本發明公開了一種白介素-12和鞭毛蛋白的新用途，具體的說，是白介素-12和鞭毛蛋白在制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途。

背景技術：

全球有20億人群感染乙肝病毒，其中2.4億是慢性乙肝病毒表面抗原(hbsag)攜帶者。慢性乙肝(chb)有一部分人是不活躍的，但有一部分人可導致肝硬化、肝癌。

近年來，應用干擾素及核苷類似物治療chb，取得很大進展，大多數患者經過治療后，血清谷丙轉氨酸(alt)、hbvdna、hbeag在外周血可以恢復正常或轉為陰性，但外周血中hbsag仍持續陽性，很難達到血清轉換(呈現抗-hbs陽性)。這些年來，國內外學者已經提出慢性乙肝功能性治愈的概念，也就是說，治療慢性乙肝除了要求alt、hbvdna、hbeag長期穩定正常以外，尚要求外周血hbsag消除，并出現乙型肝炎表面抗體，即血清由hbsag陽性轉換為陰性，并出現抗-hbs這也是對慢性乙肝治療的終點或目標。達到這個目標，就是chb功能性治愈。慢性乙型肝炎患者由于hbv特異性免疫功能降低和cd8+t細胞耗竭，使其自身不能完全清除hbv，但其體內對hbv抗原產生應答的主要是th1型細胞，因此，應用有效的免疫佐劑提高慢性乙肝患者的細胞免疫功能，誘導并維持以hbv特異性ctl為主的細胞免疫應答，對于hbv的徹底清除十分重要。

鞭毛蛋白(piliatedpseudomonasaeruginosa，ppa)能調整人體體液免疫及 細胞免疫的不平衡狀態，增加巨噬細胞和nk細胞的活性，維持t細胞的數量與比例。鞭毛蛋白同時含有ⅰ、ⅱ、ⅳ型菌毛及鞭毛蛋白，鞭毛蛋白啟動的先天固有免疫應答由tlr5介導，產生各種生物學反應，是先天性固有免疫應答和后天獲得性免疫應答中的關鍵蛋白。tlr5作為tlr家族的成員之一，已證明主要在肺臟和肝臟表達。

白細胞介素-12(il-12)作為免疫網絡中的核心細胞因子，是連接先天固有免疫與后天獲得性免疫的橋梁，能夠顯著誘導th1型細胞免疫，增強cd8+t細胞的細胞毒性，并抑制th2型細胞免疫。這些特性使其在抑制hbv復制的過程中發揮重要作用。il-12具有促進t細胞活化、增殖、裂解效應的功能，有望成為有效的免疫增強劑，以輔助cd8+t細胞的免疫應答。

現在慢性乙型肝炎治療中，hbsag(+)(滴度＜1000iu/ml)、hbeag(-)、hbv-dna(-)難以清除表面抗原。

技術實現要素：

針對上述問題，本發明的目的在于提供一種解決檢測指標為hbsag(+)(滴度＜1000iu/ml)、hbeag(-)、hbv-dna(-)的慢性乙型肝炎hbsag難以清除的問題，提供白介素-12和鞭毛蛋白作為制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途。

為解決上述技術問題，本發明提供的技術方案是這樣的：

一種白介素-12和鞭毛蛋白在制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途。

進一步的，上述的白介素-12和鞭毛蛋白在制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途，所述的慢性乙型肝炎的檢測指標為：hbsag+，滴度＜1000iu/ml，hbeag-，bv-dna-。

進一步的，上述的白介素-12和鞭毛蛋白在制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途，所述的鞭毛蛋白劑量為每劑含菌1.0×10⁹-3.0×10⁹；所述的白細胞介素-12劑量為5-10μg/劑。

與現有相比，本發明提供色技術方案采用白細胞介素-12與鞭毛蛋白制劑聯合使用作為治療hbsag(+)(滴度＜1000iu/ml)、hbeag(-)、hbv-dna(-)的慢性乙型肝炎的藥物；其中，鞭毛蛋白聯合rhil-12能顯著提高健康人和慢性乙型肝炎患者pbmcs產生ifn-γ的水平，增強其細胞免疫應答，促進慢性乙型肝炎表面抗原的清除。

附圖說明

圖1是不同濃度鞭毛蛋白聯合rhil-12誘導ifn-γ的水平；

圖2是鞭毛蛋白聯合不同濃度rhil-12誘導ifn-γ的水平；

圖3鞭毛蛋白聯合rhil-12誘導慢性乙肝患者和健康人pbmcs中ifn-γ的水平；

圖4鞭毛蛋白聯合rmil-12對乙肝水動力模型小鼠血清hbsag的作用。

具體實施方式

下面結合具體實施方式，對本發明的權利要求做進一步的詳細說明，但不構成對本發明的任何限制，任何在本發明權利要求保護范圍內所做的有限次的修改，仍在本發明的權利要求保護范圍之內。

