本發明涉及一種明膠多孔微載體、基因重組明膠多孔微載體的調制方法及多孔微載體的應用。

背景技術：

人或動物的身體受到損傷時，為小規模的組織損傷時，則通常能夠利用自身原本具備的修復系統進行修復。然而，伴隨心肌梗塞或外傷之類的嚴重的組織損傷的損傷常會超過自身的再生能力。為嚴重的組織損傷時，需要幫助組織修復的處理。

作為由廣泛的組織損傷產生的問題之一，存在如何關閉或填充所產生的空間或孔這樣的問題點。考慮到該問題，能夠使用支架作為用于填充到組織所缺損的部位的空間或孔中的(半)永久性填充材料。并且，支架還能夠作為用于放出生長因子和藥品的、或用于運送細胞的緩釋儲存場所來使用。通過在對身體注射或移植細胞之前在支架上預先播種所期望的細胞，從而能夠進行細胞運輸。

明膠經常以多孔微載體等方式被用作支架的構成材料。因此，明膠多孔微載體的產品引人注目。

專利文獻1(wo03/104313)中提出有一種天然明膠多孔微載體的調制方法，其中，尼爾森(nilsson)能夠用作組織再生的支架。尼爾森的調制方法包括兩個階段的乳化工序，在每一個工序中，使用hlb值(hydrophilic-balance)被規定的表面活性劑。尼爾森在第一乳化工序中，對包含hlb值大于9的乳化劑的均勻的水溶性明膠溶液進行調制，并添加包含有機溶劑及hlb值大于9的乳化劑的第一組合物。并且，尼爾森在第二乳化工序中，添加包含有機溶劑及hlb值小于8的乳化劑的第二組合物，將明膠材料進行冷卻并使其凝固，最終獲得微載體。

技術實現要素：

發明要解決的技術課題

在本發明人等的研究中，本研究人員等通過尼爾森等的天然明膠的方法，從基因重組明膠中，試圖調制多孔微載體。然而，將尼爾森的方法用于基因重組明膠時，獲得攪拌粉末之類的粒子或不均勻的粒子的塊，對于細胞培養，均為不理想。因此，本發明的課題在于提供一種能夠獲得具有特有的性質及粒度分布的多孔微載體的調制方法。

并且，在本發明人等的研究中，本研究人員等本研究者嘗試對具有經改善的細胞增殖特性的多孔微載體進行調制。因此，本發明的課題在于提供一種具有優異的細胞增殖特性的明膠多孔微載體。

用于解決技術課題的手段

本發明人等進行了深入研究，其結果令人驚奇的是本發明人等發現了，能夠通過實施第二乳化工序來獲得具有細胞增殖優異的性質的基因重組明膠多孔微載體，所述第二乳化工序中，改變尼爾森等上述方法，并使用幾乎不包含或完全不包含hlb小于8的乳化劑的非水溶性液體。該發現是與在第二乳化工序中使用顯著量的乳化劑的尼爾森的方法完全相反的見解。并且，如以下所詳述，為了提供為了基因重組明膠而從以前未知的特有的性質及粒度分布的多孔微載體而能夠使用尼爾森的方法中的該變更。

并且，本發明人等驚奇地發現，具有如后述那樣定義的特性的微載體能夠通過上述方法等進行調制，相比于可在市面上獲得的微粒子具有特別優異的細胞增殖特性。

[1]一種基因重組明膠多孔微載體的調制方法，其包括：工序(a)，混合包含水、基因重組明膠、非水溶性液體及乳化劑的組合物，生成第一乳液；工序(b)，以比明膠的凝膠化溫度高的溫度混合上述第一乳液和非水溶性液體，生成第二乳液；及工序(c)，將第二乳液冷卻至明膠凝固的溫度，上述工序(b)中所使用的非水溶性液體包含含量小于0.5重量％的hlb值小于8的乳化劑。

[2]根據[1]所述的多孔微載體的調制方法，其中，上述工序(b)中所使用的非水溶性液體不包含hlb值小于8的乳化劑。

[3]根據[1]所述的多孔微載體的調制方法，其中，上述工序(b)中所使用的非水溶性液體不包含乳化劑。

[4]根據[1]～[3]中任一個所述的多孔微載體的調制方法，其中，上述工序(a)中所使用的乳化劑的hlb值大于9。

[5]根據[1]～[4]中任一個所述的多孔微載體的調制方法，其中，上述第一乳液的ph在3～11的范圍內。

[6]根據[1]～[5]中任一個所述的多孔微載體的調制方法，其中，上述基因重組明膠的等電點至少為5。

[7]根據[1]～[6]中任一個所述的多孔微載體的調制方法，其中，上述基因重組明膠不包含羥基脯氨酸。

[8]根據[1]～[7]中任一個所述的多孔微載體的調制方法，其還包括從第二乳液中去除已凝固的明膠的工序(d)。

[9]根據[1]～[8]中任一個所述的多孔微載體的調制方法，其中，上述基因重組明膠包含至少3個rgd基序。

[10]根據[1]～[9]中任一個所述的多孔微載體的調制方法，其中，上述基因重組明膠包含至少兩個賴氨酸殘基，兩個賴氨酸殘基為末端的賴氨酸殘基，第一末端的賴氨酸殘基為最靠近明膠的n末端的賴氨酸殘基，第二末端的賴氨酸殘基為最靠近明膠的c末端的賴氨酸殘基，上述末端的賴氨酸殘基與明膠中的總氨基酸殘基數相差至少25％。

[11]根據[1]～[10]中任一個所述的多孔微載體的調制方法，其中，上述工序(b)中上述非水溶性液體的體積大于上述第一乳液的體積。

[12]根據[1]～[11]中任一個所述的多孔微載體的調制方法，其中，上述工序(c)中以0.1～20℃/分鐘進行冷卻。

[13]根據[1]～[12]中任一個所述的多孔微載體的調制方法，其中，上述第一乳液包含至少1～15重量％的基因重組明膠。

[14]根據[1]～[13]中任一個所述的多孔微載體的調制方法，其中，上述工序(a)中所使用的組合物包含：1～15重量％的基因重組明膠；10～70重量％的水；20～90重量％的非水溶性液體；及0.5～20重量％的乳化劑。

