本發明涉及α-亞麻酸的新的醫藥用途。
背景技術：
1型纖溶酶原激活物抑制物(plasminogenactivatorinhibitortype-1，pai-1)為組織型纖溶酶原激活物(t-pa)和尿型纖溶酶原激活物(u-pa)的生理性抑制因子。
pal-1由血管內皮細胞、巨核細胞、肝細胞等合成，其他細胞亦有分泌pai-1的功能。pal-1主要存儲于血小板α顆粒中，天然pai-1分子含379個氨基酸，分子量為50.0kd，活性中心的氨基酸為arg346-met347。它是纖溶系統的主要抑制劑之一，纖溶系統包括酶原纖溶酶原，t-pa、u-pa是纖溶系統的主要激活劑，通過激活纖溶酶原形成纖溶酶而溶解纖維蛋白，生成纖維蛋白降解產物；而pai-1為t-pa、u-pa的主要生理抑制劑，可以與t-pa或u-pa活性中心的絲氨酸以1：1發生不可逆的共價結合，形成了穩定的復合物，導致t-pa或u-pa的失活,降低了其活性并因此減弱纖溶能力，從而導致纖維蛋白清除力下降、纖維蛋白沉積，同時與血管壁結合，促進血栓的形成和延展。
大量臨床研究證實，pai-1是心腦血管等血栓栓塞性疾病的危險因子，pai-1活性增高會導致血纖維蛋白降解作用的降低，從而引發一系列的心血管疾病，如：心肌梗塞、腦梗死及冠狀動脈血栓形成、心臟術后的再栓塞、內源性血栓溶解和再灌注的提高等。
此外，pai-1的活性水平升高或降低與多種疾病有關，包括那些與纖溶系統損傷有關的疾病和病癥。例如：多囊卵巢綜合征、妊高征、雌激素缺乏誘導的骨丟失、肺纖維化、腎纖維化、糖尿病、慢性牙周炎、淋巴瘤、與細胞外基質積聚有關的疾病(如糖尿病腎病)、與新血管生成有關的疾病、炎性疾病、神經系統腫瘤、阿爾茨海默病、與感染有關的血管損傷以及與u-pa水平升高有關的疾病(例如乳癌、卵巢癌)。
因此，可以通過調節pai-1的活性來治療因pai-1活性異常所致的疾病，人們需要pai-1活性的調節劑以及在治療與pai-1活性變化有關的疾病中使用它們來調節pai-1的活性的方法。
目前臨床上針對那些與纖溶系統損傷有關的心腦血管等血栓栓塞性疾病所使用的溶栓藥主要是些大分子的生物制品，它們都有一個共同的缺陷，即出血并發癥，同時治療費用高、半衰期短，并且由于是大分子，因此易導致過敏。目前尚無針對pai-1的小分子藥物上市，而小分子的pai-1抑制劑具有獨特的作用機理和高選擇性，它與抗凝血和抗血小板凝聚藥不同，將有可能避免以上副作用，不容易導致過敏，不會增加出血的危險等。
α-亞麻酸簡稱lna，中文別名：亞麻酸，學名9,12,15-十八碳三烯酸，為全順式,非共軛立體構型,屬ω-3系列多烯脂肪酸(簡寫pufa)，含三個雙鍵的不飽和脂肪酸。英文名稱：alpha-linolenicacid；英文別名:a-linolenicacid；9,12,15-all-cis-octadecatrienoicacid；(z,z,z)-9,12,15-octadecatrienoicacid；linolenicacid；allcis-delta-9,12,15-octadecatrienoate；(9z,12z,15z)-octadeca-9,12,15-trienoicacid；cas:463-40-1。物理性質：熔點：-11℃(lit.)；沸點：230-232℃1mmhg(lit.)；密度：0.914g/mlat25℃(lit.)。其分子式為c18h30o2，分子量:278.43；
α-亞麻酸來源廣泛，常以甘油酯的形式存在于深綠色植物中，常見堅果、種子類食物如核桃、松子、榛子等中也含有較多的α-亞麻酸。α-亞麻酸作為人體必需脂肪酸,是體內各組織生物膜的結構材料,是構成人體組織細胞的主要成分，在體內能合成、代謝，轉化為機體必需的生命活性因子dha和epa，也是合成人體一系列前列腺素的前體。然而，它在人體內不能合成，必須從體外攝取。人體一旦缺乏，即會引導起機體脂質代謝紊亂，導致免疫力降低、健忘、疲勞、視力減退等癥狀的發生；尤其是嬰幼兒、青少年如果缺乏亞麻酸，就會嚴重影響其智力正常發育，這一點已經被國內外科學家所證實，并被世界營養學界所公認。
