濃度、低或平均分子量的殼聚糖，同時具有可逆的溶膠-凝膠轉變。這種包括取代的殼聚糖的組合物當溫度升高時具有溶膠-凝膠轉變。因此，可根據取代度以非常有利的方式調控溶膠-凝膠轉變，即，從流體狀態的溶液轉變為凝膠狀態，從而尤其在所需的pH、滲透度和溫度的條件下發生溶膠-凝膠轉變。因此，根據替代方式，本發明有利地能夠在低于使用溫度下，尤其在低于生理溫度(例如37℃)的溫度下，制備流體熱凝膠組合物，而該熱凝膠組合物在使用溫度，通常在生理溫度(例如37℃)下，在中性pH(pH7)或在生理pH，并且例如pH7至8.5下為凝膠，且具有用于預計應用的合適的滲透度。這例如為生理滲透度。根據另一替代方式，本發明涉及一種熱凝膠組合物，所述熱凝膠組合物在使用前，通常在室溫條件下，并且例如在儲存溫度(例如4℃至8℃)下為凝膠，并且在使用溫度下，通常在生理溫度(例如37℃)下，在中性pH(pH7)或在生理pH，并且例如pH7至8.5下，具有用于預計應用的滲透度。這例如為生理滲透度?！盁崮z組合物”或“熱凝膠”是指這樣的流體，尤其是這樣的溶液：通過溫度的變化，尤其是通過升高溫度，并且進一步優選地通過將溫度升高至人體或動物體的生理溫度，而具有進行溶膠-凝膠轉變的性質，從而在注射或植入后在生理溫度下呈現為凝膠。本發明的熱凝膠組合物可呈現為水凝膠，即，水性凝膠。根據本發明，“凝膠”是指這樣的組合物：該組合物在其自身重量下不流動，并且更具體地在沒有將容納有該組合物的容器上下倒置例如30秒的外部刺激的情況下，也不顯示出任何的流動，并且特征在于彈性模量G’大于損耗模量G”，上述模量使用具有“庫愛特(Couette)”幾何結構的流變儀或具有平面幾何結構的流變儀在低振幅振蕩模式掃描下(例如，“DiscoveryHybridDHR-2”流變儀，TA儀器)通過流變學進行測量。凝膠的模量G’和模量G”之間的差別是凝膠的內聚力特性。根據本發明，“流體”是指這樣的組合物：在容納有該組合物的容器上下倒置例如30秒時，其在自身重量下能夠流動，并且特征在于彈性模量G’小于損耗模量G”，上述模量使用具有庫愛特剪切(在兩個同軸圓筒之間進行流體的剪切)的旋轉流變儀通過流變學進行測量。有利地，據發現，D-葡萄糖胺單元的取代度提供了調控溶膠-凝膠轉變的可能性。因此，本發明有利地給出了提供這樣的熱凝膠組合物的可能性：在所述熱凝膠組合物中，選擇殼聚糖的最小取代度使得取代的殼聚糖在所述熱凝膠組合物中是可溶的。還能檢測在不同緩沖液中的溶解度?！霸谒锌扇堋笔侵溉〈臍ぞ厶遣痪哂腥庋劭梢姷娜魏螡岫取８貏e地，通過紫外可見光譜儀在600nm波長下對包括水(可選地用相關pH的緩沖液進行緩沖，例如0.5M的乙酸鈉)的樣品進行測量，參比僅包括測量樣品所使用的水性溶劑而不存在取代的殼聚糖的參比池，能夠證實不存在濁度，光密度小于0.5且優選小于0.2。當殼聚糖未被充分取代時，組合物在室溫下在令人滿意的pH范圍內，例如pH＝7至pH＝8.5的范圍內是不溶的，并且因此也不能在溫度升高時發生熱凝膠化。本發明給出了提供這樣的熱凝膠組合物的可能性：在所述熱凝膠組合物中，選擇殼聚糖的最大取代度，從而使得在低于使用溫度，優選低于生理溫度，例如低于37℃的溫度下進行溶膠-凝膠轉變。根據本發明所限定的方法，通過模量G’和模量G”的交叉(crossover)來確定溶膠-凝膠轉變。有利地，通過磁共振光譜儀，例如頻率400MHz的布魯克(Bruker)光譜儀，通過在水性介質中的溶液中的質子的核磁共振光譜(NMR)來確定取代度。通過以下方式來制備樣品：將5mg至6mg的取代的殼聚糖溶解在1ml的氘化水中。將2μl濃度為12M的氘化鹽酸加入到取代的殼聚糖的溶液中以得到用于分析的合適的pH范圍。合適的pH范圍取決于取代基的性質。在70℃的溫度下，掃描次數在64至256范圍內以及弛豫時間為1至8秒下記錄光譜。所得到的光譜通過解卷積來處理以確定興趣信號的面積的積分值，從而能夠計算取代的殼聚糖的取代度。由于制備樣品的方法、記錄NMR光譜的條件以及用于計算取代度的公式取決于取代基的性質和位置，所以上述方法、條件和公式應當適用于每種類型的取代的殼聚糖。以下給出了對于取代有結合至D-葡萄糖胺單元的氨基的琥珀酰基的殼聚糖(殼聚糖琥珀酰胺，式1)的情況下，計算取代度(DS)的實例。縮寫如下：IH2等于D-葡萄糖胺單元2位上的質子信號的面積的積分；ICH2琥珀?；扔诮Y合至D-葡萄糖胺單元的琥珀酰基取代基的兩個-CH2基團的質子信號的面積的積分(在氨基官能團的α位和β位的碳原子上)；ICH3乙酰基等于N-乙?；?D-葡萄糖胺單元的乙?；馁|子信號的面積的積分。在圖1中示出了殼聚糖琥珀酰胺的NMR光譜實例和殼聚糖琥珀酰胺的結構式。式1-通過質子NMR計算取代有琥珀酰基的殼聚糖的取代度。如果其它NMR方法能夠以可行的方式更有利地估算取代度，則應當使用此種方法。本領域技術人員應該根據樣品的制備以及待積分的信號，尤其取決于分辨率、魯棒性以及待用于計算取代度的質子信號的位置來調整上式。有利地，所述組合物具有熱可逆的溶膠-凝膠轉變。有利地，本發明給出了提供具有低濃度的取代的殼聚糖的組合物的可能性。有利地，基于組合物的總質量，殼聚糖的濃度小于4質量％，例如小于3質量％，或進一步例如小于2質量％(m/m)。根據特定的替代方式，基于最終組合物的質量，取代的殼聚糖的濃度小于1.9質量％(m/m)。有利地，基于最終組合物的質量，取代的殼聚糖的濃度介于0.5質量％和1.5質量％(m/m)之間。根據具體的替代方式，基于最終組合物的質量，取代的殼聚糖的濃度為約1.2質量％(m/m)。根據具體的替代方式，基于最終組合物的質量，取代的殼聚糖的濃度為約2.5質量％(m/m)。根據具體的替代方式，基于最終組合物的質量，取代的殼聚糖的濃度為約2.0質量％(m/m)。根據具體的替代方式，基于最終組合物的質量，取代的殼聚糖的濃度為約1.5質量％(m/m)。根據具體的替代方式，基于最終組合物的質量，取代的殼聚糖的濃度為約1.3質量％(m/m)。根據具體的替代方式，基于最終組合物的質量，取代的殼聚糖的濃度為約1.1質量％(m/m)。根據具體的替代方式，基于最終組合物的質量，取代的殼聚糖的濃度為約1.0質量％(m/m)。根據具體的替代方式，基于最終組合物的質量，取代的殼聚糖的濃度為約0.9質量％(m/m)。此外，D-葡萄糖胺單元的取代度有利地給出了不使用酸性pH(通常為5.0至5.5)的溶液來使殼聚糖溶解，并且無需加入糖或多元醇鹽，如甘油磷酸鹽來使pH增加至約7的可能性。另一方面，本發明有利地給出了直接制備具有中性pH或生理pH，諸如pH6.2至8.5的溶液的可能性，在該溶液中，取代的殼聚糖是可溶的，并且因此有利地例如無需加入酸性溶液來使殼聚糖溶解。這具有如下優點：確保了對用于該熱凝膠組合物的pH范圍的更大的自由度，并且由此在中性pH或生理pH下制備熱凝膠組合物。例如，能夠使用緩沖劑(酸或堿)來調節pH。例如，可使用堿性緩沖液，并且隨后可使用弱酸來調節熱凝膠組合物的pH。根據有利的替代方式，熱凝膠組合物并不包括任何的凝膠劑。根據該替代方式，熱凝膠組合物在僅存在取代的殼聚糖的情況下就具有凝膠化性質。具體地，根據該替代方式，組合物并不包括本發明中所限定的凝膠劑。具體地，根據優選的替代方式，本發明的熱凝膠組合物并不包括任何的甘油鹽，并且尤其不包括甘油磷酸鹽(glycerolphosphatesalt)(還被寫為“甘油磷酸鹽glycerophosphate”的形式)。該替代方式給出了避免甘油磷酸鹽或任何其它等同凝膠劑存在的可能性，其對凝膠的技術效果僅在于機械性。根據該替代方式，優選地避免使用如凝膠劑的化合物，該化合物無任何治療益處，而且與治療受試者的身體也沒有任何生物/化學性質的相互作用。根據替代方式，組合物包括凝膠劑，優選地包括誘導組合物的溶膠-凝膠轉變的凝膠劑，例如，甘油磷酸鹽，例如為鈉鹽或鈣鹽形式，例如為其五水合物的形式；基于最終組合物的總質量，優選地所述凝膠劑在組合物中的濃度介于1質量％和20質量％之間，優選介于3質量％和9質量％(m/m)之間。凝膠劑有利地為至少一種多元醇或糖鹽，包括它們任意的混合物。在多元醇或糖鹽之中，特別可提及的是磷酸鹽，并且更尤其是多元醇或糖的二堿單磷酸鹽。還可提及的是硫酸鹽，諸如例如多元醇或糖的單硫酸鹽。在磷酸鹽之中，特別可提及的是甘油二堿單磷酸鹽，包括甘油-2-磷酸鹽、sn-甘油-3-磷酸鹽和1-甘油-3-磷酸鹽。根據替代方式，此為β-甘油磷酸鹽。在用于這些鹽的多元醇和糖中，可提及下列多元醇和糖：組氨醇、丙酮醇、己烯雌酚、吲哚甘油、山梨醇、核糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、赤蘚糖醇、肌醇、甘露醇、葡萄糖醇、棕櫚酰甘油、亞油酰甘油、油酰甘油、花生四烯酰甘油、果糖、半乳糖、核糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、山梨糖、赤蘚酮糖、脫氧核糖、酮糖、甘露糖、阿拉伯糖、墨角藻糖、吡喃果糖、酮葡萄糖、景天庚酮糖、海藻糖、塔格糖、蔗糖、阿洛糖、蘇糖、木酮糖、己糖、甲硫基核糖或甲硫基-脫氧-核酮糖，或它們的任何混合物。