[15]根據[1]～[14]中任一個所述的多孔微載體的調制方法，其還包括在上述工序(b)中和/或工序(b)之后交聯明膠的工序。

[16]根據[1]～[15]中任一個所述的多孔微載體的調制方法，其還包括在上述工序(b)之后進行明膠的脫水熱交聯的工序。

[17]一種基因重組明膠多孔微載體，其通過[1]～[16]中任一個所述的多孔微載體的調制方法而獲得。

[18]根據[17]所述的基因重組明膠多孔微載體，其具倍具有至少5μm的平均直徑的表面孔，并具有至少50體積％的平均空隙率。

[19]根據[17]或[18]所述的基因重組明膠多孔微載體，其中，平均粒徑為20～800μm。

[20]根據[17]～[19]中任一個所述的基因重組明膠多孔微載體，其中，平均密度為0.04～0.5g/cm³。

[21]根據[17]～[20]中任一個所述的基因重組明膠多孔微載體，其中，平均體積為2～25cm³/g。

[22]根據[18]～[21]中任一個所述的基因重組明膠多孔微載體，其通過[1]～[16]中任一個所述的多孔微載體的調制方法而獲得。

[23]根據[17]所述的基因重組明膠多孔微載體，其中，平均粒徑為20～800μm，至少80％的微載體具有平均粒徑的30％～200％的粒徑。

[24]一種[17]～[23]中任一個所述的基因重組明膠多孔微載體作為細胞載體的應用。

[25]一種[17]～[23]中任一個所述的基因重組明膠多孔微載體作為用于修復組織損傷的支架的應用。

[26]一種復合材料，其包含[17]～[23]中任一個所述的基因重組明膠多孔微載體及細胞，上述細胞存在于上述微載體的表面和/或內部。

[27]一種注射用組合物，其包含藥理學上可接受的載體及[17]～[23]中任一個所述的基因重組明膠多孔微載體或[26]所述的復合材料。

[28]根據[27]所述的注射用組合物，其能夠通過具有80～4000μm的內部口徑的注射器進行注射。

[29]一種明膠多孔微載體，其具有空隙，至少一半的上述空隙為球狀和/或至少一半的上述空隙相對于平均空隙直徑具有-30％～+30％的直徑。

[30]根據[29]所述的微載體，其具有表面孔，所述表面孔具有至少5μm的平均直徑。

[31]根據[29]或[30]所述的微載體，其具有至少50體積％的平均空隙率。

[32]根據[29]～[31]中任一個所述的微載體，其中，上述空隙的平均直徑在微載體的平均粒徑的5～25％的范圍。

[33]根據[29]～[32]中任一個所述的微載體，其中，平均粒徑為20～800μm。

[34]根據[29]～[33]中任一個所述的微載體，其中，平均密度為0.04～0.5g/cm³。

[35]根據[29]～[34]中任一個所述的微載體，其中，平均體積為2～25cm³/g。

[36]根據[29]～[35]中任一個所述的微載體，其中，平均粒徑為20～800μm，至少80％的微載體具有平均粒徑的30％～200％的粒徑。

[37]根據[29]所述的微載體，其具有：具有至少5μm的平均直徑的表面孔；至少50體積％的平均空隙率；及20～800μm的平均粒徑，且至少一半以上的空隙為球狀，至少80％的微載體具有平均粒徑的30％～200％的粒徑，空隙的平均直徑在微載體的平均粒徑的5～25％的范圍。

[38]根據[29]所述的微載體，其具有：具有至少5μm的平均直徑的表面孔；至少50體積％的平均空隙率；及20～800μm的平均粒徑，且至少一半以上的空隙具有相對于平均空隙直徑為-30％～+30％的直徑，至少80％的微載體具有平均粒徑的30％～200％的粒徑，空隙的平均直徑在微載體的平均粒徑的5～25％的范圍。

[39]根據[37]或[38]所述的微載體，其中，至少75％的空隙為球狀。

[40]根據[29]～[39]中任一個所述的微載體，其中，上述明膠為基因重組明膠。

[41]根據[29]～[40]中任一個所述的微載體，其中，上述明膠為等電點至少為5的基因重組明膠。

[42]根據[29]～[41]中任一個所述的微載體，其中，上述明膠為不包含羥基脯氨酸的基因重組明膠。

[43]根據[29]～[42]中任一個所述的微載體，其中，上述明膠為包含至少3個rgd基序的基因重組明膠。

[44]根據[29]～[43]中任一個所述的微載體，其中，上述明膠為如下基因重組明膠：包含至少兩個賴氨酸殘基，兩個賴氨酸殘基為末端的賴氨酸殘基，第一末端的賴氨酸殘基為最靠近明膠的n末端的賴氨酸殘基，第二末端的賴氨酸殘基為最靠近明膠的c末端的賴氨酸殘基，上述末端的賴氨酸殘基與明膠中的總氨基酸殘基數相差至少25％。

[45]一種根據[29]～[44]中任一個所述的微載體作為細胞載體的應用。

[46]一種根據[29]～[44]中任一個所述的微載體作為用于修復組織損傷的支架的應用。

[47]一種復合材料，其包含[29]～[44]中任一個所述的微載體及細胞，上述細胞存在于上述微載體的表面和/或內部。

[48]一種注射用組合物，其包含藥理學上可接受的載體及[29]～[44]中任一個所述的微載體或[47]所述的復合材料。

[49]根據[47]所述的注射用組合物，其能夠通過具有80～4000μm的內部口徑的注射器進行注射。

發明效果

根據本發明的基因重組明膠多孔微載體的調制方法，能夠提供如以下詳述為了基因重組明膠而具有從以前未知的特有的性質及粒度分布的多孔微載體。

并且，本發明的明膠多孔微載體相比于可在市面上獲得的微粒子具有特別優異的細胞增殖特性。

附圖說明

圖1中，圖1a～1c表示工序(b)中所使用的非水溶性液體包含含量小于0.5重量％的hlb值小于8的乳化劑的、通過本發明的方法所獲得的微載體的sem(scanningelectronmicroscope：掃描型電子顯微鏡)照片。

圖2中，圖2a～2c表示工序(b)中所使用的非水溶性液體包含含量為0.5重量％以上的hlb值小于8的乳化劑的、從本發明的方法改變之后的比較例的微載體的sem照片。

圖3中，圖3a～3c表示可從ge公司購買的市售的cultispherg(注冊商標)微載體的sem照片。

圖1a表示50倍的放大率下的、通過本發明的方法所獲得的微載體的概觀。圖1a的微載體適當地為球狀，具有狹窄范圍的尺寸分布，幾乎不存在或完全不存在粒子聚在一起的塊。圖1b表示230倍的高放大率下的通過本發明的方法所獲得的微載體，能夠明確地觀察表面孔(1)。表面孔(1)與微粒子內的空隙相連(這些內部空隙在該照片中無法看到)。圖1c為通過本發明的方法所獲得的微載體的剖視圖，并表示內部空隙(2)，至少一半的空隙為球狀，并且至少一半的上述空隙具有相對于平均空隙直徑為-30％～+30％的直徑。并且，表示內部空隙比以圖2c及圖3c的比較例的微載體所表示的、所對應的剖視圖的內部空隙大。另外，圖1c的空隙(2)大致為球狀，在球狀的空腔彼此重復或接觸時與相鄰的空隙結合的空隙的壁中具有小的細孔。空隙(2)在與微載體的大小的關系中大致較大，且具有狹窄范圍的尺寸分布(例如，空隙(2)分別為大致相同的大小)。

本發明的微載體能夠提供伴隨在細胞量及細胞率的觀點來看良好的細胞增殖的細胞培養，尤其能夠在維持培養的微載體的懸浮的動態的細胞培養中適當地使用，操作也容易。

圖2a為100倍的放大率下的通過上述比較例的方法所獲得的微載體的概觀。比較例的微載體為如實施例的項目中詳細記載那樣工序(b)的玉米油包含5重量％的hlb值小于8的乳化劑的通過其他方法所獲得的微載體。圖2a的微載體的大部分分別一同成為塊，其結果，形成不一樣的形狀的二次粒子，并具有廣范圍的尺寸分布。圖2b為750倍的放大率下的通過比較例的方法所獲得的微載體。比較例的微載體為非球狀的形狀，并具有較大的表面孔(3)，分別一同成為塊，形成二次結構。圖2c為通過比較例的方法所獲得的微載體的剖視圖，并且可知內部空隙(4)在大小、形狀的觀點出發為不規則，其中大多與圖1b所示的本發明的微載體相比，相對于微載體的直徑非常小。另外，圖2c的微粒子中的空隙(4)具有非常廣范圍的尺寸分布。圖2c的大部分空隙(4)不是球狀，不到一半的該空隙具有相對于平均空隙直徑為-30％～+30％的直徑。

