一種絨毛膜脫細(xì)胞液以及脫細(xì)胞方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種絨毛膜脫細(xì)胞液以及脫細(xì)胞方法。
【背景技術(shù)】
[0002]脫細(xì)胞技術(shù)主要是指利用脫細(xì)胞技術(shù)(物理、化學(xué)、酶解等方法)去除組織中各種細(xì)胞成分以及遺傳物質(zhì)從而獲得天然生物支架材料。由于保留了細(xì)胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)和天然成分，有利于細(xì)胞粘附、增殖、分化及其生物學(xué)功能的發(fā)揮，因此，其在組織修復(fù)與再生中具有其他支架材料無法比擬的優(yōu)勢(shì)。目前，人們已經(jīng)能夠從多種組織中得到脫細(xì)胞基質(zhì)支架材料，如小腸、皮膚、血管、角膜以及更為復(fù)雜的心、肺、肝、腎等。
[0003]胎盤作為產(chǎn)婦分娩之后的廢棄物，其獲取簡(jiǎn)單，并且不會(huì)對(duì)捐獻(xiàn)者造成傷害，對(duì)胎盤進(jìn)行有效的利用可以變廢為寶。目前已有研究者對(duì)胎盤羊膜進(jìn)行開發(fā)，經(jīng)過脫細(xì)胞后作為生物材料被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療中，但是卻存在材料難依附于組織、細(xì)胞不易附著、傷口愈合慢的缺點(diǎn)。如專利CN1369555A所公開的方法中，制備得到的脫細(xì)胞羊膜較薄、不易附著于組織上、容易發(fā)生卷曲脫落。
[0004]胎盤絨毛膜與羊膜類似，有免疫原性低、組織相容性高、韌性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，并且易在體內(nèi)降解。而相比于羊膜，絨毛膜厚度大，不易卷曲變形，機(jī)械度與韌性更強(qiáng)，更有利于依附在組織上，易于實(shí)際的醫(yī)療操作。絨毛膜內(nèi)有細(xì)胞充斥其中，將這些細(xì)胞脫下后則會(huì)形成孔隙，便于加快新細(xì)胞附著生長。絨毛膜含有膠原、蛋白多糖等多種生物活性成份，能夠?yàn)榧?xì)胞生長提供營養(yǎng)。這些特點(diǎn)都使絨毛膜更適合作為生物支架應(yīng)用于實(shí)際醫(yī)療中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一種絨毛膜脫細(xì)胞液。
[0006]為達(dá)上述目的，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中提供了一種絨毛膜脫細(xì)胞液，包括以下按重量配比的組分:
[0007]十二烷基磺酸鈉0.5份?I份;聚乙二醇辛基苯基醚0.5份?2份；
[0008]氯化鈉3份?6份;DNAse I份?3份；
[0009]蛋白酶抑制劑0.1份?0.5份;胰蛋白酶0.4份?1.2份。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)化方案之一，絨毛膜脫細(xì)胞液包括以下按重量配比的組分:
[0011 ]十二烷基磺酸鈉0.6份?0.8份;聚乙二醇辛基苯基醚0.5份?I份；
[0012]氯化鈉4份?5份;DNAse I份?2份；
[0013]蛋白酶抑制劑0.1份?0.4份;胰蛋白酶0.6份?0.8份。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)化方案之一，絨毛膜脫細(xì)胞液包括以下按重量配比的組分:
[0015]十二烷基磺酸鈉0.8份;聚乙二醇辛基苯基醚0.6份；
[0016]氯化鈉5份;DNAse 2份；
[0017]蛋白酶抑制劑0.2份;胰蛋白酶0.8份。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)化方案之一，絨毛膜脫細(xì)胞液包括以下按重量配比的組分:
[0019]十二烷基磺酸鈉I份;聚乙二醇辛基苯基醚0.5份；
[0020]氯化鈉4份;DNAse1.5份；
[0021 ]蛋白酶抑制劑0.4份;胰蛋白酶0.6份。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)化方案之一，絨毛膜脫細(xì)胞液包括以下按重量配比的組分:
[0023]十二烷基磺酸鈉I份;聚乙二醇辛基苯基醚2份；
[0024]氯化鈉6份;DNAse2.5份；
[0025 ]蛋白酶抑制劑0.5份;胰蛋白酶I份。
[0026]本發(fā)明的優(yōu)化方案之一，絨毛膜脫細(xì)胞液的溶質(zhì)為水。
[0027]本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供利用絨毛膜脫細(xì)胞液的絨毛膜脫細(xì)胞方法，包括將絨毛膜置于絨毛膜脫細(xì)胞液中處理的步驟。
[0028]具體的，脫細(xì)胞方法包括以下步驟:
[0029]將絨毛膜放入絨毛膜脫細(xì)胞液中并置于水平搖床上，在室溫下?lián)u動(dòng)處理48h?72h;然后取出放入純水中振蕩沖洗;沖洗完畢后滅菌、冷凍保存。
[0030]進(jìn)一步的，脫細(xì)胞方法包括以下步驟:
[0031]將絨毛膜放入絨毛膜脫細(xì)胞液中并置于水平搖床上，搖床轉(zhuǎn)速為100?200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)處理48h?72h;然后放入搖床上的純水中進(jìn)行清洗，搖床轉(zhuǎn)速為100?200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)處理0.5h?2h，重復(fù)5?8次;將清洗好的絨毛膜放入0.1 %?0.3 %的過氧乙酸溶液中浸泡3h?6h滅菌，滅菌后置于-80°C冷凍4h，再使用凍干機(jī)凍干保存。
[0032]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用絨毛膜脫細(xì)胞液以及絨毛膜脫細(xì)胞方法獲得的域毛I(xiàn)旲制品。
[0033]綜上所述，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0034]本發(fā)明彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中缺少脫絨毛膜細(xì)胞的制劑，本發(fā)明通過調(diào)節(jié)脫細(xì)胞液的配方，可以使制備得到的絨毛膜產(chǎn)品保留天然空隙，細(xì)胞易附著，且不易發(fā)生卷曲，便于商業(yè)化生產(chǎn)，彌補(bǔ)了脫細(xì)胞羊膜生物膜制品的不足，可廣泛推廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0035]圖1為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中脫細(xì)胞絨毛膜；
[0036]其中圖1a為脫細(xì)胞絨毛膜在100倍的倒置顯微鏡圖，圖1b為30000倍的掃描電子顯微鏡圖；
[0037]圖2為本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中羊毛膜和絨毛膜處理后的電鏡圖；
[0038]其中圖2c為脫細(xì)胞羊毛膜的使用倒置顯微鏡拍攝的放大圖，圖2d為脫細(xì)胞絨毛膜的使用倒置顯微鏡拍攝的放大圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039]實(shí)施例1
[0040]步驟1、將胎盤用0.9 %生理鹽水沖洗干凈，隨后剝離絨毛膜；
[0041 ]步驟2、將絨毛膜放入搖床上的脫細(xì)胞絨毛膜制備液，其中包括0.8 %十二烷基磺酸鈉、0.6%聚乙二醇辛基苯基醚、5%氯化鈉、2%DNAse、0.2%蛋白酶抑制劑、0.8%胰蛋白酶，調(diào)整轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)30小時(shí)；
[0042]步驟3、將絨毛膜取出，放入搖床上的純水中清洗，200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)I小時(shí)，重復(fù)8次；
[0043]步驟4、將清洗好的絨毛膜放入0.1的過氧乙酸中浸泡5小時(shí)滅菌后，置于4°C下，保存待用。
[0044]實(shí)施例2
[0045]步驟1、將胎盤用0.9 %生理鹽水沖洗干凈，隨后剝離絨毛膜；
[0046]步驟2、將絨毛膜放入搖床上的脫細(xì)胞絨毛膜制備液，其中包括I%十二烷基磺酸鈉、0.5%聚乙二醇辛基苯基醚、4%氯化鈉、1.5%DNAse、0.4%蛋白酶抑制劑、0.6%胰蛋白酶，調(diào)整轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)36小時(shí)；
[0047]步驟3、將絨毛膜取出，放入搖床上的純水中清洗，160轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)I小時(shí)，重復(fù)7次；
[0048]步驟4、將清洗好的絨毛膜放入0.1的過氧乙酸中浸泡4小時(shí)滅菌后，置于4°C下，保存待用。
[0049]實(shí)施例3
[0050]步驟1、將胎盤用0.9 %生理鹽水沖洗干凈，隨后剝離絨毛膜；
[0051]步驟2、將絨毛膜放入搖床上的脫細(xì)胞絨毛膜制備液，其中包括I%十二烷基磺酸鈉、2%聚乙二醇辛基苯基醚、6%氯化鈉、2.5%DNAse、0.5%蛋白酶抑制劑、I %胰蛋白酶，調(diào)整轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)24小時(shí)；
[0052]步驟3、將絨毛膜取出，放入搖床上的純水中清洗，180轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)I小時(shí)，重復(fù)8次；