α-亞麻酸及其代謝物具有益智、提高記憶力、保護視力、降脂、降壓、抑制血小板凝聚、防心肌梗死和腦梗死、延緩衰老、抗過敏及抑制癌癥的發生和轉移等作用。另外，缺乏α-亞麻酸，維生素、礦物質、蛋白質等營養素不能被有效吸收和利用，造成營養流失等。
技術實現要素：
本發明的目的是公開α-亞麻酸在制備調節1型纖溶酶原激活物抑制物(pai-1)活性的藥物中的應用，以克服現有技術存在的缺陷。
藥效學實驗結果證實，所述的α-亞麻酸對1型纖溶酶原激活物抑制物(以下簡稱pai-1)具有雙向調節作用，且對細胞的毒性低，可用于調節pai-1的活性，可用于制備調節pai-1活性的藥物。
所述的α-亞麻酸為含α-亞麻酸的天然產物提取物，可采用公知的技術，從富含α-亞麻酸的紫蘇子、亞麻籽、紫草籽馬齒莧種子、黑加侖種子等植物中提取，提取方法可采用壓榨法、溶劑法(如文獻：崔寶玉，劉喆，闞侃，等.亞麻油提取工藝的研究進展.中國麻業科學，2010,32(4)：238-241)、co2超臨界萃取法(如文獻：輝國鈞，葛發歡，王海波，等.超臨界co2萃取工藝在紫蘇子脂肪油提取中的應用研究.中國醫藥工業雜志，1996,27(2)：51)。
本發明還涉及一種pai-1活性調節劑，包括治療有效量的α-亞麻酸和醫藥學上可接受的載體，所述的載體，如稀釋劑、賦形劑(比如水)等，填充劑如淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纖維素等，粘合劑如纖維素衍生物、明膠和聚乙烯吡咯烷酮等，潤濕劑如甘油等，表面活性劑如十六烷醇等，崩解劑如碳酸鈣、交聯聚維酮、羧甲基淀粉鈉等，潤滑劑如滑石粉、硬脂酰富馬酸鈉、硬脂酸鈣和鎂等中的一種及以上。
可以采用本領域公知的方法，將所述的pai-1調節劑，制備成為片劑、丸劑、滴丸、軟膠囊、硬膠囊、半固體制劑、散劑、顆粒劑、合劑、混懸劑、糖漿劑、氣霧劑、口服液、注射劑及其它適當的劑型。
通常，本發明的化合物，可以藥物組合物的形式，通過本領域已知的施用治療藥物的任何方法施用于需要治療的患者，包括口服、口腔、局部、全身(如皮膚、粘膜給藥)或非腸道給藥(如肌肉、皮下、靜脈注射)，劑量一般為0.1～20g/天，具體可由醫師根據患者的具體情況決定，每日單次或多次施用。
本發明的有益效果是：
活性成分α-亞麻酸來自于含α-亞麻酸的天然產物提取物，且對pai-1具有雙向調節作用，對細胞的毒性低，對于pai-1活性異常所致的多種疾病治療效果明顯，長期服用，沒有依賴性，由于是小分子，不容易導致過敏，且由于它是針對pai-1作用的，具有獨特的作用機理和高選擇性，不會增加出血的危險等。
附圖說明
圖1為α-亞麻酸結構簡式。
圖2為pai-1活性檢測標準曲線圖。
圖3為α-亞麻酸對pai-1蛋白活性的影響。
圖4為α-亞麻酸對正常hmc細胞增殖的影響。
圖5為α-亞麻酸對tgf-β1誘導的hmc分泌pai-1含量的影響。
圖6為α-亞麻酸對tgf-β1誘導的hmc所分泌的pai-1活性的影響。
具體實施方式
本發明對α-亞麻酸進行了如下藥效學實驗：
1、α-亞麻酸對pai-1蛋白活性的影響
2、α-亞麻酸對人腎小球系膜細胞(hmc)的細胞增殖的影響
3、α-亞麻酸對正常hmc細胞分泌pai-1的含量和活性的影響
4、α-亞麻酸對tgf-β1誘導的hmc細胞分泌pai-1的含量和活性的影響
實施例1α-亞麻酸對pai-1蛋白活性的影響
通過α-亞麻酸與pai-1蛋白的直接作用，觀察其對pai-1蛋白活性的影響。將不同濃度的α-亞麻酸與pai-1活性蛋白溶液在37℃共同孵育,采用試劑盒檢測pai-1蛋白的活性。
1.1實驗器材