圖3a是50倍的放大率下的、市售的cultispherg(注冊商標)微載體的概觀。圖3b為600倍的放大率下的一個cultispherg(注冊商標)微載體，能夠明確地觀察表面孔(5)。圖3c是300倍的放大率下的cultispherg(注冊商標)微載體的剖視圖。與圖1c相比，圖3c所示的cultispherg(注冊商標)微載體內的空隙(6)為不規則的大小和形狀，大多數比起球狀的空隙，倒不如為圓筒狀或管狀的孔。圖3c所述的多數空隙(6)比微載體的粒徑小，并且與圖1c的微載體相比，為廣范圍的尺寸分布。如此一來，圖3c的大部分空隙(6)不是球狀，不到一半的該空隙具有相對于平均空隙直徑為-30％～+30％的直徑。

具體實施方式

本說明書中所使用的術語“基因重組明膠”包括基因重組膠原，術語“明膠”包括膠原。因此，在本說明書中，術語“明膠”、“膠原”、“膠原多肽”及“明膠多肽”以相同的意義使用。

空隙有時記載為空間或空腔。

本發明所涉及的基因重組明膠中，平均分子量優選小于150kda，更優選小于100kda，并且優選為至少5kda，更優選為至少10kda，進一步優選為至少30kda。基因重組明膠的平均分子量的優選范圍為50kda～100kda、20kda～75kda及5kda～40kda。為了低粘度而需要高質量濃度的明膠時，優選更低的分子量。并且，本發明的明膠多孔微載體的明膠不限定于基因重組明膠，明膠的平均分子量的優選范圍是與上述基因重組明膠相關的記載相同的范圍。

另外，本發明所涉及的明膠優選為基因重組明膠。

基因重組明膠在市面上能夠購買例如fujifilmcorporation制造的明膠。基因重組明膠能夠利用已知的方法進行調制，例如，能夠使用專利申請ep0926543、ep1014176中所記載的方法，該方法的內容通過參考包含于本說明書中。調制基因重組明膠的方法“highyieldsecretionofrecombinantgelatinsbypichiapatoris，m.w.t.wertenetal.yeast15，1087-1096(1999)”也有記載。優選的基因重組明膠在wo2004/85473中也有記載。

作為一實施方式，能夠舉出如下：基因重組明膠包含至少兩個賴氨酸殘基，兩個賴氨酸殘基為末端的賴氨酸殘基(extremelysineresidue)，第一末端的賴氨酸殘基為最靠近明膠的n末端的賴氨酸殘基，第二末端的賴氨酸殘基為最靠近明膠的c末端的賴氨酸殘基，末端的賴氨酸殘基脫離明膠中的總氨基酸殘基數的至少25％。這種基因重組明膠例如能夠通過us2009/0246282中所記載的方法獲得。

另外，作為本發明的其他實施方式，能夠舉出如下：基因重組明膠包含至少兩個氨基酸殘基，該兩個氨基殘基為末端的氨基酸殘基(extremeaminoacidresidue)，它們分別獨立地選自天冬氨酸殘基及谷氨酸殘基，第一末端的天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基為最靠近多肽的n末端的天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基，第二末端的天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基為最靠近多肽的c末端的天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基，這些末端的天冬氨酸殘基和/或谷氨酸殘基脫離基因重組明膠多肽中的總氨基酸殘基數的至少25％。另外，作為本發明的其他實施方式，基因重組明膠為在上述末端的天冬氨酸殘基和/或谷氨酸殘基具有至少一個天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的明膠。

作為一實施方式，基因重組明膠的多肽尤其在不是高于5℃的溫度，或高于25℃的溫度下不形成穩定的三股螺旋。

本發明所涉及的基因重組明膠優選在相當于哺乳動物或魚等源自低溫動物的明膠的gxy三聯體中包含脯氨酸。

為了防止穩定的三股螺旋的形成，優選小于2％，更優選小于1％的存在于基因重組明膠中的氨基酸優選為具有羥基的氨基酸。羥基脯氨酸的存在能夠通過并不共表達進行脯氨酸殘基的羥基化的酶的微生物中的發現、或利用其他方法滿足該作用來防止。實際上所謂0是指酵母等的生長培養基中的羥基脯氨酸的存在導致幾個這些氨基酸摻入到明膠中。

作為優選的實施方式，基因重組明膠具有優異的細胞粘接特性，優選不表示任何健康相關的風險。這個情況能夠通過使用增加了rgd的基因重組明膠、例如rgd基序相對于氨基酸的總數的比例至少為0.4的基因重組明膠來實現。如果增加了rgd的明膠具有350以上的氨基酸時，優選350個氨基酸的各范圍具有至少一個rdg基序。rgd基序的比例優選至少為0.6，更優選至少為0.8，進一步優選至少為1.0，進一步優選至少為1.2，最優選至少為1.5。

rgd基序的比例0.4每250個氨基酸與一個rgd序列對應。rgd基序的數為整數，因此，為了至少對應于0.4％，包含251個氨基酸的明膠必須具有至少兩個rgd序列。增加了rgd的基因重組明膠優選每250個氨基酸具有至少兩個rgd，更優選每250個氨基酸具有至少3個rgd，最優選每250個氨基酸具有至少4個rgd。作為其他實施方式，增加了rgd的明膠具有至少4個rgd基序，優選具有至少6個rgd基序，更優選具有至少8個rgd基序，最優選具有至少12～16個rgd基序。

本發明所涉及的基因重組明膠優選為源自膠原序列。對膠原進行編碼的核酸大體記載于公知文獻中(例如參考fullerandboedtker(1981)biochemistry20：996-1006；sandelletal.(1984)jbiolchem259：7826-34；kohnoetal.(1984)jbiolchem259：13668-13673；frenchetal.(1985)gene39：311-312；metsarantaetal.(1991)jbiolchem266：16862-16869；metsarantaetal.(1991)biochimbiophysacta1089：241-243；woodetal.(1987)gene61：225-230；glumoffetal.(1994)biochimbiophysacta1217：41-48；shiraietal.(1998)matrixbiology17：85-88；trompetal.(1988)biochemj253：919-912；kuivaniemietal.(1988)biochemj252：633640；andala-kokkoetal.(1989)biochemj260：509-516)。

增加了rgd基序的基因重組明膠例如能夠通過us2006/0241032中所記載的通常的方法來調制。

為了用于醫藥或醫療用途，優選為具有與天然人膠原的氨基酸序列接近或相同的氨基酸序列的基因重組明膠明膠的氨基酸序列更優選為包括位于天然人膠原的重復氨基酸序列、尤其為了制作增加了rgd的基因重組明膠而包含rgd基序的序列的明膠。所選擇的序列中的rgd基序的比例依賴于所選擇的序列的所選擇的長度，更短序列的選擇必然帶來最終基因重組明膠更高的rgd基序的比例。所選擇的氨基酸序列的重復使用能夠為了提供具有比天然明膠高的分子量的基因重組明膠而使用。另外，與天然明膠相比，能夠獲得非抗原性且增加了rgd的基因重組明膠。