[0053]步驟4、將清洗好的絨毛膜放入0.3的過氧乙酸中浸泡3小時(shí)滅菌后，置于4°C下，保存待用。
[0054]對(duì)比實(shí)施例1
[0055]步驟1、將胎盤用0.9 %生理鹽水沖洗干凈，隨后剝離絨毛膜；
[0056]步驟2、將絨毛膜放入搖床上的脫細(xì)胞絨毛膜制備液，其中包括0.8%十二烷基磺酸鈉、5 %氯化鈉、2 %DNAse、0.2 %蛋白酶抑制劑、0.8 %胰蛋白酶，調(diào)整轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)30小時(shí)；
[0057]步驟3、將絨毛膜取出，放入搖床上的純水中清洗，200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)I小時(shí)，重復(fù)8次；
[0058]步驟4、將清洗好的絨毛膜放入0.1的過氧乙酸中浸泡5小時(shí)滅菌后，置于4°C下，保存待用。
[0059]對(duì)比實(shí)施例2
[0060]步驟1、將胎盤用0.9 %生理鹽水沖洗干凈，隨后剝離絨毛膜；
[0061 ]步驟2、將絨毛膜放入搖床上的脫細(xì)胞絨毛膜制備液，其中包括0.8 %十二烷基硫酸鈉、0.6%聚乙二醇辛基苯基醚、5%氯化鈉、2%DNAse、0.2%蛋白酶抑制劑、0.8%胰蛋白酶，調(diào)整轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)30小時(shí)；
[0062]步驟3、將絨毛膜取出，放入搖床上的純水中清洗，200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)I小時(shí)，重復(fù)8次；
[0063]步驟4、將清洗好的絨毛膜放入0.1的過氧乙酸中浸泡5小時(shí)滅菌后，置于4°C下，保存待用。
[0064]對(duì)比實(shí)施例3
[0065]a、制備脫細(xì)胞生物羊膜:
[0066](I)取絨毛膜，用甲醇-氯仿混合溶液浸泡24h，混合溶液中甲醇與氯仿的體積比為1:1，純化水或去離子水清洗；
[0067](2)用I %(w/v)十二燒基硫酸鈉溶液浸泡24h，純化水或去離子水清洗；
[0068](3)用0.5 % (w/v)胰蛋白酶溶液消化24h，純化水或去離子水清洗；
[0069]b、取步驟a制備的脫細(xì)胞生物羊膜，浸泡于濃度為I %的京尼平溶液中，35°C恒溫下作用42h，純化水或去離子水清洗；
[0070]C、病毒滅活，純化水或去離子水清洗，真空冷凍干燥，即可。
[0071]對(duì)比實(shí)施例4
[0072]步驟1、將胎盤用0.9 %生理鹽水沖洗干凈，隨后剝離取得羊毛膜；
[0073]步驟2、將羊毛膜放入搖床上的脫細(xì)胞羊毛膜制備液，其中包括0.8%十二烷基磺酸鈉、0.6%聚乙二醇辛基苯基醚、5%氯化鈉、2%DNAse、0.2%蛋白酶抑制劑、0.8%胰蛋白酶，調(diào)整轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)30小時(shí)；
[0074]步驟3、將羊毛膜取出，放入搖床上的純水中清洗，200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)I小時(shí)，重復(fù)8次；
[0075]步驟4、將清洗好的羊毛膜放入0.1的過氧乙酸中浸泡5小時(shí)滅菌后，置于4°C下，保存待用。
[0076]按照實(shí)施例1?對(duì)比實(shí)施例4合計(jì)7組實(shí)施例提供的方法制備得到脫細(xì)胞的絨毛膜或者羊毛膜，在顯微鏡下觀察其微觀結(jié)構(gòu)，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下。
[0077]實(shí)驗(yàn)1:按照實(shí)施例1提供的方法制備得到的脫細(xì)胞絨毛膜，冷凍干燥后進(jìn)行倒置顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察，獲得的電鏡圖如圖1所示。
[0078]實(shí)驗(yàn)2:將對(duì)比實(shí)施例4的人胎盤羊膜、對(duì)比實(shí)施例1的絨毛膜制備成脫細(xì)胞生物膜冷凍干燥，切割成大小為lcmX Icm塊并使用紫外線消毒30min。然后在12孔板(coring)中的每一孔中粘貼一張生物膜，每個(gè)生物膜上接種1000個(gè)P3代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，并在溫度為37°C、二氧化碳含量為5%的孵箱中培養(yǎng)2小時(shí)，每孔再加入Iml生長培養(yǎng)基含(含10%FBS(Gibco)的DMEM(Hyclone)),再在溫度為37°C、二氧化碳含量為5%的孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)，最后使用倒置顯微鏡下觀察拍照，其獲得的電鏡圖如圖2所示。