儀器：co2恒溫細胞培養箱(品牌：thermo)；細胞酶標儀(規格：victorx5，perkinelmer，usa)；pg型移液器(gilson)；多微孔板振蕩器(規格：si-4003，浩瀚有限公司)
試劑：磷酸鹽緩沖液(pbs)(hyclone)；二甲基亞砜dmso(國藥集團化學試劑有限公司，批號20120705)
材料：人纖溶酶原激活物抑制劑-1(pai-1)活性測定試劑盒(lot：201403，上海易利生物科技有限公司)；96孔細胞培養板(nuncthermo，lot：3000000127)；α-亞麻酸(分析對照品，≥98％，中國藥品生物制品鑒定所)。
1.2實驗方法
1.2.1pai-1標準品溶液的配制
取pai-1活性檢測試劑盒中的pai-1對照品(400iu/l)150μl，用標準品稀釋液稀釋成200iu/l、100iu/l、50iu/l、25iu/l、12.5iu/l的系列濃度，備用。
1.2.2pai-1蛋白溶液的配制
取pai-1活性檢測試劑盒中的pai-1對照品(400iu/l)380μl，用pbs稀釋至1085μl，混勻，備用。
1.2.3α-亞麻酸溶液的配制
精密稱取α-亞麻酸，加入適量的dmso溶液，配成10mg/ml的濃度，作為母液。取適量母液，用pbs稀釋成10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml的系列濃度。
1.2.4待測樣品的制備
將1.2.2項下的pai-1蛋白溶液加入96孔板中，每孔90μl，同時加入1.2.3項下系列濃度的α-亞麻酸溶液，每孔90μl，設立pai-1對照組(不加α-亞麻酸)。輕輕晃動混勻后放入37℃恒溫箱中孵育45min，取出，備用。
1.2.5pai-1蛋白活性的測定
采用pai-1活性檢測試劑盒檢測各孔溶液中pai-1的活性。具體操作步驟如下：
①加樣：設立空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余操作步驟相同)，在酶標包被板上分別準確加入系列濃度的pai-1標準品溶液，每孔加樣50μl，每組設立2個復孔。待測樣品每孔加入50μl樣品，每組設立3個復孔。
②溫育：封板膜封板后置37℃溫育30min。
③配液：將30倍濃縮洗滌液用超純水30倍稀釋后備用。
④洗滌：揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加200μl洗滌液，靜置30s后棄去。重復5次，拍干。
⑤加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
⑥溫育：操作同②。
⑦洗滌：操作同④。
⑧顯色：每孔加入顯色劑a50μl，再加入顯色劑b50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。
⑨終止：每孔加終止液50μl。
⑩測定：在450nm波長下檢測各孔吸光度值。
1.2.6統計學方法
用spss19.0軟件對所有數據進行統計分析。同一樣品各組間采用單因素方差分析，若方差齊性，組間比較采用lsd檢驗；若不齊，組間比較采用dunnet’st3。所測值用均數±標準差
1.3實驗結果
1.3.1pai-1蛋白活性檢測標準曲線
不同濃度的pai-1蛋白標準品溶液在450nm下的吸光度值見表1。
表1不同濃度pai-1標準品吸光度值(
根據表1中的數據，用空白孔的od值進行校正，以pai-1活性濃度為橫坐標，所測od值為縱坐標作標準曲線，得直線方程為：y＝0.0205x-0.1261，r＝0.9923，見附圖2。
1.3.2α-亞麻酸對pai-1蛋白活性的影響
表2α-亞麻酸作用于pai-1蛋白的活性檢測結果(
注：*表示與pai-1組比較p＜0.05，**表示與pai-1組比較，p＜0.01.