因此，作為優選的實施方式，基因重組明膠包括一部分天然人膠原序列。明膠優選為增加了包含至少80％的一個以上的天然人體明膠氨基酸序列的一個以上的部位的rgd的明膠。人體明膠序列的這種部位分別具有優選至少30個氨基酸的長度，更優選至少45個氨基酸的長度，進一步優選至少60個氨基酸的長度，例如具有240個為止的長度，優選150個為止的長度，更優選120個為止的長度，每一個部位優選包括一個以上的rgd序列。增加了rgd的明膠優選包括一個以上的天然人膠原序列的一個以上的部位。

適合于本發明的方法中所使用的基因重組明膠的起源的例為人col1a1-1。包括rgd序列的250個氨基酸的部位記載于wo04/85473中。基因重組明膠的rgd序列能夠與被稱作整合素的細胞表面上的特定的受體結合。

增加了rgd的明膠例如能夠通過ep-a-0926543、ep-a-1014176或wo01/34646、尤其最初的兩個專利公開公報的實施例中記載的基因重組方法來制造。制造增加了rgd的基因重組明膠的優選的方法包括以對包括rgd氨基酸序列的對一部分膠原蛋白進行編碼的天然核酸序列開始的方法。通過重復該序列，能夠獲得增加了rgd的基因重組明膠。

這樣一來，基因重組明膠能夠通過利用適當的微生物表達對明膠進行編碼的核酸來制造。該方法能夠在真菌細胞或酵母細胞中適當地進行。宿主細胞適合為漢遜酵母屬(hansenula)、木霉屬(trichoderma)、曲霉屬(aspergillus)、青霉屬(penicillium)、酵母屬(saccharomyces)、克魯維酵母屬(kluyveromyces)、脈孢菌(neurospora)或畢赤酵母屬(pichia)等高表達的宿主細胞。由于它們不易受到重復的序列的不適當的表達，因此真菌及酵母細胞比細菌優選。宿主更優選不具有攻擊明膠結構的表達的高級蛋白酶。在這一點上，畢赤酵母屬(pichia)或漢遜酵母屬(hansenula)能夠列舉為非常合適的表達系統的例。作為表達系統，畢赤酵母屬表達系統(pichiapastoris)的應用在ep0926543及ep1014176中有公開。微生物能夠消除特定的如脯氨酸的羥基化、賴氨酸的羥基化等翻譯之后的處理機構的活化。代替宿主系統能夠通過將明膠高效地進行羥基化而具有內源性的脯氨酸羥基化活性。

作為其他實施方式，基因重組明膠具有例如170℃以上，尤其180度以上比天然明膠更高的玻璃化轉變溫度(tg)。具有比天然明膠高的tg的基因重組明膠在wo05/11740中有記載。

作為另一實施方式，基因重組明膠具有比天然明膠低的糖基化，例如小于2重量％，優選小于1重量％，更優選小于0.5重量％，進一步優選小于0.2重量％，進一步優選小于0.1重量％的糖基化。作為優選的實施方式，基因重組明膠不具有糖基化。糖基化的重量％的程度是指明膠的每單位重量的總碳水化合物(carbohydrate)重量，例如通過基于maldi-tof-ms(matrixassistedlaserdesorptionionizationmassspectrometry)或杜布瓦(dubois)滴定法來確定。術語“糖基化”不僅是指單糖，還指多糖、例如二-、三-及四-糖類。

有糖基化較少或丟失這樣的方法。糖基化是翻譯后的修飾，由此，碳水化合物與存在明膠的氨基酸共價鍵和。氨基酸序列及宿主細胞(及酶，尤其糖基轉移酶)確定糖基化的程度。有兩種類型的糖基化，n―糖基化將gicnac(n-actylglucosamine)與天冬酰胺(n或asn)的酰胺基建立關聯，由此開始，o-糖基化通常將gainac與氨基酸的絲氨酸(s或ser)或蘇氨酸(t或thr)建立關聯。

因此，通過修飾或選擇缺失由適當的表達宿主的選擇和/或宿主的糖基轉移酶所識別的共有部位的序列，糖基化能夠得到控制，尤其是減少或防止。明膠的化學合成也能夠為了調制未糖基化的明膠而使用。使用已知的方法，包含糖基化的基因重組明膠在生成之后，去除全部或大部分的碳水化合物、或能夠將未經糖基化的明膠從經糖基化的明膠分離。

作為其他優選的實施方式，基因重組明膠的小于10％、優選小于5％的氨基酸殘基為羥基脯氨酸。優選基因重組明膠不包含羥基脯氨酸殘基。基因重組明膠還優選不包含被羥基化的氨基酸殘基。

作為其他實施方式，基因重組明膠具有至少5、例如5～11的等電點，更優選具有6以上的等電點，進一步優選具有7以上的等電點。該目的在于提供在生理學的條件時帶凈正電荷的基因重組明膠。不受理論的束縛，認為該正電荷往往有助于整體具有被負電荷的膜的細胞的吸引力、相互作用及鍵合。

本發明的明膠多孔微載體在明膠為基因重組明膠時，能夠通過本發明的基因重組明膠多孔微載體的調制方法進行調制。

優選工序(a)中所使用的組合物在優選為3～11、更優選為4～8的范圍具有ph。優選第二乳液在優選為3～11、更優選為4～8的范圍具有ph。優選工序(a)中所使用的組合物包含具有優選大于9、更優選大于10、尤其優選13～19的hlb(hydrophilic-lipophilicbalance)的乳化劑。也能夠使用兩個以上的這種乳化劑。作為合適的乳化劑的例，能夠舉出peg400單油酸聚氧乙烯單油酸(hlb11.4)、peg400單硬脂酸酯聚氧乙烯單硬脂酸酯(hlb：11.6)、peg400單月桂酸酯聚氧乙烯單月桂酸酯(hlb：13.1)、油酸鉀(hlb：20.0)、月桂基硫酸鈉(hlb：40)、油酸鈉(hlb：18)、myrj(注冊商標)52(聚氧乙烯硬脂酸、hlb：17)、brij(注冊商標)58(聚氧乙烯鯨蠟醇、hlb：16)、tween(注冊商標)20(聚氧乙烯脫水山梨糖醇月桂酸單酯、hlb：16.7)、tween21(聚氧乙烯脫水山梨糖醇月桂酸單酯、hlb：13.3)、tween40(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯、hlb：15.6)、tween60(聚氧乙烯單硬脂酸脫水山梨糖醇、hlb：14.9)、tween61(聚氧乙烯單硬脂酸脫水山梨糖醇、hlb9.6)、tween65(聚氧乙烯脫水山梨糖醇三硬脂酸酯、hlb：10.5)、tween80(聚氧乙烯脫水山梨糖醇油酸單酯、hlb：15.0)、tween81(聚氧乙烯脫水山梨糖醇油酸單酯、hlb：10.0)及tween85(聚氧乙烯脫水山梨糖醇三油酸酯、hlb：11.0)。以上中，優選為tween80、tween40、myrj52及brij58以及包含它們的兩種以上的組合。