[0079]從圖1和圖2的電鏡圖中可以得知，采用本發(fā)明的方法制備得到的脫細(xì)胞絨毛膜天然空隙較大，細(xì)胞附著性好，而且不易發(fā)生卷曲。另外，在其他對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，其處理效果顯著低于實(shí)施例1本發(fā)明的方法。例如在對(duì)比實(shí)施例1中，缺少了聚乙二醇辛基苯基醚，脫細(xì)胞絨毛膜的細(xì)胞附著性顯著降低，保留的天然空隙也較少;對(duì)比實(shí)施例2和對(duì)比實(shí)施例3處理后的脫細(xì)胞絨毛膜易發(fā)生卷曲，附著性也有顯著性降低;而且對(duì)比實(shí)施例4中的羊膜和絨毛膜在電鏡下相比，羊膜在S區(qū)域，即兩條黑線之間的區(qū)域內(nèi)發(fā)生了明顯的卷曲，然而絨毛膜并沒有發(fā)生卷曲，說明本發(fā)明的方法處理絨毛膜可以獲得良好的處理效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種絨毛膜脫細(xì)胞液，包括以下按重量配比的組分: 十二烷基磺酸鈉0.5份?I份;聚乙二醇辛基苯基醚0.5份?2份； 氯化鈉3份?6份;DNAse I份?3份； 蛋白酶抑制劑0.I份?0.5份;胰蛋白酶0.4份?1.2份。2.如權(quán)利要求1所述的絨毛膜脫細(xì)胞液，其特征在于:包括以下按重量配比的組分: 十二燒基磺酸鈉0.6份?0.8份;聚乙二醇辛基苯基醚0.5份?I份； 氯化鈉4份?5份;DNAse I份?2份； 蛋白酶抑制劑0.I份?0.4份;胰蛋白酶0.6份?0.8份。3.如權(quán)利要求1所述的絨毛膜脫細(xì)胞液，其特征在于:包括以下按重量配比的組分: 十二烷基磺酸鈉0.8份;聚乙二醇辛基苯基醚0.6份； 氯化鈉5份;DNAse 2份； 蛋白酶抑制劑0.2份;胰蛋白酶0.8份。4.如權(quán)利要求1所述的絨毛膜脫細(xì)胞液，其特征在于:包括以下按重量配比的組分: 十二烷基磺酸鈉I份;聚乙二醇辛基苯基醚0.5份； 氯化鈉4份;DNAse 1.5份； 蛋白酶抑制劑0.4份;胰蛋白酶0.6份。5.如權(quán)利要求1所述的絨毛膜脫細(xì)胞液，其特征在于:包括以下按重量配比的組分: 十二烷基磺酸鈉I份;聚乙二醇辛基苯基醚2份； 氯化鈉6份;DNAse 2.5份； 蛋白酶抑制劑0.5份;胰蛋白酶I份。6.如權(quán)利要求1所述的絨毛膜脫細(xì)胞液，其特征在于:所述絨毛膜脫細(xì)胞液的溶質(zhì)為水。7.基于權(quán)利要求1?6中任一所述絨毛膜脫細(xì)胞液的絨毛膜脫細(xì)胞方法，包括將絨毛膜置于絨毛膜脫細(xì)胞液中處理的步驟。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: 將絨毛膜放入絨毛膜脫細(xì)胞液中并置于水平搖床上，在室溫下?lián)u動(dòng)處理48h?72h;然后取出放入純水中振蕩沖洗;沖洗完畢后滅菌、冷凍保存。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: 將絨毛膜放入絨毛膜脫細(xì)胞液中并置于水平搖床上，搖床轉(zhuǎn)速為100?200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)處理48h?72h;然后放入搖床上的純水中進(jìn)行清洗，搖床轉(zhuǎn)速為100?200轉(zhuǎn)/分鐘，室溫?fù)u動(dòng)處理0.5h?2h，重復(fù)5?8次;將清洗好的絨毛膜放入0.1 %?0.3%的過氧乙酸溶液中浸泡3h?6h滅菌，滅菌后置于_80°C冷凍4h，再使用凍干機(jī)凍干保存。10.使用權(quán)利要求1?6中任一所述絨毛膜脫細(xì)胞液以及權(quán)利要求7?9中任一所述絨毛膜脫細(xì)胞方法獲得的絨毛膜制品。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種絨毛膜脫細(xì)胞液，包括十二烷基磺酸鈉0.5份~1份；聚乙二醇辛基苯基醚0.5份~2份；氯化鈉3份~6份；DNAse 1份~3份；蛋白酶抑制劑0.1份~0.5份；胰蛋白酶0.4份~1.2份。本發(fā)明彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中缺少脫絨毛膜細(xì)胞的制劑，本發(fā)明通過調(diào)節(jié)脫細(xì)胞液的配方，可以使制備得到的絨毛膜產(chǎn)品保留天然空隙及纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞易附著，且不易發(fā)生卷曲，便于商業(yè)化生產(chǎn)，可廣泛推廣應(yīng)用。
【IPC分類】A61L27/36, A61L27/58
【公開號(hào)】CN105709276
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610061011
【發(fā)明人】李俊, 黃海森, 張學(xué)超
【申請(qǐng)人】成都清科生物科技有限公司