10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml系列濃度的α-亞麻酸對pai-1的活性影響見表2、附圖3。從表2和附圖3中可以看出，與pai-1對照組比較，5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的α-亞麻酸可增強pai-1的活性，p均小于0.01，說明結果具有顯著性差異，且隨著濃度增大而作用增強；而40μg/ml和80μg/ml兩個濃度的α-亞麻酸則表現出顯著降低pai-1的活性，p也小于0.01，同樣具有劑量依賴性。
上述的實驗結果表明α-亞麻酸可以直接作用于pai-1蛋白，對pai-1蛋白的活性具有雙向調節的作用，在20μg/ml的濃度以下，可顯著增強pai-1蛋白的活性，具有劑量依賴性；當濃度在40μg/ml以上時，則表現出很強的抑制作用，可十分顯著地抑制pai-1的活性，同樣具有劑量依賴性。
實施例2α-亞麻酸對人腎小球系膜細胞(hmc)增殖的影響
2.1實驗材料
儀器：實時無標記細胞多功能分析儀(xcelligencertcadp)；victorx5型細胞酶標儀(perkinelmer，usa)；escooptimair垂直流超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；co2恒溫細胞培養箱(thermo)；壓力蒸汽滅菌鍋(tuttnauer3850mlv)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；倒置顯微鏡(nikon，japan)；dt5-3型低速臺式自動平衡離心機(北京時代北利離心機有限公司)
試劑：1640培養基(gibco，lot：8114011)、胎牛血清(gibco，lot：1259720，廣州必第生物科技有限公司)、0.25％胰edta-胰蛋白酶消化液(thermo，lot：j130038)、青鏈霉素混合液(100x)(solarbio，lotno.20120626)
α-亞麻酸(分析對照品，≥98％，中國藥品生物制品鑒定所)。人腎小球系膜細胞(hmc)(購自中南大學湘雅中心實驗室細胞庫)。
2.2實驗方法
2.2.1細胞培養基的配制
取1640培養基500ml，加入胎牛血清(fbs)56.180ml，青鏈霉素混合液(100x)5.618ml，即配制成含10％胎牛血清和1％青鏈霉素混合液(100x)的培養基。
2.2.2人腎小球系膜細胞的培養和傳代
取出細胞凍存管，融化后吸出細胞懸液，注入已加入細胞懸液3倍量的含血清培養基的離心管中，離心，吸棄上清液，用含血清的培養基適當稀釋后接種到培養瓶中培養，48h后更換培養基。待細胞鋪滿瓶底80％，傳代。吸棄細胞培養瓶中舊的培養基，加適量磷酸鹽緩沖液(pbs)輕輕沖洗細胞，吸棄pbs，加入胰蛋白酶適量，顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓欲脫壁時，加入胰蛋白酶2～3倍量的含血清培養基終止消化。吸取瓶內培養液，從培養瓶底部一邊開始到另一邊結束，反復吹打瓶壁細胞，到細胞完全脫離瓶壁為止。吸取瓶內細胞混懸液，注入離心管中，1000r/min離心5min。吸棄上清液，加入含血清的培養基適當稀釋后混勻，接種到新的培養瓶中，放入到co2恒溫細胞培養箱中培養，48h后更換培養基。
2.2.3細胞種板