工序(a)中所使用的合適的非水溶性液體為烷基酯(例如，乙酸乙酯)、烴(例如，己烷、庚烷、環己烷、甲苯、二甲苯等)、鹵代烴(例如，二氯甲烷、一氯苯、二氯苯等)及油(例如，植物油(例如，玉米油))、石蠟油或工業潤滑油以及包含它們的兩種或其以上的組合。尤其優選的非水溶性液體為玉米油。

工序(b)中所使用的非水溶性液體優選包含含量小于0.1重量％的hlb值小于8的乳化劑，工序(b)中所使用的非水溶性液體更優選不包含hlb值小于8的乳化劑，工序(b)中所使用的非水溶性液體進一步優選不包含乳化劑。

作為hlb值小于8的乳化劑的例，能夠舉出單硬脂酸甘油酯(hlb：3.8)、span(注冊商標)40(脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯、hlb：6.7)、span60(脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、hlb：4.7)、span65(脫水山梨糖醇三硬脂酸酯、hlb：2.1)、span80(脫水山梨糖醇單油酸酯、hlb：4.3)及span85(脫水山梨糖醇三油酸酯、hlb：1.8)。

工序(b)中所使用的非水溶性液體可以與工序(a)中所使用的非水溶性液體相同也可以不同。在工序(a)中，水與非水溶性液體的體積比小于1:1，尤其優選小于1:2，在工序(b)中，水與非水溶性液體的體積比小于2:1，尤其優選小于1:1。

通常，第一乳液及第二乳液分別包括二相即非水溶性相和水相。工序(a)優選以非水溶性相的體積與水相的體積相等或比其大，例如，2倍或更大的方式進行。工序(b)優選以非水溶性相的體積大于第一乳液的體積，例如大2倍以上的方式進行。

本發明的方法還能夠在工序(b)中和/或工序(b)之后包括將明膠進行交聯的工序。交聯為化學交聯，例如為使用了交聯劑的化學交聯，優選為熱交聯，例如脫水熱交聯。明膠例如能夠經由賴氨酸的氨基，并經由谷氨酸或天冬氨酸的羧基或它們的組合進行交聯。

作為化學交聯的合適的交聯劑，優選在生物降解中釋放時，不引起毒性或抗原性的交聯劑。作為合適的交聯劑，例如能夠舉出戊二醛、水溶性碳二亞胺、雙環氧化合物、福爾馬林、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺、雙-羥基-琥珀酰亞胺、縮水甘油醚(例如，亞烷基乙二醇二縮水甘油醚或聚甘油聚縮水甘油醚)、二異氰酸酯(例如，六亞甲基二異氰酸酯)、二苯基磷酰基疊氮化物、d核糖及京尼平以及它們的組合。交聯的方法在“weadocket.al.inevaluationofcollagencross-linkingtechniques(biomater.med.devicesartif.organs，1983-1984，11(4)：293-318)”中也有記載。其中，能夠適當地使用水溶性的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(edc)。除此之外，能夠適當地使用六亞甲基二異氰酸酯。其他合適的交聯劑可舉出二氯羥基三嗪等三嗪。作為其他的交聯化合物，能夠舉出二乙烯基砜、二酸酐、雙官能亞氨酸酯、二-環氧化物或二馬來酰亞胺(dimaleiimidines)。一種化合物中能夠使用雙官能交聯劑，所述雙官能交聯劑具有例如包含環氧化物及酸酐的如雙官能交聯化合物那樣不同的活性取代基。基于酶的交聯劑，例如轉谷氨酰胺酶也是有用的。

交聯劑可以具有多于2的官能團，例如可舉出氰尿酰氯(三官能團)及包含兩個環氧化物和酸酐的化合物。這種交聯劑通常與存在于明膠的氨基酸中的氨基和/或硫氫基反應。如果需要，能夠使用多于一種的交聯劑。交聯劑與明膠接觸時，或者調節ph等之后或光引發后，或者通過其他活化機理，交聯自發地開始。

特別有用的交聯劑為戊二醛，其交聯兩個賴氨酸殘基。其他合適的生物相容性的交聯劑為edc，其耦接氨基和羧基。六亞甲基二異氰酸酯也能夠用作交聯劑。脫水熱交聯通過存在于明膠中的氨基和羧基的縮合來誘導交聯，從而形成酰胺鍵。脫水熱交聯優選在120℃以上的溫度下進行。

本發明的明膠多孔微載體為基因重組明膠之外的明膠時，針對交聯的優選實施方式與上述交聯相關的記載相同。

為了有助于粒子形成，本發明所涉及的明膠及基因重組明膠優選具有至少兩個賴氨酸殘基。本發明所涉及的明膠及基因重組明膠優選具有至少3個或至少4、5、6、7、8、9、10、11或12個賴氨酸殘基。作為另一實施方式，本發明所涉及的明膠及基因重組明膠優選除了賴氨酸殘基之外，優選包含至少兩個選自天冬氨酸及谷氨酸的氨基酸，本發明所涉及的明膠及基因重組明膠更優選包含至少3個或至少4、5、6、7、8、9、10、11或12個冬氨酸及谷氨酸殘基。

為了有助于微載體的三維網絡結構，本發明所涉及的明膠及基因重組明膠優選包含分散在明膠分子中的、賴氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸。因此，作為一實施方式，在各50個氨基酸殘基中，優選包含至少1個、優選至少2個賴氨酸殘基、或至少1個、優選至少2個天冬氨酸或谷氨酸殘基、或至少1個賴氨酸殘基及至少1個天冬氨酸或谷氨酸殘基。優選各40個氨基酸殘基、更優選各25個氨基酸殘基中，優選包含至少1個賴氨酸殘基和/或至少1個天冬氨酸或谷氨酸殘基。

本發明所涉及的明膠及基因重組明膠優選各自包含不相鄰的可交聯的氨基酸殘基，例如可交聯的氨基酸殘基優選通過至少5個、更優選至少10個不可交聯的氨基酸而分離。可交聯的氨基酸殘基包含伯胺(除了為了形成蛋白質骨架中的酰胺鍵而通常使用的伯胺之外)、-sh和/或羧酸(除了為了形成蛋白質骨架中的酰胺鍵而通常使用的羧酸之外)。

基因重組明膠比天然明膠包含高比例(％)或大量的賴氨酸殘基，尤其用于隨后的交聯，是優選的。大量的交聯劑與賴氨酸殘基和/或n末端胺鍵合。天然明膠通常每1000個氨基酸包含25～27個賴氨酸殘基及112～133個谷氨酸和天冬氨酸。用于本發明的基因重組明膠中，能夠使賴氨酸殘基的數量例如相同或每1000個氨基酸減少到少于約20、15、10或5個的賴氨酸，并且，根據需要，例如相同或每1000個氨基酸增加至多于約30、40或50個的賴氨酸。用于本發明的基因重組明膠中所存在的谷氨酸或天冬氨酸殘基的數量例如相同或每1000個氨基酸減少至少于約100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5個的賴氨酸，并且，根據需要，例如相同或每1000個氨基酸增加至多于150個的賴氨酸。根據需要，將基因重組明膠中所存在的一些或所有谷氨酰胺及天冬酰胺殘基脫氨基化，也能夠將它們轉換為天冬氨酸及谷氨酸殘基。