根據特定替代方式，多元醇或糖鹽的濃度，且優選地甘油鹽的濃度介于1％和10％之間。有利地，多元醇或糖鹽的濃度，且優選地甘油鹽的濃度介于1％和7％之間。有利地，多元醇或糖鹽的濃度介于2％和5％之間。上述值基于組合物的總質量以質量來表示。根據替代方式，甘油鹽為甘油磷酸鹽，并且更特別地為鈉鹽，諸如例如甘油磷酸二鈉。多元醇或糖鹽，且優選地甘油磷酸鹽用于使pH呈堿性pH，并且隨后通過加入酸來調節組合物的pH，從而有利地提供了能夠非常容易且準確地調整pH的熱凝膠化合物。當熱凝膠組合物并不包括任何凝膠劑時，可通過酸，例如弱有機酸或強無機酸(鹽酸)來調節pH。可用于調節組合物pH的弱有機酸例如為乙酸或谷氨酸。因此，根據本發明的組合物所具有的pH大于或等于7，例如大于或等于7.1，例如具有7.2至8.5的pH。pH是對溶液形式的最終熱凝膠組合物，即，在溶膠-凝膠轉變之前測量的。根據歐洲藥典(EP2.2.3)中所述的方法來確定pH。所使用的pH酸度計為設置有組合玻璃電極的Sartorius系列的pH計(PY-P11)。pH的測量在20℃和25℃之間進行。有利地，能夠在6.5至8.0的寬范圍內調節pH。根據替代方式，pH大于7.40。根據特定替代方式，pH為7.50+/-0.05。根據另一特定替代方式，pH為7.20+/-0.05。根據另一特定替代方式，pH為7.00+/-0.05。根據優選的替代方式，在30℃以上的溫度下，優選在介于30℃和50℃之間的溫度下，并且優選在32℃和45℃之間的溫度下，且進一步優選在35℃和40℃之間的溫度下，本發明的組合物具有溶膠-凝膠轉變。有利地，本發明的熱凝膠組合物在室溫下(即，在20℃和25℃之間的溫度下)處于流體的形式。根據優選的實施方式，在37℃以下的溫度下，優選在35℃以下的溫度下，且更優選在介于2℃至20℃之間的溫度下，本發明的組合物為流體。根據替代方式，在儲存溫度下，例如在2℃至8℃的溫度下，本發明的組合物為流體，或者在延伸的室溫下，例如在15℃至30℃的溫度下，本發明的組合物為流體。根據替代方式，本發明的熱凝膠組合物在0℃以上的溫度下為流體，在大于或等于10℃的溫度下為凝膠。根據另一替代方式，本發明的組合物在0℃以上的溫度下為流體，在大于或等于5℃的溫度下為凝膠。根據實施方式，組合物具有100mosm/kg至700mosm/kg，優選200mosm/kg至500mosm/kg的滲透度。滲透度可用mosm/L來表示，但這種情況下被稱為同滲容摩。當組合物為水性組合物時，密度約為1，則滲透度基本上等于同滲容摩，如本發明的組合物。根據替代方式，根據本發明的熱凝膠組合物是等滲的。根據替代方式，當本發明的組合物用于注射至人類的血漿中時，優選地，滲透度介于250mosm/kg和400mosm/kg之間，并且更特別地介于280mosm/kg和350mosm/kg之間。根據另一替代方式，當本發明的組合物用于注射至人類的滑液中時，優選地，滲透度介于300mosm/kg和490mosm/kg之間，并且更優選地介于360mosm/kg和470mosm/kg之間。溶液的滲透度的確定通過自動微量滲透壓計(Messtechnik品牌的15M型滲透壓計(OsmometerType15M))來實現。預先用300mosm/kg的溶液來校正該件儀器。將樣品放置在用于該目的的容器中，并且設定為標準測量溫度。有利地，本發明的熱凝膠組合物在流體狀態下，具有介于20mPa.s和800mPa.s之間，例如40mPa.s至500mPa.s之間的動態表觀粘度。動態表觀粘度在8℃的溫度下，由具有轉動子的粘度計，例如Brookfield品牌的具有轉動子的粘度計，例如設置有S18型的轉子，在5rpm的速度下測量。根據替代方式，本發明的組合物所具有的表觀粘度能夠使得在填充該組合物期間在注射裝置中，諸如注射器中容易地注射。根據替代方式，本發明的組合物所具有的表觀粘度能夠使得其通過細針，例如22號注射器在室溫下容易地注射?！叭菀椎亍弊⑸鋬炦x地是指為了使熱凝膠組合物流過22號的針而施加在注射器上的力小于50牛頓，優選小于20牛頓。根據本發明的熱凝膠組合物可稀釋例如在水中(可選地緩沖的水)。例如，能夠將本發明的組合物稀釋在能夠將pH調節至生理pH的緩沖液中。更具體地，例如能夠將本發明的組合物稀釋在乙酸鹽緩沖液中(例如，10mM的乙酸鈉三水合物緩沖液)以將pH調節至約7.5。對于凝膠，模量G’大于模量G”。對于溶液，模量G’小于模量G”。溶膠-凝膠轉變的特征在于G’模量和G”模量的交叉。當溶液具有“熱凝膠化”的能力時，在超過特定溫度時，并且尤其在低于生理溫度的溫度(即，注射或植入該產品的溫度)時，或者在生理溫度下植入或注射至身體后的一定時間后，模量G’變得大于模量G”。當溫度升高時，模量G’和模量G”交叉。模量G’和模量G”例如通過具有對兩個同心圓筒之間的流體施加剪切的庫愛特剪切的轉動流變儀，例如Rheometrics牌的流變儀ARES在例如1Hz的頻率和5％的形變下進行測量。模量G’和模量G”的測量可在特定溫度下進行。本文中給出的模量的測量始于在特定溫度下，例如在4℃的產品儲存溫度下的產品。隨后，使產品自然地達到特定溫度，例如生理溫度，例如37℃，而不控制溫度升高的速率。有利地，儲存模量G’介于0.001和1000之間，損耗模量G”介于0.001和1000之間，在生理溫度下，例如37℃下，在凝膠化后，G’大于G”。根據替代方式，有利地，儲存模量G’介于0.001和1000之間，損耗模量G”介于0.001和1000之間，在儲存溫度和/或室溫下，G’小于G”，在生理溫度下，例如37℃下，在凝膠化后，G’大于G”。有利地，當產品從冰箱的儲存溫度(例如2℃或4℃)或從室溫(例如18℃至25℃)升溫至生理溫度(例如37℃)時，儲存模量G’與損耗模量G”交叉，表明了溶膠-凝膠轉變以及體系的熱凝膠化性質，其中溶膠-凝膠轉變持續時間適用于目標應用。通過將殼聚糖溶液在足夠的溫度下保持足夠的時間以使其凝膠化可實現凝膠化。該凝膠化例如在例如保持在40℃的烘箱中進行。根據替代方式，本發明的熱凝膠組合物在15℃的溫度下處于凝膠的形式。根據本發明，例如，在注射至人體或動物體(熱血動物)后，凝膠化可在原位發生。凝膠化尤其給出了以局部方式定位凝膠的可能性。更具體地，在從2℃或4℃的溫度(儲存溫度)升溫至37℃(生理溫度)之后，即，例如在將該溶液注射至人體或動物體之后，原位發生溶膠-凝膠轉變所需的時段通常介于1秒和48小時之間。根據替代方式，從2℃或4℃的溫度升溫至37℃之后在持續5秒至24小時，優選持續小于4小時，進一步優選持續小于2小時之后，完成溶膠-凝膠轉變。根據另一替代方式，凝膠化瞬間發生(一旦溫度升高(并且在測量之前)便發生凝膠化)。根據替代方式，熱凝膠組合物處于凝膠化的形式。例如，本發明的組合物以凝膠化的形式儲存在注射器中。根據替代方式，組合物在注射器中不應凝膠化，而是應當在所需位置原位發生凝膠化。由于根據本發明的組合物有利地具有可逆的溶膠-凝膠轉變，因此能夠進行若干次溶膠-凝膠轉變循環。這有利地允許了通過升高溫度，即通常利用高壓滅菌鍋來對根據本發明的組合物進行滅菌。這有利地給出了提供這樣的熱凝膠組合物的可能性：該熱凝膠組合物提供了尤其在儲存、運輸或滅菌期間溫度的改變不會影響發生凝膠化的可能性。由于根據本發明的組合物尤其用于注射，故此其凝膠化性質適用于經由根據目標應用設置有可變尺寸(例如19號至32號，例如22號)的針的注射器來進行注射。通常，進行注射的人必須手動按壓注射器的活塞。因此，未凝膠化流體的耐壓縮性必須能夠使注射盡可能地容易。一經注射，組合物應該凝膠化，從而具有所需的粘彈性性質。根據替代方式，使流體組合物在22號針的孔口中流動所需的力介于1牛頓和20牛頓之間。優選地，該力介于2牛頓和15牛頓之間。根據替代方式，該力介于2牛頓和8牛頓之間。根據替代方式，使流體組合物在25號針的孔口中流動所需的力介于2牛頓和15牛頓之間。根據替代方式，該力介于2牛頓和10牛頓之間。根據替代方式，使流體組合物在27號針的孔口中流動所需的力介于1牛頓和20牛頓之間。優選地，該力介于2牛頓和15牛頓之間。根據替代方式，該力介于2牛頓和10牛頓之間?？勺⑸湫酝ㄟ^用于測量機械性能例如InstronBluehill牌的測試臺來測量，該測試臺設置有500N的測壓元件。注射系統特別設計用于測量通過推動注射器的活塞而實現溶液注射所需的力，其中，注射器設置有所需直徑的針。該系統具有設置有4cm寬的垂直狹縫的15cm高的金屬圓筒。該圓筒的頂部覆蓋有邊長為10cm的正方形金屬板。該板在其中間設置有孔，該孔的半徑為0.5cm。設置有22號直徑的針的注射器設定為4℃的溫度。向注射器的活塞施加每秒1mm的恒定向下速度。