按2.2.2項下消化細胞。離心后，吸棄上清液，加入含血清的培養基適當稀釋后混勻，計數。以6000個/孔的細胞密度種于96孔細胞培養板中，co2恒溫細胞培養箱中培養48h。
2.2.4細胞給藥分組
用含10％血清和1％雙抗的1640培養基配制α-亞麻酸對照品的樣品溶液，分為正常對照組、不同濃度的正常給藥組，hmc種板24h后，吸棄細胞上清液，按下述分組給藥，每孔200μl，每組至少設置3個復孔。
具體的分組和給藥方案如下：
組1：正常對照組(只加含血清的培養基不給藥)
組2：加α-亞麻酸5μg/ml
組3：加α-亞麻酸10μg/ml
組4：加α-亞麻酸20μg/ml
組5：加α-亞麻酸40μg/ml
組6：加α-亞麻酸80μg/ml
2.2.5α-亞麻酸對hmc細胞增殖的影響
mtt法檢測各組中hmc的增殖情況。給藥48h后，加入mtt溶液(15μl/孔)，37℃細胞培養箱中孵育4h后加入dmso溶液(150μl/孔)，采用酶標儀在570nm處檢測。
2.2.6統計學分析
用spss19.0軟件對所有數據進行統計分析。同一樣品各組間采用單因素方差分析，若方差齊性，組間比較采用lsd檢驗；若不齊，組間比較采用dunnet’st3。所測值用均數±標準差
2.3實驗結果
α-亞麻酸對正常培養的hmc細胞增殖的影響見表3、附圖4。與正常對照組比較，α-亞麻酸表現為低濃度的各組抑制hmc的增殖，隨著濃度增加，其抑制作用越弱，高濃度時能顯著促進正常hmc的增殖，顯示出對hmc細胞增殖具有雙向調節功能。
表3給藥48h后570nm處各樣品濃度吸光度值(
注：*表示與正常對照組比較，p＜0.05
實施例3α-亞麻酸對正常的hmc細胞分泌pai-1含量及活性的影響
人腎小球系膜細胞(hmc)具有分泌pai-1的功能，本實驗主要考察α-亞麻酸對hmc細胞分泌pai-1功能的影響以及對其所分泌的pai-1活性的影響。
3.1實驗器材
儀器：多微孔板振蕩器(規格：si-4003，浩瀚有限公司)；垂直層流超凈臺、co2恒溫細胞培養箱、細胞酶標儀、dt5-3型低速臺式自動平衡離心機等同3.1。
試劑：磷酸鹽緩沖液(pbs)(hyclone)；二甲基亞砜dmso(國藥集團化學試劑有限公司，批號20120705)；1640培養基、胎牛血清、青鏈霉素混合液、0.25％edta-胰蛋白酶消化液等試劑同3.1。
材料：滅菌ep管(qsp，廣州鼎國生物科技有限公司)；人纖溶酶原激活物抑制劑-1(pai-1)活性測定試劑盒(lot：201402，上海易利生物科技有限公司)；96孔細胞培養板(nuncthermo，lot：3000000127)；人pai-1含量測定試劑盒(r&d，lot：313023)
α-亞麻酸(分析對照品，≥98％，中國藥品生物制品鑒定所)。人腎小球系膜細胞(hmc)(購自中南大學湘雅中心實驗室細胞庫)。
3.2實驗方法
3.2.1細胞培養及分組給藥
同2.2.1～2.2.4項下操作。
3.2.2hmc上清液中pai-1蛋白活性和含量的測定
收集給藥48h后細胞上清液，作為樣品。采用pai-1活性檢測試劑盒和pai-1含量檢測試劑盒分別檢測上清液中pai-1蛋白的活性和含量。活性檢測試劑盒測定步驟見1.2.5。含量檢測試劑盒測定步驟如下：
①標準品溶液的稀釋：將試劑盒中的pai-1標準品用1ml超純水溶解，作為母液，此時pai-1含量為200ng/ml。校正稀釋液rd5-17(calibratordiluentrd5-17)依次稀釋為20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.312ng/ml的系列濃度。