作為一實施方式，通過包括使本發明所涉及的明膠或基因重組明膠與每1克明膠或基因重組明膠為0.02～1.0mmol的交聯劑接觸的工序交聯明膠或基因重組明膠。例如，每1克本發明所涉及的明膠或基因重組明膠，能夠使用約0.02、0.05、0.1、0.25、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.9mmol的交聯劑。

作為其他實施方式，通過包括使本發明所涉及的明膠或基因重組明膠與每1克明膠或基因重組明膠為0.5～5.0mmol的交聯劑接觸的工序交聯明膠或基因重組明膠。例如，每1克本發明所涉及的明膠或基因重組明膠，能夠使用約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0及5.0mmol的交聯劑。

這樣一來，為了確定或定制微載體的物理特性，能夠使用所使用的交聯劑的量以及可交聯的氨基酸殘基的數量。通過可交聯的殘基的數量大和/或交聯化合物的濃度高，由此能夠獲得尤其有助于施加機械應力的用途的、牢固的微載體。可交聯的氨基酸殘基的數量少和/或交聯化合物的濃度低，由此能夠容易地獲得尤其適合于注射或藥劑用途且易變形的微載體。

熱交聯能夠避免微載體用于藥劑用途時尤其優選的、本發明所涉及的明膠或基因重組明膠的潛在化學污染，因此優選熱交聯。

交聯的程度影響明膠微載體在體內降解的時間。因此，能夠控制用于預期用途的微載體的降解的比例。其一例為在皺紋的部位注射不攜帶細胞的本發明的微載體時的整形外科。微載體周邊的細胞移動到微載體，從而制作菌群。微載體逐漸被周邊的酶(例如，基質金屬蛋白酶)降解，移動后的細胞占據皺紋的部位。這將會拉伸皺紋。

工序(a)中，水與非水溶性液體的體積：體積比例優選為5:1～1:10，更優選為1:1～1:5，進一步優選為2:3～1:3。

工序(a)中所使用的組合物(及所獲得的第一乳液)優選包含1～15重量％、更優選1.5～10重量％、尤其優選3～5重量％的基因重組明膠，并包含10～70重量％、更優選20～50重量％、尤其優選30～40重量％的水，包含20～90重量％、更優選40～80重量％、尤其優選50～70重量％的非水溶性液體，包含0.5～20重量％、更優選1～10重量％、尤其優選2～6重量％的乳化劑。

工序(a)優選在10～100℃、更優選20～80℃、尤其優選30～60℃的溫度下進行。

工序(a)及工序(b)中進行的混合可以通過任何適當的方法進行，例如能夠通過振動或攪拌進行。優選通過攪拌進行混合，尤其使用溶解器型的攪拌時，優選以20～5000rpm(revolutionsperminute)、更優選200～1000rpm、尤其優選250～600rpm的速度進行攪拌。工序(a)中的混合速度可以與工序(b)中的混合速度相同也可以不同。

在工序(b)中，第一乳液相對于與第一乳液混合的非水溶性液體的體積：體積比例優選為5:1～1:100，更優選為2:1～1:10，尤其優選為1:1～1:3。

第二乳液優選包含1～85重量％、更優選10～65重量％、尤其優選25～50重量％的第一乳液，并包含15～99重量％、更優選35～90重量％、尤其優選50～75重量％的上述非水溶性液體(即，加入到來自工序(a)的第一乳液中已經存在的非水溶性液體中的、工序(b)中第一次包含的非水溶性液體)。在工序(b)中與第一乳液混合的非水溶性液體優選包含優選0～0.1重量％、更優選0重量％的hlb小于8的乳化劑。在工序(b)中與第一乳液混合的非水溶性液體優選不包含乳化劑。

工序(b)優選在比明膠的凝膠化溫度高的溫度下進行。也能夠通過任何適當的方法確定明膠的凝膠化溫度。例如能夠使用“toshetalinappliedphysicsletters，vol.84，number21，24may2004”中所記載的方法，尤其能夠使用其中記載的第三個方法。凝膠化溫度取決于明膠的相同性及明膠的濃度程度。

工序(b)優選在比明膠的凝膠化溫度高1～80℃、優選高3～70℃、尤其優選高5～60℃的溫度下進行。

取決于明膠，但工序(b)通常在10～100℃、例如在15～70℃、尤其在20～60℃的范圍的溫度下進行。

實際上，以高程度的準確性掌握明膠的凝膠化溫度通常并不重要，以大致的識別足以。這是因為，僅通過只掌握沒有實際測量凝膠化溫度或計算的、大致的凝膠化溫度，能夠在比肯定發生凝膠化的凝膠化溫度足夠高的溫度下進行工序(b)。

工序(c)中所進行的冷卻可以是被動的也可以是主動的。例如，被動冷卻能夠簡單地通過將第二乳液自然冷卻至明膠凝固的溫度為止來進行。主動冷卻能夠通過使用用于降低第二乳液的溫度(例如，以受到控制的冷卻速度)的冷卻方法(例如，冰或冰水)來進行。主動冷卻用于調制最終的微載體的性質。

然而，工序(c)優選以由每1分鐘0.1～20℃、更優選1～10℃的比例冷卻第二乳液的方式進行。這些冷卻速度能夠提供具有尤其有用的特性的微載體。例如，第二乳液為60℃時，優選的冷卻速度為每1分鐘1.8℃。30分鐘后，所獲得的混合物最終成為6℃的溫度。冷卻速度可以是線性的也可以不是線性的。

本發明的方法優選還包括從工序(d)第二乳液去除已凝固的明膠的工序、優選通過過濾去除的工序。

鑒于上述，第一本發明的方法優選具有以下特征。

(i)工序(a)中所使用的組合物包含3～5重量％的基因重組明膠、30～40重量％的水、50～70重量％的非水溶性液體及2～6重量％的乳化劑；

(ii)工序(a)及工序(b)的混合各自獨立地通過以250～600rpm的速度攪拌來進行；

(iii)在工序(a)中水相對于非水溶性液體的體積：體積比例設為2:3～1:3的范圍；

(iv)工序(a)優選在30～60℃范圍的溫度下進行；

(v)工序(b)中所使用的組合物包含25～50重量％的第一乳液、50～75重量％的非水溶性液體，非水溶性液體不包含乳化劑；

(vi)優選以由每1分鐘1～10℃的比例冷卻第二乳液的方式進行工序(c)；及

(vii)本發明的方法任意地還包括交聯所獲得的基因重組明膠微載體的工序、優選通過脫水熱交聯進行交聯的工序。

根據第二本發明，提供具有一個或多個以下特征的基因重組明膠多孔微載體。并且，本發明的明膠多孔微載體優選具有一個或多個以下特征。

(a)具有至少5μm、例如6～30μm、尤其是10～20μm的平均直徑的表面孔。表面孔優選具有小于微載體的粒徑的平均直徑。

(b)至少50體積％、例如51～95體積％、尤其是60～90體積％的平均空隙率。

(c)20～800μm、例如40～600μm、尤其是100～500μm的平均粒徑。

(d)0.04～0.50g/cm³、例如0.06～0.25g/cm³、尤其是0.1～0.2g/cm³的平均密度。

(e)2～25cm³/g、例如4～17cm³/g、尤其是5～10cm³/g的振實體積。

(f)20～800μm的平均粒徑。至少80％的微載體具有平均粒徑的30～200％的粒徑。

平均粒徑為體積加權平均直徑(volume-weightedmeandiameter)，能夠使用莫爾文粒度儀(malvernmastersizer)進行測定。

表面孔的平均直徑能夠通過微電腦斷層攝影術(ct)圖像分析進行測定。例如，優選能夠使用skyscan1172microctapparatus(bruker公司制)，并具備vgstudiomax2.2software。