根據替代方式，組合物包括緩沖液，例如乙酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液。緩沖劑是本領域技術人員所知曉的。優選地，組合物包括還原糖，例如甘露醇或山梨醇。根據替代方式，本發明涉及一種熱凝膠組合物，所述熱凝膠組合物包括：0.1質量％至5質量％的取代的殼聚糖；并且優選1％至7％的多元醇或糖鹽，例如甘油磷酸鹽；以及可選地1％至10％的還原糖。有利地，本發明的組合物包括：基于該組合物的總質量，0.1質量％至1.9質量％的取代的殼聚糖；2質量％至6質量％的甘油，優選甘油磷酸鹽；以及可選地0.1質量％至2.5質量％的還原糖。根據替代方式，本發明涉及一種熱凝膠組合物，所述熱凝膠組合物包括：0.1質量％至5質量％，且優選0.5質量％至2.5質量％的取代的殼聚糖；可選地0.1％至10％的還原糖；以及可選地0.1％至5％且優選0.5％至2.5％的透明質酸。有利地，本發明的組合物包括：基于該組合物的總質量，0.1質量％至2.5質量％的取代的殼聚糖；可選地0.1質量％至2.5質量％的還原糖；以及可選地0.1％至5％且優選0.5％至2.5％的透明質酸，所述組合物優選地不具有任何的甘油或甘油鹽。有利的是，在本發明的組合物中使用至少一種多元醇(除了如果存在的例如甘油磷酸鹽的多元醇鹽之外)。這樣的多元醇可例如選自由以下項所組成的組：異丙醇；山梨醇；甘露醇；亞烷基二醇，如丙二醇；聚(烷基二醇)，例如聚(乙二醇)；果糖；半乳糖；核糖；葡萄糖；木糖；鼠李糖；山梨糖；赤蘚酮糖；脫氧核糖；酮糖；甘露糖；阿拉伯糖；墨角藻糖；吡喃果糖；酮葡萄糖；景天庚酮糖；海藻糖；塔格糖；蔗糖；阿洛糖；蘇糖；木酮糖；己糖；甲硫基核糖；甲硫基-脫氧-核酮糖及它們的任何混合物。根據特定替代方式，能夠進行取代的試劑是琥珀酸酐。根據該特定替代方案，取代的殼聚糖是殼聚糖琥珀酰亞胺，即，殼聚糖和琥珀酰基共價結合至D-葡萄糖胺單元的氨基的氮原子上。根據涉及殼聚糖和取代試劑的反應來對殼聚糖進行修飾，其中，殼聚糖與取代試劑進行反應以得到在D-葡萄糖胺基團上取代的殼聚糖。本發明還涉及用于制備取代的殼聚糖的方法。該方法特別包括：優選地通過將pH調節至殼聚糖是可溶的酸性pH，使殼聚糖溶解在水性溶液，尤其是溶解在水中的步驟；使殼聚糖與取代試劑發生取代反應的步驟；用于停止取代反應的步驟，優選地以取代基的摩爾數相對于全部單元的摩爾數來表示，殼聚糖的取代度在10％至50％的范圍內時，例如，通過調整反應介質的pH，或者通過使殼聚糖沉淀在“非溶劑”中來停止取代反應，其中，在該非溶劑中，取代的殼聚糖是不溶的；純化取代的殼聚糖?！胺侨軇笔侵冈谄渲腥〈臍ぞ厶鞘遣蝗艿?，即，肉眼能夠觀察到濁度。這樣的溶劑例如是極性溶劑，例如乙醇、甲醇、丙酮等。使殼聚糖溶解在水性溶液中的步驟可通過將合適的酸加入到水中來實現。在反應步驟中，取代試劑的量可根據取代的殼聚糖的所需取代度來進行調整。在反應步驟中，反應時間可根據取代的殼聚糖的所需取代度來進行調整。有利地，根據取代的殼聚糖的所需取代度來停止反應以終止殼聚糖的取代反應。已知的是，存在不同的反應來用于殼聚糖的取代。例如可參見申請WO2010/142507，尤其涉及殼聚糖衍生物的制備。殼聚糖取代可包括D-葡萄糖胺和N-乙?；?葡萄糖胺單元，其中，至少一些單元接枝(或連接)至相同或不同的一個或若干個官能團。根據替代方式，取代的殼聚糖包括葡萄糖胺單元和N-乙酰基-葡萄糖胺單元，所述單元包括一個或若干個官能團。化學修飾可例如通過與N-乙酰基-葡萄糖胺單元的一個或若干個官能團，即，羥基官能團和/或氨基官能團，和/或葡萄糖胺單元的一個或若干個官能團，即，羥基官能團和/或氨基官能團結合來進行。根據具體的實施方式，存在于取代的殼聚糖上的官能團選自包括但不限于疏水性官能團、親水性官能團、離子官能團以及它們的任何組合的組。根據具體的替代方式，疏水性官能團選自由烷基、烯基、芳烷基、烷芳基和它們的任何組合所組成的組。這些基團通常包括1至100個碳原子，并且更通常包括1至50個碳原子，例如1至25個碳原子，或進一步1至10個碳原子；一個或多個碳原子可例如被雜原子替代和/或選自硼、氮、氧、硫、硅、鍺、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯官能團或它們的任何組合所替代，并且其中，一個或多個氫原子可例如被雜原子替代和/或選自由鹵素原子、烷氧基、酰胺基和它們的任何組合所組成的組的原子所替代。根據另一實施方式，疏水性官能團選自由羧酸、有機磺酸、聚醚、胺聚醚、聚酯、固醇、卟啉及它們的任何組合所組成的組。根據另一替代方式，親水性官能團選自由二胺、多胺、二醇、多元醇、二酸、多元酸、冠醚、甘醇二甲醚、聚烯烴醚、聚烯烴胺、聚烯烴醚胺、聚丙烯酸、聚乙烯醇及它們的任何組合所組成的組。根據另一具體替代方式，離子官能團選自由金屬鹽、銨鹽、鏻鹽、硫酸鹽、羧酸鹽、磷酸鹽、羧二酸、多元羧酸、用于與殼聚糖形成共價鍵的羧酸官能團、二胺、多胺、用于與殼聚糖形成共價鍵的胺官能團，以及它們的任何組合所組成的組。根據具體替代方式，取代殼聚糖的官能團為氨基烷基。例如，取代殼聚糖的官能團為氨基乙基。根據替代方式，取代的殼聚糖為：氨基-烷基殼聚糖，諸如氨基-乙基殼聚糖等，以及它們的等同物；疏水化的N-烷基殼聚糖或O-烷基殼聚糖，諸如例如，乙?；鶜ぞ厶?、丙酰基殼聚糖、丁?；鶜ぞ厶恰⑽祯；鶜ぞ厶恰⒓乎；鶜ぞ厶?、庚酰基殼聚糖、辛酰基殼聚糖、壬?；鶜ぞ厶?、癸?；鶜ぞ厶腔蚴轷ぞ厶?，以及它們的等同物；帶正電荷的殼聚糖，諸如例如三烷基銨殼聚糖(例如，三甲基-殼聚糖或TMC)以及它們的等同物；N-(2-羥基)丙基-3-三甲基銨殼聚糖和其反離子，諸如氯離子，以及它們的等同物；帶負電荷的殼聚糖，諸如例如殼聚糖琥珀酰亞胺(琥珀酰殼聚糖)、N,O-羧基烷基殼聚糖、N,O-磺烷基殼聚糖以及它們的等同物；中性殼聚糖，諸如例如N,O-乙酰殼聚糖、N,O-烷基殼聚糖、乙?；鶜ぞ厶?、丙?；鶜ぞ厶恰⒍□；鶜ぞ厶?、戊酰基殼聚糖、己?；鶜ぞ厶?、庚?；鶜ぞ厶恰⑿刘；鶜ぞ厶?、壬酰基殼聚糖、癸?；鶜ぞ厶恰⑹轷ぞ厶?，及它們的等同物；兩性殼聚糖，諸如例如包括疏水性聚合物的殼聚糖，諸如例如脂肪族聚酯，諸如乳酸的均聚物和共聚物、乙醇酸的均聚物和共聚物、ε-己內酯的均聚物和共聚物、脂肪族和/或芳香族聚酯的對二氧雜環己酮的均聚物和共聚物；脂肪族聚酰胺；乙烯聚合物和它們的共聚物；聚合物和丙烯聚合物和共聚物；聚碳酸酯；聚丙烯酸酯；以及它們的等同物。根據具體的實施方式，在本發明的范圍內也可使用其它衍生物，并且其它衍生物包括O-取代的殼聚糖，對于O-取代的殼聚糖，其取代可在葡萄糖胺和/或N-乙酰基葡萄糖胺單元的羥基上來實現。根據替代方式，殼聚糖具有作為取代基的疏水性聚合物，該疏水性聚合物優選地選自由脂肪族聚酯和脂肪族聚酰胺；烯烴均聚物或共聚物，例如乙烯或丙烯的聚合物；聚碳酸酯；聚丙烯酸酯，和它們的任何組合所組成的組。根據替代方式，殼聚糖具有作為取代基的脂肪族聚酯，并且尤其是聚丙交酯。對于用于殼聚糖的取代方法，可提及的是在美國專利US7838643中所述的反應，以及由該方法所得到的殼聚糖。也可提及專利US3953608。根據替代方式，以下物質能夠用作取代試劑：例如N-烷基化劑或烷基酸酐，可選地包括一個或多個不飽和鍵，可選地包括一個或多個雜原子和/或官能團(諸如例如，醚、硫醚、羧基、酯、酰胺等)，可選地包括一個或多個取代基(如烷基、氨基、羥基、羧基、羧酸基等)。根據替代方式，可提及的實例為琥珀酸酐、谷氨酸酐、乙酰氧基琥珀酸酐、甲基琥珀酸酐、二乙酰酒石酸酐、二甘醇酸酐、馬來酸酐、衣康酸酐、檸康酸酐和它們的任何混合物。理論上，能夠在中性pH或生理pH下在最終組合物中提供可溶的殼聚糖可能性的任何取代試劑均是合適的。當通過沉淀來實現停止反應的步驟時，純化可為分離不溶的取代的殼聚糖和非溶劑。在純化之后，本發明的方法可包括：干燥取代的殼聚糖的步驟，以及隨后可選地，研磨取代的殼聚糖以獲得粉末。根據特定的替代方式，取代試劑為琥珀酸酐。取代的殼聚糖為殼聚糖琥珀酰亞胺。殼聚糖琥珀酰亞胺可通過以下方式來獲得：使殼聚糖溶解在pH小于6.5的水性溶液中；使溶液保持在介于0℃和100℃之間，優選介于20℃和50℃且進一步優選介于25℃和35℃之間的溫度；在殼聚糖溶解之后，將例如粉末形式的琥珀酸酐加入到殼聚糖溶液中。琥珀酸酐的量和琥珀酸酐的加入次數根據取代的殼聚糖的所需取代度來調整；在足夠得到最小的取代度的時間后，例如在最少持續15分鐘后，停止反應。反應可例如通過改變反應介質的pH或通過在非溶劑(諸如乙醇、甲醇、丙酮……)中的沉淀步驟來停止；隨后，有利地，例如通過透析技術，或通過在非溶劑中進行沉淀/溶解循環，或通過切向過濾技術對取代的殼聚糖進行純化。隨后，優選對純化的產品進行干燥。該產品可例如通過噴霧干燥(霧化)或在烘箱中(在真空或在大氣壓下)，或進一步通過冷凍干燥來進行干燥。