本發明涉及一種敷料，具體涉及一種應用于創面的復合敷料及其制備方法。

背景技術：

人體和動物體的創傷隨處可見，各種創傷均會造成不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損，必須通過細胞增生和細胞間基質的形成來進行組織修復。雖然目前治療創傷或止血的藥物種類多樣，琳瑯滿目，但有相當一部分止血藥物需口服后經過體內一系列復雜的生理過程來完成，而不靠其藥粉簡單地直接作用于傷口血管，來達到止血的目的。有一些藥物雖然能直接敷于傷口處，但藥物干燥，活動受傷處容易牽扯傷口，引起疼痛或再度開裂，且由于藥物不能被皮膚吸收，使用后或換藥時需要清理傷口處留下的藥沫或碎屑，造成病人的痛苦，還可能延緩傷口的愈合。

本申請的敷料將中國傳統醫學與生物材料結合，構建模擬機體組織和功能的基質和支架系統，重建或恢復皮膚屏障是受傷創面治療的最終目標。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種應用于創面的復合敷料及其制備方法。本發明的目的是通過以下技術方案來實現：

一種應用于創面的復合敷料，所述敷料的成分為：毛發角蛋白和中藥成分，該中藥成分的成分包括三七、重樓、獨定子、冰片和麝香。

進一步地，所述毛發角蛋白和中藥成分的重量比為1～3:3～1；所述中藥成分中的各種成分的重量份數為：三七20～40份、重樓10～25份、獨定子10～20份、冰片20～40份和麝香0.001～0.8份。

進一步地，所述毛發角蛋白由毛發制備而成，所述毛發包括人頭發和動物毛發中的任意一種。

進一步地，所述毛發角蛋白包括顆粒狀的毛發角蛋白或凝膠化得毛發角蛋白；所述動物毛發包括羊毛。

一種根應用于創面的復合型敷料的制備方法，所述方法包括以下步驟：

(1)毛發角蛋白的制備：該毛發角蛋白包括顆粒狀的毛發角蛋白或凝膠化得毛發角蛋白：具體方法為：

S1：脫脂與軟化：稱取毛發進行脫脂和軟化；

S2：脫色：將軟化后的毛發放置于脫色溶液中進行脫色，所述脫色溶液的成分為焦磷酸鈉3～5重量份、過硫酸鉀1～2重量份、雙氧水70～90體積份、濃氨水22～33體積份以及水350～450體積份；

S3：清洗、烘干：將脫色后的毛發進行清洗，并且干燥；

S4：粉末制備：在干燥后的毛發剪碎，并加入液氮冷凍研磨，得到長度為0.1～2mm的毛發粗粉；將粗粉放在球磨罐中，放入瑪瑙珠，加入生理鹽水，旋轉，球磨，直至粒徑50μm～90μm為止，則為毛發角蛋白顆粒勻漿；

S5：毛發角蛋白顆粒：在勻漿中加入生理鹽水進行離心，棄去上清液，并去除沉淀的表層和底層，取中段顆粒大小均勻的毛發角蛋白，加生理鹽水混勻繼續離心，重復上述操作2～4次，最后仍然取中段顆粒大小均勻的毛發角蛋白，則得到為高純度的顆粒狀的毛發角蛋白；

S6：滅菌：包裝，密封，采用鈷⁶⁰輻照法滅菌，保存，待用；

S7：凝膠化的毛發角蛋白：將步驟S6中滅菌后的顆粒狀的毛發角蛋白加入水，充分混勻，放置于溫箱中孵育2-3小時，至呈現較為均一的顏色和性狀為止；滅菌，得到毛發角蛋白凝膠；

(2)中藥成分的制備：

按比例稱取中藥成分中的三七、重樓、獨定子、冰片和麝香，將各種分別研磨成粉末，并混合均勻得到中藥成分；

(3)敷料的制備：

將步驟(1)中制備得到的顆粒狀的毛發角蛋白或凝膠化的毛發角蛋白與步驟(2)中得到的中藥成分混合分散均勻，得到復合輔料。

進一步地，步驟(1)的S1中，所述脫脂和軟化的方法為：用乙醇浸泡20～60分鐘，浸泡過程中每間隔3～10分鐘攪拌一次，浸泡完畢后流水沖洗；沖洗后，將毛發放置于次氯酸鈉與水配制的溶液中浸泡20～60分鐘，在該浸泡過程中間隔3～10分鐘攪拌一次，浸泡完畢后流水沖洗；

步驟(1)的S2中，將軟化后的毛發放置于脫色溶液中2-3個小時，在脫色過程中間隔10～30分鐘攪拌一次，浸泡完畢后流水沖洗，洗掉脫色溶液為止；所述脫色溶液的成分為焦磷酸鈉4重量份、過硫酸鉀1.5重量份、雙氧水80體積份、濃氨水27.5體積份以及水400體積份；