微載體的平均空隙率以下述式(1)定義。

p＝(pvi/v)×100％式(1)

在此，p為平均空隙率，pvi為微載體內的平均總空間體積，v為微載體的總體積，還包括空間體積。

pvi能夠通過微ct測量來確定(例如，優選能夠使用skyscan1172microctapparatus(bruker公司制)，具備vgstudiomax2.2software。)。

v能夠通過以下方式來計算：測量微載體的體積(例如通過使用通過微載體的微ct測量圖像的分析進行確定的大小)；及計算數學平均體積。

通過第一本發明的方法獲得的基因重組明膠微載體優選具有一個或多個上述特征(a)～(f)和/或與第三本發明相關的一個或多個下述特征。能夠通過第一本發明的方法獲得基因重組明膠多孔微載體。上述特征(a)至(f)能夠應用于交聯或未交聯的本發明的微載體這兩者。可在市場上獲得的微載體為了獲得具有完全不同的三維結構的明膠微載體，能夠使用本發明的方法。

這樣一來，根據第三本發明，能夠提供一種具有空隙，該空隙具有微載體的粒徑的5～25％(優選10～20％)的平均直徑的基因重組明膠多孔微載體。本發明的基因重組明膠多孔微載體及明膠多孔微載體中，優選空隙通過細孔與相鄰的空隙結合。優選空隙的平均直徑在微載體的平均粒徑的5～25％的范圍。為了容許生物細胞進入到空隙中，優選至少一半、更優選至少75％、進一步優選90％的空隙彼此完全連接，并與微載體的外部(例如，經由細孔)連接。空隙優選具有生物細胞能夠進入的多孔壁(例如，包含孔的壁)。空隙壁中的細孔(或孔)優選具有至少5μm、更優選至少10μm的平均直徑。

優選至少一半、更優選至少75％、尤其優選80％的空隙相對于平均空隙直徑具有-30％～+30％的直徑。優選至少一半、更優選至少75％、尤其優選80％的空隙為球狀。優選至少一半、更優選至少75％、尤其優選80％的空隙具有凹陷的壁。這樣一來，明膠微粒子能夠提供例如在兩個空隙重疊時，容許細胞或醫藥物質進入到空隙中的支架中的多個球狀的空隙/凹陷的壁、及細孔/孔中具有特征的支架。

為了制作包含空隙的微載體而使用的明膠優選為基因重組明膠，關于其他本發明，尤其優選其中所記載的基因重組明膠。

本發明對每一個以及集合這兩者中均提供微載體。本發明還提供平均具有上述性質的多個微載體(1批次至少500mg的微載體)。本發明的明膠微載體可以是任何外形，但本發明的方法特別適合于調制球狀的粒子。這樣一來，通過本發明的方法獲得的微載體優選為球形，例如優選它們是微球。

根據第四本發明，提供包含明膠多孔微載體及細胞，細胞存在于微載體的表面和/或內部的復合材料，該微載體為本發明的明膠多孔微載體或本發明的基因重組明膠多孔微載體。

本發明的復合材料所涉及的細胞的種類沒有限制，還包含人或動物細胞。例如，能夠使用皮膚的細胞獲得的復合材料能夠用于治療各種皮膚的損傷。另一例是例如能夠用于治療心肌梗塞的成肌細胞(肌肉細胞)。另一例是能夠用于未損傷的肝臟病變中的毒物的肝細胞。作為優選的實施方式，細胞為干細胞，例如胚胎干細胞、造血干細胞、神經元干細胞、表皮干細胞及間充質干細胞。能夠使用的其他細胞中還包含多能細胞、內皮細胞、前體細胞及源自骨髓的細胞。

本發明的復合材料能夠通過培養所期望的細胞和微載體來進行調制。通常，在培養容器中將包含微載體及所期望的細胞的懸浮液與營養素進行混合。所使用的培養容器取決于生產規模。為了小規模生產，能夠使用以小實驗室為基礎的攪拌容器。為了大規模生產，能夠使用具有幾千升體積的灌。

營養素通常通過生長的細胞選擇，在市面上能夠購買大量的營養素的混合物及培養基。例如能夠使用dmem(dulbecco'smodifiedeagle'smedium)、bme(basalmediumeagle)、dmem/f12培養基、ham'sf-10及f-12培養基、medium199、mem、ames'media、bgjbmedium(fitton-jacksonmodification)、click'smedium、cmrl-1066medium、fischer'smedium、gmem(glascowminimumessentialmedium)、imdm(iscove'smodifieddulbecco'smedium)、l-15medium(leibovitz)、mccoy's5amodifiedmedium、nctcmedium、swim'ss-77medium、waymouthmedium、william'smediume及rpmi1640media。

本發明的微載體在很多用途中，例如能夠作為細胞載體、作為用于修復組織損傷的支架來使用。因此，為了培養人造皮膚、人造組織、脂肪細胞、肌肉、血管等，能夠使用微載體。所使用的微載體能夠用作細胞培養的細胞的載體，并且用作在移植到人體或動物體內之前或之后為了生產所期望的物質而生存的細胞的載體這兩者。細胞可以是宿主自身(自體移植)的細胞或其他來源的細胞(同種或異種)。在一些情況下，能夠為了將作為所期望的生成物的細胞、例如移植后的初始階段的載體上的脂肪細胞(前脂肪細胞)轉化為脂肪細胞而增殖。用途之一的領域例如為整形外科。

能夠在人體或動物體中不添加細胞來移植本發明的微載體。移植后，體內接近的細胞移動到微載體并形成菌群。降解經移植的微載體之后，形成菌群的細胞形成與移植相對應的結構。根據第五本發明，能夠提供包含藥理學上可接受的載體和本發明的微載體或組合物的注射用組合物。

組合物優選能夠通過具有80～4000μm的內部口徑的注射器進行注射。優選的藥理學上可接受的載體中包含液體、例如水、乙醇以及包含水和/或乙醇的混合物。藥理學上可接受的載體優選為無菌，能夠任意包含防腐劑。

[實施例]

通過以下不受限制的實施例說明本發明。

使用以下縮寫。

“rg1”是指10重量％溶液、ph5.4的、增加了rgd的基因重組明膠溶液(mwt：51.2kda)。對人collal-i明膠的氨基酸序列的部分進行編碼，根據改變了核酸序列的核酸序列調制明膠。使用了ep-a-0926543、ep-a-1014176及wo01/34646中所記載的方法。該明膠不含羥基脯氨酸，包括序列編號1中所記載的以下氨基酸序列。