殼聚糖的水性溶液的pH可通過弱酸，諸如乙酸、乳酸等的溶液來調節，以使殼聚糖溶解。以取代基的摩爾數相對于全部單元的摩爾數來表示，殼聚糖的取代度可有利地在10％至30％，優選15％至30％，且進一步優選15％至25％之間變動。具體地，本發明涉及一種熱凝膠組合物，該熱凝膠組合物包括取代的殼聚糖，該取代的殼聚糖具有10％至30％，優選15％至30％，且進一步優選15％至25％的取代度，所述組合物不包括任何甘油磷酸鹽。殼聚糖琥珀酰亞胺的取代度與反應開始時試劑相對于殼聚糖的質量比相關。根據替代方式，在殼聚糖琥珀酰亞胺的情況下，使用大于0.13的試劑質量比是優選的。根據替代方式，在殼聚糖琥珀酰亞胺的情況下，使用小于0.2的試劑質量比是優選的。根據特定替代方式，取代試劑為使D-葡萄糖胺單元的氨基烷基化的試劑。取代的殼聚糖有利地在D-葡萄糖胺單元上烷基化的殼聚糖。作為烷基化試劑，可提及的是鹵代烷基，如鹵代甲基，如甲基碘、甲基溴、?；龋鐜в幸粋€或幾個羧基甲基、氨基乙基和/或三甲基等的那些烷基化試劑。根據該替代方式，取代的殼聚糖為N-烷基殼聚糖。根據特定的替代方式，取代的殼聚糖為帶有三甲基取代基的殼聚糖(N,N,N-三甲基殼聚糖，縮寫為TMC)。根據替代方式，烷基化的殼聚糖，優選TMC，利用范圍在0.1至0.35，且優選0.15至0.30的試劑摩爾比來得到，該摩爾比表示為烷基化試劑的摩爾數相對于殼聚糖中最初存在的氨基的摩爾數。殼聚糖例如參考編號CAS9012-76-4。用于本發明的殼聚糖有利地是真菌來源的，并且優選源自于子囊菌Ascomycetes類真菌的菌絲體，并且具體是黑曲霉Aspergillusniger；和/或擔子菌類Basidiomycetes真菌的菌絲體，并且具體是香菇Lentinulaedodes(香菇(shiitake))和/或雙孢蘑菇Agaricusbisporus(蘑菇)。優選地，殼聚糖來自雙孢蘑菇Agaricusbisporus。殼聚糖優選是非常純的，即含有很少來自其真菌來源的雜質，并且具有與其作為植入物或藥物組合物的用途相容的微生物學品級。用于制備殼聚糖的方法是在專利WO03/068824(EP1483299；US7,556,946)中所述的方法。所制備的殼聚糖可具有各種分子量，通常范圍在10000至300000。根據替代方式，平均分子量介于20000和60000之間。根據另一替代方式，平均分子量介于60000和100000之間。根據另一替代方式，平均分子量介于100000和120000之間。根據另一替代方式，平均分子量介于120000和150000之間。根據另一替代方式，平均分子量介于150000和220000之間。能夠水解殼聚糖以降低其分子量。在本文中，優選的是，平均分子量是粘度平均分子量(Mv)，根據Mark-Houwink方程由特性粘度來計算。該特性粘度根據歐洲藥典專刊EP2.2.9的方法，利用Ubbelohde型的毛細管粘度計來測量。通過自動粘度計LaudaVisc來測量溶液流經合適的毛細管(Lauda，例如直徑0.53mm的Ubbelohde51001毛細管)的時間，例如根據EP2.2.9方法的規范，首先在起始殼聚糖濃度下測量，并且隨后在幾次稀釋下進行測量。根據每個濃度來推斷出降低的特性粘度。對該降低的粘度相對于溫度作圖，并且外推出濃度為0時的值以由此推斷出特性粘度。例如，根據式5，i稀釋液(g/ml)的降低的粘度(以ml/g表示的η降低)相對于i稀釋液的濃度C作圖。式2：[η降低]＝(t1-t0)-(1-C)為了計算平均粘度質量，使用Mark-Houwink方程，其中，根據Rinaudo等人建議使用常數k和α(Int.J.Biol.Macromol,1993,15,281-285)，根據殼聚糖的DA選擇下列三個式子之一：式3：Mv＝([η]/0.082)(1/0.76)，對于2％的DA；式4：Mv＝([η]/0.076)(1/0.76)，對于10％的DA(例如11.5％)；式5：Mv＝([η]/0.074)(1/0.76)，對于20％的DA(例如21％)。對于中間DA值，進行線性內插以計算平均粘度質量(Mv)。優選地，所使用的殼聚糖的平均分子量介于120,000和150,000之間，并且進一步介于150,000和220,000之間。根據特定替代方式，取代的殼聚糖優選地具有150,000至220,000的平均分子量，以及10％至50％范圍內的取代度，優選地在取代前對分子量進行表示。根據另一特定替代方式，取代的殼聚糖具有120,000至150,000的平均分子量，以及12％至40％、優選12％至30％或甚至20％至30％范圍內的取代度，優選地在取代前對分子量進行表示。有利地，殼聚糖所具有的乙?；潭?DA)介于5％和50％之間。乙?；潭缺硎緸镹-乙?；?D-葡萄糖胺單元的數量相對于存在的N-乙?；?D-葡萄糖胺和D-葡萄糖胺單元的總數。根據替代方式，乙?；潭冉橛?0％和45％之間。根據替代方式，乙酰化程度介于5％和20％之間。根據替代方式，乙?；潭冉橛?5％和25％之間。根據替代方式，乙酰化程度介于20％和30％之間。根據替代方式，乙?；潭冉橛?5％和40％之間。乙?；潭韧ㄟ^電勢測定法來確定。使殼聚糖溶解在鹽酸溶液中。通過氫氧化鈉溶液的滴定來確定未與殼聚糖的氨基官能團反應的過量鹽酸。由此推斷出殼聚糖中存在的D-葡萄糖胺單元的摩爾數，以及通過相減得到乙酰化程度。有利地，殼聚糖具有受控的乙?；潭?。術語“具有受控乙?；潭鹊臍ぞ厶恰笔侵缚梢砸允芸氐姆绞絹碚{節乙酰化程度，即，N-乙?；?葡萄糖胺單元的比例的產品。有利地，本發明的組合物還可包括不是取代的殼聚糖的生物聚合物。根據有利的替代方式，該生物聚合物是多糖，例如，透明質酸或透明質酸鈉。透明質酸可具有至多4MDa的分子量。透明質酸的分子量可通過其特性粘度來反映。透明質酸可具有范圍在1m3/kg至4m3/kg范圍內的特性粘度，并且例如可表征為低(例如約1m3/kg至2m3/kg)分子量或高(例如約2m3/kg至4m3/kg)分子量。有利地，基于組合物的總質量，透明質酸的濃度小于4質量％，例如小于3質量％，或進一步例如小于2質量％(m/m)。根據特定的替代方式，基于最終組合物的質量來表示，透明質酸的濃度小于1.9質量％(m/m)。有利地，基于最終組合物的質量來表示，透明質酸的濃度介于0.5質量％和1.5質量％(m/m)之間。根據具體的替代方式，基于最終組合物的質量來表示，透明質酸的濃度為約0.9質量％、1.0質量％、1.1質量％、1.2質量％、1.3質量％、1.5質量％(m/m)。殼聚糖與透明質酸之間的比可分別為例如5％至95％，例如10％至90％，且進一步例如30％至70％的取代的殼聚糖，以及5％至95％，例如10％至90％，且進一步例如30％至70％的透明質酸，百分比基于取代的殼聚糖的干重/透明質酸的干重來表示。根據替代方式，殼聚糖與透明質酸之間的比為1/1(即，50％的殼聚糖和50％的透明質酸)。根據另一替代方式，殼聚糖與透明質酸之間的比為1.5/0.5(即，75％的殼聚糖和25％的透明質酸)。有利地，在透明質酸的存在下，基于取代的殼聚糖的熱凝膠組合物形成凝膠。有利地，根據該替代方式，熱凝膠組合物的流動性質可通過濃度、殼聚糖與透明質酸之間的比例以及透明質酸的分子量來調節。有利地，在透明質酸的存在下，保持凝膠的性質。包括可選地混合有透明質酸的取代的殼聚糖的凝膠有利地給出了具有良好內聚力和在低振蕩頻率(例如近似于行走期間對膝蓋的滑液施加的頻率下(由0.6Hz下G’模量的值來表示))對凝膠的沖擊的良好吸收能力以及使接合處潤滑的良好能力(在靜止時通過粘度來表示)的可能性。本發明還涉及一種用于制備根據本發明的熱凝膠組合物的方法。根據替代方式，該方法通常包括：使取代的殼聚糖溶解在水性溶液，優選水中，可選地，所述水性溶液優選在6.2和8.5的pH之間緩沖，并且優選在6.5和7.5的pH之間緩沖；可選地，例如通過加入緩沖劑將pH調節至生理pH；可選地，調節組合物的滲透度；可選地，調節組合物的粘度。根據替代方式，該方法通常包括：使取代的殼聚糖溶解在水性溶液，優選水中，可選地，所述水性溶液優選在6.2和8.5的pH之間緩沖，并且優選在6.5和7.5的pH之間緩沖；可選地，將pH調節至生理pH；與糖或多元醇鹽溶液，諸如例如甘油磷酸鹽的溶液進行混合；可選地，例如通過加入緩沖劑將pH調節至生理pH；可選地，調節組合物的滲透度；可選地，調節組合物的粘度。如果需要的話，該方法可包括向組合物中加入其它組分。根據替代方式，在包括還原糖，諸如甘露醇的水中，進行殼聚糖的溶解。根據替代方式，緩沖劑為乙酸鹽緩沖液。根據替代方式，緩沖劑為磷酸鹽緩沖液。有利地，該方法還包括用根據本發明的組合物填充注射裝置，諸如例如注射器的后續步驟。有利地，注射裝置，諸如例如注射器可隨后利用蒸汽進行滅菌。然后，該裝置，例如注射器優選地以無菌的方式進行包裝。有利地，使用對于預期應用具有足夠純度的殼聚糖。