②加樣：取出酶包被板，每孔加入50μl檢測稀釋液rd1-57(assaydiluentrd1-57)，再加入50μl標準品溶液或樣品，每組至少設置3個復孔。
③孵育：封板膜封板，室溫孵育2h。
④洗滌：揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加400μl洗滌液，靜置30s后棄去。重復4次，拍干。
⑤每孔加入200μlpai-1結合物(pai-1conjugate)。
⑥溫育：操作同③。
⑦洗滌：操作同④。
⑧顯色：取適量顯色劑a和顯色劑b等體積混勻，每孔加入混合顯色劑200μl，室溫避光孵育30min。
⑨終止：每孔加終止液50μl，此時顏色由藍變黃。
⑩測定：在校正波長為570nm下的450nm波長下檢測各孔吸光度值。
根據pai-1標準品溶液的濃度和測得的od值，做雙對數圖，得到擬合直線方程。
將試劑盒檢測樣品所得的od值，根據pai-1含量檢測試劑盒標準曲線中擬合的直線方程進行換算，并乘以稀釋倍數5，即得到相應pai-1含量數值。為了避免細胞增值的影響，統一將細胞基數調整為6000個/孔。即pai-1活性＝(pai-1活性數值)/相應細胞數目×6000。
3.2.3統計學分析
用spss19.0軟件對所有數據進行統計分析。同一樣品各組間采用單因素方差分析，若方差齊性，組間比較采用lsd檢驗；若不齊，組間比較采用dunnet’st3。所測值用均數±標準差
3.3實驗結果
3.3.1α-亞麻酸對正常hmc細胞分泌pai-1功能的影響
檢測各細胞上清液中pai-1的含量，考察α-亞麻酸對正常hmc細胞分泌pai-1功能的影響，檢測結果見表4。從表4可以看出，與正常對照組比較，α-亞麻酸對正常的hmc細胞分泌pai-1的功能基本沒有影響。
表4正常給藥組細胞上清液中pai-1含量檢測結果(
注：*表示與正常對照組組比較，p＜0.05，**表示與正常對照組組比較，p＜0.01
3.3.2α-亞麻酸對正常hmc細胞分泌的pai-1活性的影響
實驗結果見表5。分析表5的數據可以知道，α-亞麻酸對pai-1蛋白的活性有影響：在較低濃度時(40μg/ml以下)α-亞麻酸可以促進pai-1的活性，具有顯著性差異，80μg/ml以上濃度則對pai-1的活性沒有太大影響。
表5正常給藥組細胞上清液中pai-1活性檢測結果(
注：*表示與正常對照組組比較，p＜0.05
實施例4α-亞麻酸對tgf-β1誘導的hmc細胞分泌pai-1含量及活性的影響
文獻研究表明，在tgf-β1的誘導下，人腎小球系膜細胞(hmc)能夠大量分泌pai-1，導致許多疾病的發生、發展。本實驗主要考察α-亞麻酸對tgf-β1誘導的hmc細胞分泌pai-1功能的影響以及對其所分泌的pai-1活性的影響。
4.1實驗材料
儀器：多微孔板振蕩器(規格：si-4003，浩瀚有限公司)；垂直層流超凈臺、co2恒溫細胞培養箱、細胞酶標儀、dt5-3型低速臺式自動平衡離心機等同3.1。
試劑：磷酸鹽緩沖液(pbs)(hyclone)；二甲基亞砜dmso(國藥集團化學試劑有限公司，批號20120705)；1640培養基、胎牛血清、青鏈霉素混合液、0.25％edta-胰蛋白酶消化液等試劑同3.1。
材料：滅菌ep管(qsp，廣州鼎國生物科技有限公司)；人纖溶酶原激活物抑制劑-1(pai-1)活性測定試劑盒(lot：201402，上海易利生物科技有限公司)；96孔細胞培養板(nuncthermo，lot：3000000127)；人pai-1含量測定試劑盒(r&d，lot：313023)