序列編號1的氨基酸序列：

序列編號1為571個氨基酸長度，其包括12個rgd基序。

“rg2”包含4重量％的明膠來代替10重量％，除此之外與“rg1”相同。

“rg3”包含15重量％的明膠來代替10重量％，除此之外與“rg1”相同。

“tween(注冊商標)80”為聚氧乙烯脫水山梨糖醇油酸單酯。

“pbs”為磷酸鹽緩沖生理鹽水。

“dapi”為4',6-二脒基-2-苯基吲哚(細胞染色)。

實施例1

工序(a)第一乳液的調制

將rg1(15g)及tween80(1.0g)的混合物加熱至60℃，該溫度保持15分鐘。一邊以550rpm攪拌混合物，一邊歷時7分鐘添加非水溶性液體(玉米油30cm³)。一邊保持60℃的溫度，一邊進一步以550rpm繼續攪拌3分鐘，獲得第一乳液。

工序(b)第二乳液的調制

一邊以350rpm進行攪拌，一邊在室溫下對非水溶性液體(玉米油55cm³)歷時3分鐘滴加第一乳液。添加完成時，在20℃下繼續攪拌3分鐘，從而獲得第二乳液。

工序(c)第二乳液的冷卻

在工序(b)中所記載的3分鐘之后，將第二乳液一邊以350rpm繼續攪拌,一邊歷時5分鐘冷卻至5.5℃。混合物成為5.5℃時，進一步在該溫度下繼續攪拌15分鐘。使用冰浴將含有丙酮(300ml)的容器冷卻至-1～+1℃的溫度。之后，一邊以350rpm進行攪拌，一邊將第二乳液添加到已冷卻的丙酮中。以350rpm攪拌5分鐘之后，從冰浴中取出容器，在室溫下繼續攪拌一小時，丙酮將混合物中所形成的微載體進行脫水。過濾去除微載體，利用丙酮清洗幾次，直到水及玉米油從微載體中去除。之后，在60℃下，在烘箱中干燥微載體。

任意工序(d)交聯

通過如下進行脫水熱處理來交聯從工序(c)獲得的微載體。

將干燥后的微載體置于玻璃小瓶中，在bindervd53vacuumstove中，在真空下96小時置于145℃的溫度下。所獲得的基因重組明膠多孔微載體稱為ms1，將該特性記載于以下表1(微載體ms1的特性)中。另外，ms1的至少一半的空隙為球狀，并且至少一半的上述空隙具有相對于平均空隙直徑為-30％～+30％的直徑。

[表1]

平均空隙直徑及形狀通過切割微載體，并使用微ct數據(使用具備bruker公司的vgstudiomax2.2software的skyscan1172microctapparatus)分析該截面而確定(參考圖1c)。

平均空隙率由上述式(1)確定。

平均粒徑為微載體的體積加權平均直徑(volume-weightedmeandiameter)使用莫爾文粒度儀(malvernmastersizer)進行計算。

微載體的平均密度測量1g微載體的總體積(包括空隙及球體之間的空間)，通過1g除以微載體的總體積來計算并確定。

微載體的平均體積測量并確定1g微載體的體積(包括空隙及球體之間的空間)。

實施例2～9及比較例1

除了下述表2所示的變更之外，重復實施例1。所獲得的微載體的特性示于表3。另外，ms2～9的微載體均是至少一半的空隙為球狀，并具有至少一半的上述空隙相對于平均空隙直徑為-30％～+30％的直徑。另一方面，cms1及cultispherg均是至少一半的空隙不是球狀，并且至少一半的上述空隙不具有相對于平均空隙直徑為-30％～+30％的直徑。

[表2]

[表3]

如實施例1所記載那樣測量平均空隙直徑、平均空隙率、平均粒徑、平均密度及平均體積。

cms1或cultispherg的空隙不是球狀，因此無法測定表中的*。

通過掃描電子顯微鏡(sem)分析試料ms1、cms1及市售的cultispherg。所獲得的照片示于附圖中。ms1示于圖1a～1c中，比較例cms1示于圖2a～2c中，并且市售的cultispherg示于圖3a～3c中。

附圖表示ms1微載體充分分離，并且很好地區分，具有球狀的空隙，實際上為球狀。另一方面，比較例的微載體cms1中，微載體具有非球形的形狀、大表面的孔，一同結塊并賦予二次結構。圖2c表示通過比較例的方法獲得的微載體的截面，并表示與圖1a所示的本發明的微載體相比，空隙小于微粒子的粒徑。另外，圖2c中所示的微粒子的空隙的大小及形狀不規則。

微載體-細胞組合物的調制及測試

通過染色測量的細胞增殖

如下調制上述實施例及比較例中所記載的、交聯的含有明膠多孔微載體的合成物。

殺菌工序

在評價階段將每一個微載體(100mg)置于磷酸鹽緩沖鹽水(pbs、10cm³、無鈣和鎂)中。在室溫下1小時后，不去除pbs，通過高壓釜來將微載體殺菌。殺菌后，去除pbs，并添加新的pbs。重復三次該循環。最終獲得的經殺菌的微載體直到使用為止保存在4℃且包含10％fbs(foetalbovineserum)的dmem培養基中。

c2c12細胞(肌成纖維細胞小鼠，atcccrl1772)的調制

在t75培養瓶中預培養細胞，使細胞匯合50～60％，當活躍地增殖時，進行傳代。用pbs(1ml/5cm²)沖洗細胞，并去除包含10％fbs(foetalbovineserum)的dmem培養基。將胰蛋白酶/edta溶液添加到細胞中(3-4ml/75cm²)、在37℃下孵育6分鐘。添加完全培養基，相對于胰蛋白酶的量，使用比例為1:2，中和胰蛋白酶。在室溫下以5分鐘、125rpm使所獲得的單細胞溶液離心分離。取上清液，輕輕地將所獲得的細胞沉淀物內的細胞重新懸浮在包含10％fbs的dmem培養基中。使用顯微鏡確定細胞密度。

旋轉燒瓶培養

用純水(10cm³)清洗25ml的無菌的旋轉燒瓶(wheaton)。在評價階段將已干燥的微球(40mg)添加到該旋轉燒瓶中。燒瓶在細胞培養dmem/10％fbs培養基中填滿至最終體積的8ml為止。燒瓶在培養箱中放置30分鐘，以使其平衡。接著，在培養基中添加上述c2c12細胞(2cm³中添加2×10⁶的細胞)，以50rpm將所獲得的混合物攪拌5分鐘，停止攪拌，靜置40分鐘，以這樣的循環攪拌3小時。該循環進行了四次。接著，添加一部分培養基(10cm³)，以37℃、5％co2、80rpm的條件，在加濕培養箱中將細胞培養7天。每天，除去培養基的50％，替換成未使用的培養基。

分析

細胞培養7天后，用dapi染色所獲得的合成物(微載體+細胞)。與雙鏈dna結合時，dapi在358nm(紫外線)的波長下具有吸收最大值，其發光最大值為461nm(藍色)。細胞的核能夠看作突出顯示藍色的斑點。計數細胞核的數量，這表示與被交聯的微載體相關的細胞增殖的程度。細胞培養后的球體的截面的sem分析明示了微球內的細胞增殖的程度。微載體的外表面也被輕微染色。將結果示于表4(通過dapi染色法進行評價的增殖結果)。

[表4]

表4中使用了以下的分數。

“+++”表示通過目視檢查確定的“非常良好的細胞增殖”。

“++”表示通過目視檢查確定的“良好的細胞增殖”。

“+”表示通過目視檢查確定的“中等的細胞增殖”。

從表4可知，實施例的細胞增殖優于cms1及cultispherg的比較例。

<110>富士膠片株式會社

<120>微載體的調制方法、微載體及其應用

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