更具體地，本發明涉及一種可注射的組合物，該可注射的組合物包括根據本發明的熱凝膠組合物或由根據本發明的熱凝膠組合物組成。根據替代方式，根據本發明的組合物用作可注射的藥用組合物，或者用作可注射的醫學裝置或可植入的醫學裝置。更具體地，本發明涉及根據本發明的組合物在治療性治療中的應用，例如包括通過皮下途徑、皮內途徑、眼內途徑或關節內途徑來注射所述組合物以例如用于修復或填充需要修復或填充的至少一個身體組織。根據替代方式，上述身體組織選自屬于聲帶、肌肉、韌帶、肌腱、軟骨、性器官、骨、接合處、眼、真皮、表皮、皮膚的一層或多層、中胚層，或它們的任何組合的組織，并且更具體地，選自屬于關節接合處的組織。本發明更具體地涉及根據本發明的組合物例如通過將所述組合物注射到滑液中，或在與血液混合后，植入到軟骨中來治療關節病，或修復軟骨缺損。本發明更具體地涉及一種醫學裝置，例如醫學植入物，特征在于，該醫學裝置包括根據本發明的組合物或由根據本發明的組合物組成。本發明還可包括能夠調節其性質的一種或多種添加劑或賦形劑。根據特定替代方式，本發明的組合物包括顆粒(例如固體顆粒)的懸浮液或凝膠的懸浮液。本發明還涉及根據本發明的組合物通過真皮填充在美容美體護理或治療方法中的應用。這尤其例如是通過皮下途徑或皮內途徑來注射根據本發明的組合物。本發明還涉及根據本發明的組合物經由皮內途徑通過多次注射在皮膚表面處理方法中的應用。這種組合物可典型地用在皮膚醫學中，如用于美容美體目的的治療中。這種方法具有例如使皮膚再膨脹的目的，從而不再呈現其皺縮的外觀(皺紋和/或細紋的處理)。這種處理可在想要使他/她的皮膚恢復活力的人上進行。本發明還涉及根據本發明的組合物在美容美體護理或治療方法中的應用，其中，所述組合物為粘彈性補充劑。例如，在此的目的是在關節內水平上注射本發明的組合物以尤其用于限制位于接合處任一側的滑膜的摩擦。本發明還涉及根據本發明的組合物用作一種或多種細胞類型的細胞載體，和/或一種或多種活性劑。從藥學或生物學觀點來看，這些可以是活性劑。本發明的組合物可實際上與細胞，優選活細胞的存在相容。在感興趣的活細胞中，可提及的例如為：軟骨細胞(關節軟骨)、纖維軟骨細胞(半月板)、韌帶成纖維細胞(韌帶)、皮膚成纖維細胞(皮膚)、肌腱細胞(肌腱)、肌成纖維細胞(肌肉)、間充質干細胞、紅細胞(血液)和角質形成細胞(皮膚)。本發明的組合物也可旨在用作至少一種治療劑的靶向遞送和/或受控釋放的治療載體。根據替代方式，血液或血漿或血小板溶解物，或者富含血小板的血漿或任意生物流體與本發明的組合物一起加入，從而例如提高產品的性能。根據替代方式，根據本發明的組合物配制成固體形式(例如，膜或多孔泡沫)，其一旦植入便可溶解。根據替代方式，組合物配制為可霧化的組合物(噴霧)。本發明還涉及根據本發明的組合物在受到過高溫度影響，例如在燒傷情況下的一個或多個組織或器官的治療或美容美體護理中的應用。本發明還涉及作為人造滑液的組合物，包括根據本發明的組合物或由根據本發明的組合物組成。根據本發明的組合物通過盡力提高其吸收沖擊的性質(通過彈性模量G’來辨別)，同時能夠容易地注射來填充例如注射器或能夠注射至人體或動物體而給出了仿制健康滑液的可能性或改善健康或有缺陷滑液的可能性。作為指示，健康滑液的彈性模量G’介于40Pa和100Pa之間，其損耗模量G”介于1Pa和10Pa之間。根據替代方式，熱凝膠組合物以流體形式注射并且隨后原位發生凝膠化。根據替代方式，熱凝膠組合物以凝膠的形式注射。有利地，根據該替代方式，凝膠能夠容易地通過細針來注射。通常，在生物醫學應用中，滲透度和pH值的要求范圍接近于以下值：滲透度：與血漿等滲：285mosm/kg至295mosm/kg；與滑液等滲：404+/-57mosml/kg，根據“ClinOrthopRelatRes,1988,235,289-95”和“BiochemBiophysResComm,2012,422,455-461”；pH：生理pH通常在6.8以上，尤其在7.0以上，并且尤其為7.4(如血漿或滑液)。血漿的pH通常為7.4。根據“JBoneJointSurgBr,1959,41-B(2),388-400”，滑液的pH通常為7.768+/-0.044；或根據“ActaOrthopScand,1969,40,634-641”或進一步根據“ClinRheumatol2006,25,886-888”，滑液的pH通常為7.3。通常認為，在骨關節炎的情況下，滑液的pH通常低于健康滑液的pH。相當令人驚奇的是，發現根據本發明的熱凝膠組合物在與滑液混合時，尤其是與來自患有骨關節炎的人類的膝蓋的滑液混合時，具有非常良好的性質。與現有技術中基于透明質酸的組合物所觀察到的效果(在透明質酸被患有骨關節炎的患者的滑液稀釋時，粘彈補充性質下降)不同，本發明的熱凝膠組合物與滑液混合時，甚至在滑液中稀釋之后，仍保持其凝膠性質。進一步更令人驚奇的是，根據本發明的熱凝膠組合物通過與滑液混合，尤其是與患有骨關節炎的人類的膝蓋的滑液混合時，具有增強的流變性質。這可涉及本發明的熱凝膠組合物和滑液之間的協同效果。因此，本發明涉及滑液與根據本發明所限定的熱凝膠組合物的混合物，例如，根據熱凝膠組合物/滑液的體積比范圍為20/80至80/20(v/v)，并且例如為50/50(v/v)。有利地，根據本發明的組合物是無菌的。非常有利地，根據本發明的組合物通過升高溫度，尤其是在高壓滅菌鍋里來進行滅菌。根據替代方式，本發明的組合物是透明的或半透明的。“半透明的”是指當將組合物放置在觀察者的眼睛和物體之間時，可識別出該物體?！巴该鞯摹笔侵府斀M合物放置在觀察者的眼睛和觀察的字母數字符號之間時，能夠識別出該字母數字符號。通常，該評估利用約1cm厚的組合物來進行。根據替代方式，本發明的組合物是無色的，即，具體地，肉眼觀察者并不認為組合物具有任何特定顏色。本發明尤其涉及一種優選是無菌的物件或包裝品，包括一種或多種預填充有根據本發明的熱凝膠組合物的注射裝置。這些通常是預填充的注射器。根據本發明的組合物可有利地被滅菌。根據替代方式，本發明的組合物利用蒸汽進行滅菌，例如通過將溫度升高至100℃以上的溫度，并且優選120℃的溫度，例如121℃和138℃的溫度，在高壓滅菌鍋中持續足夠長的時間例如通常15分鐘至20分鐘來進行滅菌。本發明進一步涵蓋處于干燥形式，特別是冷凍干燥形式的本發明的組合物。在使用前，尤其能夠對該冷凍干燥的組合物進行分散或再分散。本發明還涵蓋治療性治療方法，包括注射根據本發明的組合物。本發明還涵蓋根據本發明的組合物在制備藥物組合物中的應用，尤其是治療性治療中的應用，例如本發明更特定地限定。本發明還涵蓋美容美體護理方法，換句話說，非治療性，包括：注射根據本發明的組合物。例如在事故或外科手術之后，出于美麗的目的而進行的填充例如皺紋或一個或多個損傷的可見組織區域。組織是來自同一來源的相似細胞的集合，這些相似細胞聚集成功能性集合，即，行使相同的功能。在組織中，可提及的是：上皮組織、結締組織、肌肉組織和神經組織?！案鶕景l明的組合物”或等同術語是指如本發明所限定的組合物，包括根據替代方式、具體或特定實施方式中獨立地或根據它們的任意組合的任意組合物，以及包括根據優選特征的組合物。附圖說明在附圖中：圖1示出了本發明的殼聚糖琥珀酰亞胺的質子核磁共振譜圖。具體實施方式參照僅以說明目標而并非限制本發明范圍的方式給出的實施例閱讀示例性的描述后，本領域技術人員將清楚地了解本發明的其它目的、特征和優點。實施例是本發明的組成部分，并且將說明書(包括實施例)作為一個整體來看，相對于任何現有技術表現為新穎的任何特征就其功能和整體性而言是本發明的組成部分。因此，每個實施例具有一般范圍。另一方面，在實施例中，除非另有說明，否則所有的百分比均以質量表示，并且除非另有說明，否則溫度均以攝氏度表示；并且除非另有說明，否則壓力均以大氣壓來表示。實施例根據本發明的取代的殼聚糖的前體殼聚糖具有在表1所示范圍內的粘度平均分子量(Mv，通過毛細管粘度計來確定)和乙酰化程度(DA，通過電位滴定來確定N-乙?；?葡萄糖胺單元的比例)。殼聚糖的分子量可限定為1％(m/m)殼聚糖濃度溶液在濃度為1％(v/v)乙酸中的動態粘度，其通過具有轉動子的粘度計來測量，例如如前文所示出的Brookfield粘度計。實施例1–取代的殼聚糖(殼聚糖琥珀酰亞胺，CSS)的制備為了得到表2的編號CSS5的殼聚糖琥珀酰亞胺，將已知分子量和DA的10g殼聚糖溶解在266ml的1％(v/v)乙酸的水性溶液中。使溶液保持在30℃的溫度下。加入6.75g的琥珀酸酐(SA)，這對應于琥珀酸酐與殼聚糖的質量比(SA/殼聚糖)為0/675，并且琥珀酸酐與殼聚糖的NH2基的摩爾比(SA/NH2)為1/7。在15分鐘之后，可選地，可通過加入30％的蘇打將反應介質的pH調節至7.5。隨后，從2.5升的乙醇中沉淀該溶液?；厥粘恋砦铮⑶覍⑵淙芙庠谒?。使取代的殼聚糖從乙醇中進行這些沉淀步驟并且隨后溶解在水中3次。