實施例1

本發明提供的白細胞介素-12作為一種藥物用于hbsag(+)(滴度＜1000iu/ml)、hbeag(-)、hbv-dna(-)的慢性乙型肝炎的治療，使用時與鞭 毛蛋白制劑聯合使用，鞭毛蛋白聯合rhil-12能顯著提高健康人和慢性乙型肝炎患者pbmcs產生ifn-γ的水平，增強其細胞免疫應答，促進慢性乙型肝炎表面抗原的清除。

具體實驗例如下：

鞭毛蛋白最適劑量的選擇：鞭毛蛋白組(0.0075～14ng/ml)、rhil-12(1ng/ml)、不同濃度鞭毛蛋白+rhil-12、陰性對照組(細胞培養液)、陽性對照組(0.2ug/ml抗人cd3)，分別與外周血單個核細胞(pbmcs)，細胞濃度為2×10⁶/ml，37℃，5％co2孵育72h，elisa法檢測細胞培養上清中ifn-γ的含量。

結果：鞭毛蛋白聯合rhil-12誘導健康人pbmcs中ifn-γ的產生，在一定范圍內隨鞭毛蛋白濃度的升高而增加，最適稀釋度范圍為1.75-14ng/ml，見圖1。單獨鞭毛蛋白組基本不能誘導ifn-γ的產生，與陰性對照組相似；單獨應用rhil-12(1ng/ml)也能產生一定的刺激作用。

rhil-12最適劑量的選擇：rhil-12(濃度分別為0.1、0.5、1.0和2.0ng/ml)、鞭毛蛋白(3.5ng/ml)、鞭毛蛋白+不同濃度rhil-12組、陰性對照組(細胞培養液)、陽性對照組(0.2ug/ml抗人cd3)，分別與外周血單個核細胞(pbmcs)，細胞濃度為2×10⁶/ml，37℃，5％co2孵育72h，elisa法檢測細胞培養上清中ifn-γ的含量。

結果：rhil-12最適劑量的選擇：鞭毛蛋白聯合rhil-12誘導健康人pbmcs中ifn-γ的產生，在一定范圍內隨rhil-12濃度的升高而增加，最適濃度范圍為0.1-1.0ng/ml；單獨應用rhil-12也能產生刺激作用。見圖2。

鞭毛蛋白聯合rhil-12誘導慢性乙肝患者和健康人pbmcs中ifn-γ的產生：rhil-12(濃度分別為0.1、0.5、1.0和2.0ng/ml)、鞭毛蛋白(3.5ng/ml)、鞭毛 蛋白+不同濃度rhil-12組、陰性對照組(細胞培養液)、陽性對照組(0.2ug/ml抗人cd3)，分別與外周血單個核細胞(pbmcs)，細胞濃度為2×10⁶/ml，37℃，5％co2孵育72h，elisa法檢測細胞培養上清中ifn-γ的含量。

結果：鞭毛蛋白聯合rhil-12誘導慢性乙肝患者和健康人pbmcs中ifn-γ的產生：鞭毛蛋白組只誘導產生低水平的ifn-γ，rhil-12組誘導產生ifn-γ的水平較陰性對照組顯著提高；而鞭毛蛋白+rhil-12組誘導產生ifn-γ的水平顯著高于鞭毛蛋白和rhil-12組，差異均有統計學意義。見圖3。

鞭毛蛋白聯合rmil-12對乙肝水動力模型小鼠血清hbsag滴度的影響:32只乙肝水動力模型小鼠隨機分入生理鹽水組、rmil-12(100ng/只)、鞭毛蛋白(μg/只)及鞭毛蛋白+rmil-12組，每組8只。rmil-12每周給藥兩次，第一次給藥72h后再給藥一次，連續給藥三周；鞭毛蛋白每周給藥一次，連續給藥三周。注射部位為小鼠頸背部皮下。分別于給藥前、給藥后每周采血測血清中hbsag的滴度，停藥后繼續觀察三周，每周采血測血清中hbsag的滴度。

結果：鞭毛蛋白聯合rmil-12對乙肝水動力模型小鼠血清hbsag的作用：鞭毛蛋白組模型小鼠血清hbsag與給藥前比較呈低水平的下降；rmil-12組模型小鼠血清hbsag與給藥前比較顯著下降，停藥后hbsag開始反跳；而鞭毛蛋白+rmil-12組模型小鼠血清hbsag與給藥前比較低于鞭毛蛋白和rmil-12組，差異均有統計學意義，且停藥后hbsag持續下降，未見反跳。見圖4。

結果表明：hbsag特異性p肽聯合il-12有顯著促使hbsag血清轉換作用。

本發明提供一種白細胞介素-12聯合鞭毛蛋白治療hbsag(+)(滴度＜1000iu/ml)、hbeag(-)、hbv-dna(-)的慢性乙型肝炎，其可以有效地啟動先天固有性免疫和后天獲得性免疫，恢復耗竭的cd8+t細胞，外周血單個核細胞(pbmcs)產生ifnγ的水平，清除hbsag。

以上所述的僅為本發明的較佳實施例，凡在本發明的精神和原則范圍內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。