α-亞麻酸(分析對照品，≥98％，中國藥品生物制品鑒定所)。人腎小球系膜細胞(hmc)(購自中南大學湘雅中心實驗室細胞庫)。轉化生長因子tgf-β1蛋白(peprotech，lot#0613354)。
4.2實驗方法
4.2.1細胞培養及種板
同2.2.2～2.2.3項下操作。
4.2.2細胞給藥分組
用含10％血清和1％雙抗的1640培養基配制α-亞麻酸對照品的樣品溶液。將培養的細胞分為正常對照組、模型對照組、模型給藥組，其中模型給藥組又分為α-亞麻酸系列濃度組。具體的分組和給藥方案如下：
組1：正常對照組(只加含血清的培養基)
組2：模型對照組：加tgf-β15ng/ml造模
模型給藥組分為以下5組，分別給予不同濃度的α-亞麻酸，具體如下：
組3：加tgf-β15ng/ml+α-亞麻酸5μg/ml
組4：tgf-β15ng/ml+α-亞麻酸10μg/ml
組5：tgf-β15ng/ml+α-亞麻酸20μg/ml
組6：tgf-β15ng/ml+α-亞麻酸40μg/ml
組7：tgf-β15ng/ml+α-亞麻酸80μg/ml
4.2.3tgf-β1誘導的hmc上清液中pai-1蛋白活性和含量的測定
細胞按上述分組種板和給藥。給藥48h后，收集細胞上清液，作為檢測的樣品。采用pai-1活性檢測試劑盒和pai-1含量檢測試劑盒檢測上清液中pai-1蛋白的活性和含量。活性檢測試劑盒測定步驟詳見1.2.5。含量檢測試劑盒測定步驟見3.2.2。
4.2.4統計學分析
用spss19.0軟件對所有數據進行統計分析。同一樣品各組間采用單因素方差分析，若方差齊性，組間比較采用lsd檢驗；若不齊，組間比較采用dunnet’st3。所測值用均數±標準差
4.3實驗結果
4.3.1α-亞麻酸對tgf-β1誘導的hmc細胞分泌pai-1含量的影響
實驗結果見表6和附圖5。分析表6的數據可知，tgf-β1能夠促進hmc細胞分泌pai-1，使細胞上清液中pai-1的含量大幅增加，具有顯著性差異，造模成功。而80μg/ml濃度以下的α-亞麻酸協同tgf-β1促進了hmc細胞分泌pai-1的功能。
表6模型給藥組細胞上清液中pai-1含量檢測結果(
注：*表示與正常對照組組比較，p＜0.05，**表示與正常對照組組比較，p＜0.01，#表示與tgf-β1模型組比較，p＜0.05。
4.3.2α-亞麻酸對tgf-β1誘導的hmc細胞分泌的pai-1活性的影響
實驗結果見表7和附圖6。分析表7中數據可知，tgf-β1能夠使hmc所分泌的pai-1的活性升高，且具有顯著性差異。低濃度的α-亞麻酸(濃度在20μg/ml以下)具有協同作用，增強了pai-1的活性；而α-亞麻酸的濃度在40μg/ml以上時則能夠抑制pai-1的活性，使pai-1的活性趨向于正常水平，對tgf-β1誘導的hmc細胞所分泌的pai-1的活性同樣表現出雙向調節作用。
表7模型給藥組細胞上清液中pai-1活性檢測結果(
注：*表示與正常對照組組比較，p＜0.05，#表示與tgf-β1模型組比較，p＜0.05。
實施例5片劑
處方(重量)
制備方法：將α-亞麻酸、淀粉、糊精等組分混合后，制粒，加入硬脂酸鎂混勻，采用本領域公知的方法，壓片，獲得片劑，每片重量為0.5mg。
實施例6硬膠囊
處方(重量)：
α-亞麻酸0.1-50％
淀粉5-50％
糊精5-50％
制備方法：將上述組分混合后，制粒，粉碎，過120目篩，采用本領域公知的方法，裝入空心膠囊中，每粒膠囊重量為0.5mg。