在最后一次沉淀時，回收沉淀物，擠壓，并且在大氣壓下在60℃的烘箱中進行干燥。殼聚糖琥珀酰亞胺一經干燥，則對其進行研磨以得到粉末。根據前文所述的方法，通過質子NMR來確定殼聚糖的取代度。圖1中示出了NMR譜圖。根據表2中的參數，以相同的方式制備在實施例中使用的多批殼聚糖琥珀酰亞胺。備注：β-甘油磷酸鈉(65％，Salfic-Alcan，縮寫為GP)的加入提供了使CSS在水中的溶解度超過溶解極限的可能性。CSS具有兩性性質。這并不是問題，由于能夠加入低濃度的GP以再次發現CSS的可溶性質。實施例2–取代的殼聚糖(三甲基殼聚糖，TMC)的制備在體積為800ml的水中制備50g的殼聚糖的懸浮液。將懸浮液加熱至95℃。將體積為26.27ml的3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨試劑(縮寫為CHTAC)逐滴加入到介質中，即，CHTAC/殼聚糖的質量比和摩爾比分別為0.31和0.5。在反應4小時后，用400ml的水稀釋反應介質，隨后由8.4升的乙醇進行沉淀?；厥粘恋砦?，并且將沉淀物再次溶解到水中。利用乙醇，對取代的殼聚糖進行3次溶解/沉淀步驟。在最后一次沉淀時，回收沉淀物，并且對沉淀物進行擠壓，且在大氣壓下在60℃的烘箱中進行干燥。三甲基殼聚糖一經干燥，則對其進行研磨以得到粉末。根據表3中的參數，以相同的方式制備在實施例中使用的三甲基殼聚糖。備注：所有的這些三甲基殼聚糖優選地在DS范圍為16％至75％時在水中是可溶的。實施例3–熱凝膠組合物的制備例根據實施例1獲得的殼聚糖琥珀酰亞胺(CSS2)以以下比例溶解在水中：0.195g的殼聚糖琥珀酰亞胺CSS2溶解在含0.5％(m/m)甘露醇的14.809g的水中。制備39.7％(m/m)的β-甘油磷酸鈉(65％，Salfic-Alcan，縮寫為GP)的溶液。在磁力攪拌或機械攪拌下，將1.49ml的GP溶液加入到殼聚糖琥珀酰亞胺溶液中，將0.325ml的0.5M乙酸鹽緩沖液(pH3)加入到殼聚糖琥珀酰亞胺/GP溶液中，直至得到給定的pH，例如在表4的編號為2的溶液的情況下，為7.5。測量最終溶液的滲透度。實施例4–殼聚糖琥珀酰亞胺溶液在1.14％(m/m)的最終濃度下的凝膠化能力根據實施例3所述的方法來制備表4的溶液。熱凝膠溶液的凝膠化能力尤其取決于取代度。取代度與殼聚糖上存在的氨基官能團與在取代反應期間所使用的琥珀酸酐的量之間的摩爾比直接相關。如果取代度過高，則不能發生凝膠化(溶液編號5的情況)。如果取代度過低(溶液編號1的情況)，則不能發生凝膠化。表4表明對于殼聚糖琥珀酰亞胺，產生熱凝膠化能力的最佳AS/殼聚糖質量比在0.12和0.26之間，這表示10％至45％范圍內的DS。此外，從不同批次的殼聚糖琥珀酰亞胺出發，制備表5的熱凝膠溶液，以證實制備質量比為0.13的水凝膠的再現性，這種質量比為0.13的水凝膠給出了得到14mol％和18mol％之間DS的可能性。可以看出，發現最終溶液的滲透度在363mosm/kg和447mosm/kg之間，并且所有的溶液易于注射和熱凝膠化。甘露醇(對于熱凝膠化效果是可選的)的存在提高了滲透度。實施例5–取代的殼聚糖TMC在最終濃度為0.9％(m/m)時的凝膠化能力在具有中等分子量的三甲基殼聚糖的情況下，發現例如，在0.9％(m/m)的低濃度下熱凝膠化凝膠制劑的最佳取代度在10％和36％之間(表6)。實施例6–殼聚糖琥珀酰亞胺溶液在低濃度、滲透度和生理pH值下的凝膠化能力將基于未取代的殼聚糖(CS)的溶液的溶解度、注射能力和熱凝膠化性質與基于根據實施例2的方法制備的取代的殼聚糖(殼聚糖琥珀酰亞胺，CSS)的溶液的溶解度、注射能力和熱凝膠化性質進行比較(表7)。對于現有技術中未取代的殼聚糖，不能同時觀察到所需的性能規范：pH、水中的溶解度、在37℃下的注射能力和凝膠化。對于被琥珀?；〈臍ぞ厶牵軌蛏踔猎谳^低濃度的GP(具有相同的聚合物濃度)下得到溶解度、注射能力和溶膠-凝膠性質，這是由于初始聚合物是在水中可溶的取代的殼聚糖，且能夠調節GP濃度以得到所需的凝膠化特性、滲透度和pH。實施例7–在寬pH范圍內，最終濃度為0.88％的殼聚糖琥珀酰亞胺溶液的凝膠化能力在該實施例中，通過加入濃縮的乙酸(96％m/v)來調節溶液的pH以最小限度地稀釋水凝膠。所有的溶液是可溶的且易于注射。對于給定的分子量和取代度，例如，以“中等”分子量且質量比為0.133的CSS作為起始原料，能夠在寬pH范圍，例如7.2至8.0內獲得凝膠化性質。實施例8–降低取代的殼聚糖(CSS)的濃度同時保留溶液的凝膠化能力的能力在某些應用中，有時有利的是，形成低濃度(例如低于1％，例如0.85％)的取代的殼聚糖的最終溶液，同時保持在生理溫度，例如7.5下產生凝膠的能力。實施例9–商購產品以及取代的殼聚糖和GP的溶液在室溫下的可注射性該實施例旨在驗證該產品可通過裝配有小直徑針，如用于經由皮內或關節內途徑注射所用的針的注射器來容易地注射。具體地，重要的是，能夠容易地將該產品注射至小接合處(如手的接合處)中。根據本文中所述的方法來估算在室溫下，經由22號針在溶液注射期間注射該溶液所需的力。在注射器的活塞移動約15mm后，測量注射所需的力，從而能夠容易地對不同產品進行比較。測試商購的用于關節內注射的三種透明質酸溶液，并且將其與中等分子量且可變濃度的殼聚糖琥珀酰亞胺的溶液進行比較?？梢钥闯?，與透明質酸(A)的商購溶液相比，殼聚糖琥珀酰亞胺溶液能夠容易地通過22號針來注射；并且與透明質酸(C)的商購溶液相比，能夠更容易地注射。實施例10–基于透明質酸的商購產品的流動性以及基于殼聚糖琥珀酰亞胺的熱凝膠溶液的流動性根據前文所述的方法，通過ARES流變儀，在4℃至37℃范圍的溫度下，隨著時間測量基于透明質酸的商購產品的模量G’和模量G”。在60分鐘時，確定模量G’和模量G”的值(表11)。對于根據本發明的組合物，例如對于基于殼聚糖琥珀酰亞胺和GP且pH＝7.5的組合物，在幾秒后，模量G’與模量G”交叉，并且在交叉發生后，G’大于G”，表明了產品從4℃升溫至37℃時快速的溶膠-凝膠轉變。所測試的基于透明質酸的商購組合物并不發生熱凝膠化。實施例11–在前韌帶橫斷之后在兔子中進行關節內注射殼聚糖琥珀酰亞胺溶液的效果該實施例的溶液是滅菌的溶液，其中，該滅菌的溶液包括1.2％(m/m)的取代度為15％且具有中等分子量的殼聚糖琥珀酰亞胺(表2的編號CSS16)，3.5％(m/m)的GP，0.4％(m/m)的D-甘露醇以及11mmol/l的乙酸鈉三水合物。該溶液在高壓滅菌鍋中用蒸汽進行滅菌，以1.33的因子通過稀釋來調節濃度，并且隨后在注射器中調節(condition)該溶液。在滅菌和稀釋之后，在9℃下，pH等于7.5，滲透度等于380mosm/kg，以及表觀動態粘度等于126mPa.s。前韌帶的橫斷被稱為“前交叉韌帶斷裂ACLT”，在兔子中一貫且以良好記錄的方式引起骨關節病(OA)的癥狀改變，即，軟骨裂縫、滑膜的顯著損傷和炎癥，而就關節的整個高度而言不會產生任何軟骨的損失。該模型尤其用于研究新型療法，如關節內注射粘彈性補充劑對軟骨結構的影響，初始損傷可為高度可變的來源和性質(參見Lavertyetal.OsteoarthrCartil,2010；Edouardetal.PhysTherSport,2013；Mainil-Varletetal.Cartilage,2013；Oprenyeszketal.OsteoarthrCartil,2013)。在該模型中，在外科手術4周后，出現軟骨的侵蝕，其中，這些外科手術包括對右膝蓋的前韌帶的橫切。推薦的是，在該外科手術后8周，進行研究，從而給出在至少40％的股骨踝中得到軟骨侵蝕的可能性。在出現骨關節炎的第一跡象之后，即，對患有橫斷的膝蓋進行手術1周后，進行待測試產品的關節內注射。測試組的10只動物的右膝蓋接受注射600μl的待測試的熱凝膠溶液。“對照”組的9只動物的右膝蓋接受注射600μl的0.9％的鹽水溶液。產品經由具有22號針的注射器被注入到兔子的膝蓋的接合處。根據OARSI(Lavertyetal.OsteoarthrCartil2010)推薦的分數，通過檢查若干宏觀指標、組織學指標和放射學指標來表示產品減慢或停止手術誘導的關節病的進展的能力?；诠琴樅完P節間隙的存在，根據Kellgren&Lawrence量表評估關節的放射學結果。該研究是雙盲研究，即，無論進行手術以及注射待測試產品的外科醫生，還是在動物生命期間和在動物安樂死時刻進行宏觀觀察的人，還是分析宏觀結果或組織學結構且建立統計學計算的人都不知道動物數量和每個測試產品的組之間的對應關系。僅在由獨立的人完成且擬出計算后，才給出該對應關系。上述結果記載于表11至表13中。通過與注射鹽水溶液相比，熱凝膠溶液HG的注射給出了在8周時以統計學顯著的方式降低骨關節病的所有指標的可能性，如在放射性檢查中觀察到的關節間隙和骨贅存在的降低(表12，根據Kellgren&Lawrence量表)、關節側面出現的軟骨損失的嚴重性和尺寸的降低(表13)，以及滑膜炎性浸潤的減少(表14)來證實。相對于對照組，未檢測到熱凝膠溶液的不良副作用，表明了在所研究的條件下對產品的良好耐受性。實施例12至實施例24在實施例12至實施例24中，使用以下的方法和步驟：流動性質通過裝配有珀耳帖板(PeltierPlate)和溶劑阱的流變儀“DiscoveryHybridDHR-2”(TA儀器；例如參見：http://www.tainstruments.com)來測量流動性質。所使用的幾何形狀為直徑為25mm的鋼制珀耳帖板，且板和珀耳帖之間的距離設定為0.7mm。除了實施例12中所述的溫度掃描實驗之外，上述測量在37℃下進行。上述測量根據以下過程來進行：通過形變掃描來確定粘彈性線性區域首先進行形變掃描測試以確定在37℃下每種產品的粘彈性線性區域(LVER)。在低振蕩模式下進行頻率掃描在37℃下，在每個產品(0.9％的形變)的“LVER”區域中利用低振幅振蕩模式(小振幅振蕩剪切，SAOS)進行0.01rad/s和100rad/s之間的頻率掃描。相對于掃描頻率，測量以下特性：彈性模量(G’)、損耗模量(G”)、模量G’和模量G”的交叉頻率以及復合粘度(η*)。具體地，彈性模量G’的值在0.6Hz的頻率下確定，這對應了在行走期間施加到膝蓋的滑液上的頻率。流動掃描通過流體掃描模式來確定靜止時的粘度。在37℃下，使產品平衡1分鐘。施加0.001s-1至10s-1的剪切速率以相對于剪切速率來測量粘度。根據在該剪切速率范圍內所得到的曲線，通過在零剪切下的粘度值的外推來確定靜止時的粘度。在相關系數小于0.98的情況下，記錄在較低剪切速率(0.001s-1)下的粘度。取代度(NMR測量)在該實施例中，通過以下方法確定取代度：通過磁共振光譜儀，例如頻率400MHz的Bruker光譜儀，在水性介質的溶液中進行質子核磁共振(NMR)。通過以下的方法來制備樣品：將5mg至6mg的取代的殼聚糖溶解在1ml的氘化水中。2μl的氘化鹽酸或硼酸鈉加入到取代的殼聚糖的溶液中以使pH適用于分析。合適的pH范圍取決于取代基的性質，并且例如對于硼酸鈉可例如為8.5，對于12M的HCl則在3和4之間。在70℃的溫度下，64至256的掃描次數，且弛豫時間在1秒至8秒的范圍內，記錄光譜。對所得到的光譜進行解卷積以確定興趣信號的面積的積分值，從而能夠計算取代的殼聚糖的取代度。根據前文所述的方法來制備和表征在實施例12至實施例24中使用的取代的殼聚糖(表15)。通過在濃度為1％(v/v)乙酸中的濃度為1％(m/m)的殼聚糖溶液的粘度來限定殼聚糖的分子量。表15–取代的殼聚糖以及這些取代的殼聚糖的前體殼聚糖的特征*在取代反應期間基于目標值估算的取代度；**根據前文所述的方法通過質子NMR測量的取代度在下文的實施例中，根據以下過程制備取代的殼聚糖制劑：使取代的殼聚糖粉末溶解至目標濃度，含所需濃度的山梨醇或甘露醇；加入磷酸鹽緩沖液的母液(100mM)以得到介于280mosm/kg和400mosm/kg之間的滲透度；加入冰乙酸，直至得到7.2和8.5之間的pH。除非提及了“在高壓滅菌鍋滅菌之前”，所有以下的實施例涉及根據以下過程經高壓滅菌鍋滅菌的制劑：將該溶液放入合適的容器中，并且用高壓滅菌鍋在121℃下滅菌20分鐘。表16包括基于實施例12至實施例22所述的取代的殼聚糖的制劑的列表。表16–基于取代的殼聚糖的制劑實施例12–基于殼聚糖琥珀酰亞胺的制劑的熱凝膠化性質通過裝配有珀耳帖元件且平行鋼制板的幾何形狀為25mm的流變儀“DiscoveryHybridDHR-2”(TA儀器)以0.7mm的距離進行溫度的掃描以描繪基于殼聚糖琥珀酰亞胺的不同制劑的彈性模量(G’)和損耗模量(G”)依據溫度的時間依賴性變化(表17)。在將樣品放置在流變儀上期間，利用預剪切來進行溫度的升高以對樣品之間的差異進行標準化。根據每個測試的樣品來調整形變、升溫速率以及頻率(表17)。表17–不同溫度下，基于殼聚糖琥珀酰亞胺的制劑的彈性模量(G’)和損耗模量(G”)。從該實施例應當理解的是，對于基于殼聚糖琥珀酰亞胺的所有測試試劑來說，彈性模量G’從一定溫度開始變得大于損耗模量G”，這表明了制劑的熱凝凝膠化性質。G’與G”交叉的溫度隨制劑的組成以及殼聚糖琥珀酰亞胺的分子特性變化。實施例13–通過非常細的針(29號和30號)來注射低濃度取代的殼聚糖的制劑根據前文所述的方法，在距離為50μm且角度為0.04弧度下，在37℃，以10Hz的頻率，在3％的形變下，由具有“錐板”珀耳帖幾何形狀的ARES流變儀來測量基于取代的殼聚糖(琥珀酰亞胺和三甲基)的制劑的彈性模量(G’)和損耗模量(G”)(表18a)。如前文所述，利用具有轉子的粘度計(Brookfield)來測量動態粘度(表18a)。如前文所述，對通過29號和30號針注射制劑所需的力進行測量(表18b)。表18a–流動性質和粘度表18b–以牛頓表示的可注射性(注射所需的力)證實了：得到了通過極細的針能夠容易注射的制劑，例如，該制劑適用于皮下注射、皮內注射，或進一步用于在真皮上實施的微注射，尤其用于皮膚的復原，或進一步用于眼科的眼內(intra-camerular)注射，同時保持具有良好彈性和粘度的凝膠性質。實施例14–商購粘彈性補充劑的流動性質根據前文所述的方法，通過流變儀“DiscoveryHybridDHR-2”(TA儀器)在37℃以振蕩模式來測量用作粘彈性補充劑的基于未交聯的透明質酸的商購產品(VS1和VS2)的流動性質或基于經共價鍵交聯的透明質酸的商購產品(VS3)的流動性質。確定模量G’和G”之間的交叉頻率，在對應于行走時的頻率的0.6Hz下的G’值。根據前文所述的方法，在流動掃描模式下確定靜止時的粘度。表19–商購粘彈性補充劑的流動性質編號交聯的類型HA濃度交叉頻率(Hz)0.6Hz下的G’(Pa)靜止時的粘度(Pa.s)VS1未交聯2％5.2Hz114212VS2未交聯1％未交叉0.057VS3共價交聯0.8％未交叉114835從該實施例知曉的是，基于透明質酸的粘彈性補充劑的流動行為取決于它們的組成以及透明質酸的分子特性，尤其取決于通過共價鍵交聯的結構或無共價交聯的結構。實施例15–不同甘油磷酸鹽濃度的殼聚糖琥珀酰亞胺的制劑根據前文所述的方法，在37℃下通過流變儀“DiscoveryHybridDHR-2”(TA儀器)測量基于2％濃度的中等分子量的殼聚糖琥珀酰亞胺(編號CSS25)和可變濃度的甘油酸磷酸鹽(GP)的制劑的流動性質(表20)。表20–基于2％(m/m)的殼聚糖琥珀酰亞胺的制劑相對于GP濃度的流動性質從該實施例證實了：具有20％取代度和中等類型分子量的殼聚糖琥珀酰亞胺的溶液在未加入GP的情況下，可形成凝膠；凝膠的內聚力可通過加入增加濃度的GP而增加；當增加GP比例時，達到最大的潤滑能力(靜止時的粘度)。實施例16–基于可變取代度和濃度的殼聚糖琥珀酰亞胺的制劑如前文所述，從具有不同取代度(DS)(編號CSS26、CSS27、CSS28)且具有相同分子量(“中等”)的殼聚糖琥珀酰亞胺作為起始原料，但不加入GP來制備具有可變濃度的殼聚糖琥珀酰亞胺的溶液。根據前述所述的方法，利用流變儀“DiscoveryHybridDHR-2”(TA儀器)在37℃下測量上述制劑的流動性質(表21)。表21–基于殼聚糖琥珀酰亞胺的制劑相對于DS的流動性質*如前文所述估算的DS證實了：從具有20％、25％和30％的DS的CSS出發制備的所有的制劑均得到了凝膠；對于相同的分子量(中等)，通過改變DS和CSS濃度調節靜止時的內聚力和粘度。實施例17–基于殼聚糖琥珀酰亞胺和透明質酸的制劑如前文所述，制備2％(m/m)殼聚糖琥珀酰亞胺(編號CSS25)的溶液。通過使HA和甘露醇溶解在磷酸鹽緩沖液中來制備2％(m/m)透明質酸(HA)的溶液，以得到同滲容摩在280mosm/kg和400mosm/kg之間且pH在7.2和8.5之間。使用高分子量的HA(編號H34，特性粘度為3m3/kg，由供應商提供)或使用低分子量的HA(編號H22，特性粘度為1.55m3/kg)。隨后，將溶液以不同的質量比例混合。如前文所述，用高壓滅菌鍋對它們進行滅菌。根據前文所述的方法，利用流變儀“DiscoveryHybridDHR-2”(TA儀器)在37℃下測量制劑的流動性質(表22)。表22–基于殼聚糖琥珀酰亞胺和透明質酸的制劑的流動性質從上述結果知曉的是，通過CSS和HA的混合物所形成的凝膠的流動性質可通過濃度、CSS和HA之間的比例以及HA的特性粘度來調節。高粘度的HA給出了在操作頻率(0.6Hz)下得到具有最高G’和動態粘度的凝膠的可能性。此外，在一定條件下，模量G’和模量G”之間沒有交叉，表明了凝膠的形成與剪切頻率無關。實施例18–與關節炎患者的滑液的協同作用經患者同意，在植入假體之前，對受關節炎影響的四個自愿成人患者的膝蓋的滑液(SF)進行取樣(SF1至SF4)。將其與基于殼聚糖琥珀酰亞胺的不同溶液或與不同商購粘彈性補充劑以1/1的質量比進行混合，并且隨后根據前文所述的方法，在37℃下通過流變儀“DiscoveryHybridDHR-2”(TA儀器)來測量混合物的流動性質(表23)。表23–受關節炎影響的四個患者膝蓋的滑液以及殼聚糖琥珀酰亞胺制劑或商購粘彈性補充劑在以體積比50/50(v/v)與滑液混合前后的流動性質。由該實施例證實了：受關節炎影響的患者的膝蓋處的滑液是具有低流動性質的凝膠；基于殼聚糖琥珀酰亞胺的粘彈性補充劑和制劑具有優越的性質；基于HA的粘彈性補充劑在與SF進行稀釋時，流動性質下降；基于CSS的制劑在滑液中稀釋之后，保持它們的凝膠性質；與基于交聯或未交聯的HA的商購粘彈性補充劑不同，基于CSS的制劑通過與受關節炎影響的自愿成人的滑液混合而具有增強的流動性質。這很有可能是由于與滑液的成分，例如透明質酸或聚集蛋白聚糖之間的相互作用。實施例19–由若干批次的殼聚糖琥珀酰亞胺作為起始原料，制備基于殼聚糖琥珀酰亞胺的制劑的再現性。如前文所述，以具有相似取代度19％至28％且相似分子量(中等)的不同批次的CSS(編號，CSS22、CSS24、CSS25、CSS29和CSS30)作為起始原料，來制備具有可變濃度的殼聚糖琥珀酰亞胺溶液，不含GP。根據前文所述的方法，在高壓滅菌之前或之后，在37℃下通過流變儀“DiscoveryHybridDHR-2”(TA儀器)來測量它們的流動性質(表24a和表24b)。表24a–在高壓滅菌之前表24b–在高壓滅菌之后從該實施例觀察到：高壓滅菌處理保持了凝膠的性質、彈性模量以及制劑在靜止時的粘度；從若干批次的不同CSS為起始原料，能夠以再現的方法制備流動性質和可注射性質相似的制劑，其中，這些CSS源自于不同批次的具有“中等”分子量范圍的殼聚糖。實施例20–殼聚糖琥珀酰亞胺制劑和商購粘彈性補充劑的可注射性根據前文所述的方法來測量用于通過用于注射不同類型且適用于關節內注射的針來注射基于琥珀酰亞胺殼聚糖的不同制劑和基于商購粘彈性補充劑的不同制劑所需的力(表25)。實施例23中限定了不同類型針的尺寸。表25–通過各種尺寸用于注射的針注射制劑所需的力(牛頓)*存在凝膠塊從該實施例知曉的是：基于殼聚糖琥珀酰亞胺的凝膠制劑在室溫下通過細針能夠容易地注射，同時在37℃的生理溫度下具有高流動特性。實施例21–在氧化應激條件下，在體外對降解的敏感性在該實施例中，根據由Mendoza等人的出版物(CarbRes342,96,2007)所改編的過程，將基于殼聚糖琥珀酰亞胺的制劑和基于商購粘彈性補充劑的制劑置于用于模擬炎性環境的體外氧化應激條件下。該過程為：通過銅離子和過氧化氫之間的Femton反應產生游離羥基自由基，以及將凝膠在37℃下放置24小時。對該凝膠取樣，并且測量凝膠的彈性模量G’和動態粘度，以表征孵育的影響。簡而言之，將800μg的基于殼聚糖琥珀酰亞胺的凝膠制劑或基于商購粘彈性補充劑的制劑置于試管中。加入100μg的濃度為220μM的EDTA溶液和70μg的濃度為1mM的硫酸銅溶液。使混合物均質化并且將該混合物在37℃孵育24小時。加入30μg的0.03M的過氧化氫溶液，隨后以不同的時間間隔對溶液取樣，并且根據前文所述的方法，利用流變儀DiscoveryHR-2(TA)在37℃下測量流動性質。根據式1和式2分別計算相對彈性模量(G’R)和相對動態粘度(ηR)：式1：G’R＝在時間t時的G’/在時間為零時的G’x100(表26a)式2：ηR＝在時間t時的η/在時間為零時的ηx100(表26b)表26a–在0.6Hz(3.98rad/s)頻率下，凝膠的相對彈性模量(G’R)相對于在氧化性介質中的孵育時間制劑(編號)類型0hr2hr4hr24hr017-008凝膠CSS(2％)100％127％125％92％014-084凝膠CSS(1％)/HA(1％)100％99％42％51％VS1基于未交聯的HA的粘彈性補充劑100％45％9％14％VS3基于交聯的HA的粘彈性補充劑100％78％11％10％表26b–凝膠的相對動態粘度(ηR)相對于在氧化性介質中的孵育時間制劑(編號)0hr2hr4hr24hr017-008100％129％128％92％014-084100％99％46％51％VS1100％51％22％13％VS3100％86％14％10％相對于基于交聯的透明質酸的商購制劑(VS2)或基于未交聯的透明質酸的商購制劑(VS1)，該實施例的基于CSS的凝膠制劑顯著地更加耐受氧化性介質中的降解，并且它們保持了吸收沖擊的能力(G’)以及長時間、至少24小時的潤滑能力(η)。實施例22–β-甘油磷酸鈉的水性溶液的滲透度使10g的β-甘油磷酸鈉溶解在100ml的滲透水中。攪拌該溶液直至全部溶解，并且隨后通過加入水來稀釋至不同的濃度。根據前文所述的方法測量溶液的滲透度(表27)。表27–β-甘油磷酸鈉溶液(GP)在水中的滲透度GP濃度(g/100ml)滲透度(mosmol/kg)2％1554％2966％4387％5128％5909％65810％745因此，應當注意的是，在這種組合物中，滲透度隨著甘油磷酸鹽濃度的增加而增加。因此，包括大于10％的甘油磷酸鹽的組合物具有的滲透度超過用于本發明的預期應用所需的滲透度。具體地，在YUHUAChang等人的出版物(“PreparationandpropertiesofanovelthermosensitiveN-trimethylchitosanhydrogel,PolymerBulletin”,Springer,Berlin,DE,63,531)和WUJ.等人的出版物(Athermo-andpH-sensitivehydrogelcomposedofquaternizedchitosan/glycerophosphate,InternationalJournalofPhamarmaceutics,Elsevier,BV,NL,315,No1-2,pages1-11)中描述了包括超過10質量％的甘油磷酸鹽的組合物。因此，這些組合物的滲透度大于700mosmol/kg，并且遠遠超過500mosmol/kg?？商貏e提及涉及產品的健康安全性的文獻(SavientPharmaceuticals,Inc.；滲透度為258-381mosm/kg)以及Negoro等人(Effectofosmolarityonglycosaminoglycanproductionandcellmetabolismofarticularchondrocyteunderthree-dimensionalculturesystem,ClinicalandExperimentalRheumatology2008,26,534-541)描述滲透度范圍的重要性的文獻。約400mosm/kg的滲透度是治療性優異的值，因為其對于細胞(諸如軟骨細胞、骨細胞和纖維母細胞)的增殖具有強烈的影響。實施例23–用于注射的針的直徑ISO9262:1991和修訂ISO9262:1991/Amd.1:2001(E)限定了用于注射的針的尺寸。外徑固定為公差值(最小-最大范圍)，而針的內徑取決于壁的厚度，壁的厚度根據針的類型和應用分為正常厚度(“正常壁”)、薄厚度(“薄壁”)或超薄(超薄壁)。表28重復示出了可商購的針類型的外壁(最小/最大)和最小內徑。表28–根據ISO9262:1991/Amd.1:2001(E)標準，用于注射的不同厚度的針的范圍以及內徑和外徑的公差*供參考實施例24–用于注射的針的類型的推薦表29列舉了在注射用于修復、治療或填充的不同商購產品的情況下，所推薦的針的類型，例如關節內途徑注射不同商購粘彈性補充劑產品中推薦使用的針的類型，經由皮內或皮下途徑注射用于填充真皮的商購產品中推薦使用的針的類型，經由表面真皮內途徑注射商購產品以用于使皮膚再生中推薦使用的針的類型或進一步地經由眼內途徑在眼科注射中推薦使用的針的類型。這些類型針的內徑和外徑示出在實施例23中。表29–根據注射部位和類型以及相關的產品，通過注射給藥所推薦的針的類型產品注射的類型和部位推薦的針的尺寸關節內粘彈性補充劑(VS1)關節內注射/膝蓋19號至21號關節內粘彈性補充劑(VS2)關節內注射/膝蓋20號關節內粘彈性補充劑(VS3)關節內注射/膝蓋18號至21號關節內粘彈性補充劑(VS4)關節內注射/手指19號至25號通過關節鏡檢查修復軟骨*關節鏡檢查/膝蓋、臀部18號基于交聯透明質酸的皺紋填充皮內注射/面部25號至27號基于生物可吸收微粒的皺紋填充皮內注射/面部26號基于未交聯透明質酸的恢復活力皮下或皮內注射/面部、手、頸部30號至32號**抗生素(Antibioprophylaxy)眼內注射/眼睛的眼前房30號*參見:Stanish等人.2006；**例如BD銷售的“筆針”型Micro-FineTMUltra4mm(32號)的針。當前第1頁1 2 3