步驟(1)的S3中，將脫色后的毛發在水中浸泡，浸泡完畢用水沖洗，過濾，在鼓風干燥箱中37℃烘干過夜。

進一步地，步驟(1)的S1中，所述次氯酸鈉與水的體積比為1～5:9，所述次氯酸鈉為10％次氯酸鈉；

步驟(1)的S2中，將放置有毛發的脫色溶液置于37℃恒溫中進行脫色；所述焦磷酸鈉為99％焦磷酸鈉，過硫酸鉀為99.5％過硫酸鉀，雙氧水為30％雙氧水，濃氨水為25％濃氨水。

進一步地，步驟(1)的S4中，球磨：將粗粉2g，放在球磨罐中，放入瑪瑙珠，加入生理鹽水10ml，球磨1～3小時，在顯微鏡下觀察粒徑大小，再加入生理鹽水5ml繼續研磨，直至形成粒徑約60μm-80μm；所述瑪瑙珠的數量：直徑1cm瑪瑙珠20顆，直徑60mm瑪瑙珠100顆；

步驟(1)的S6中，將得到的高純度的毛發角蛋白泥包裝采用鈷60輻照法滅菌，劑量12Kg。

進一步地，步驟(1)的S7中，顆粒狀的毛發角蛋白中加入水充分混勻，放置于37℃溫箱孵育2-3小時。

進一步地，所述毛發角蛋白為凝膠化的毛發角蛋白，所述凝膠化的毛發角蛋白的濃度(g/ml)為0.1～5％。

進一步地，所述凝膠化的毛發角蛋白的濃度為0.8～3％。

進一步地，所述毛發角蛋白凝膠的制備方法還能夠通過以下方法替換：

(1)毛發角蛋白成鹽：①稱取毛發，在毛發中加入乙醇和水的混合溶液，加熱，逐漸升高溫度至溶液開始回流，邊回流邊滴加堿溶液，至pH值為6.5～7.5時，回流與滴加同時結束，結束后，繼續攪拌，使反應完全，得到成鹽毛發角蛋白；②將所得到的成鹽毛發角蛋白濾出，洗液沖洗，洗滌至不呈堿性，干燥，得到毛發角蛋白磺酸鹽；③將所得到的毛發角蛋白磺酸鹽粉碎至微米級，凍干，得到毛發角蛋白磺酸鹽粉末；(2)毛發角蛋白凝膠的制備：稱取毛發角蛋白磺酸鹽粉末，加入水，充分混勻，放置于溫箱中，至呈現較為均一的顏色和性狀為止，采用鈷60輻照法滅菌，得到毛發角蛋白凝膠。

本發明提供了一種應用于創面的復合敷料及其制備方法，其主要具有的有益效果為：

本發明將中國傳統中醫學與生物材料結合，毛發角蛋白生物材料具有利于細胞滲入、粘附和增殖的三維支架結構，在細胞粘附和增殖方面具有明顯優于其他材料的特性，同時具有神經誘導性，在止血方面也顯示出很好的效果，以毛發角蛋白凝膠等作為中藥成分外傷修復的載體，可以形成具有生物敷料性質的創面覆蓋物，其是一種效果極佳的創面覆蓋物，同時，隨著創傷慢慢愈合和自身皮膚生長，為促進皮膚的再生提供一個有利于創面愈合的環境。具體地，(1)其止血效果非常好，并能有效加速創面愈合；(2)其有效阻止細菌感染，(3)具有良好的生物相容性，(4)控制和吸收創面滲液，(5)透氣性強，適合氣體和水蒸氣透過，(6)保護新生組織，(7)無毒副作用等優勢，采用人頭發或羊毛等毛發制備敷料無免疫原性，不會過敏；；(8)只需外敷，使用方便，效果顯著；更重要的是，該工程敷料能自行溶解被機體吸收，免除了解除時流血多及病人的痛苦，也不會留下碎屑而延緩傷口的愈合，避免普通輔料黏著創面的再次損傷，為促進皮膚的再生提供一個有利于創面愈合的環境。該工程敷料能夠極好的應用于人體或動物體的創傷面處。

附圖說明

下面根據附圖對本發明作進一步詳細說明。

圖1是本發明實施例所述的在光鏡下觀察毛發角蛋白的結構示意圖；

圖2是本發明實施例所述的在掃描電鏡(1.69×103)下觀察毛發角蛋白的結構示意圖；

圖3是本發明實施例所述的在掃描電鏡(1.25×103)下觀察毛發角蛋白的結構示意圖；

圖4是本發明實施例所述的在透射電鏡(1×105)下觀察毛發角蛋白的結構示意圖；

圖5是本發明實施例所述的在透射電鏡(2×105)下觀察毛發角蛋白的結構示意圖；

圖6是本發明實施例所述的載有中藥成分的毛發角蛋白的掃描電鏡圖；

圖7是本發明實施例所述的將復合敷料敷于創面的動物模型示意圖；

圖8是本發明實施例所述的21天以后創面恢復后的示意圖；

圖9是本發明實施例所述的鼠真皮成纖維細胞的染色顯示Ⅰ型膠原蛋白分泌情況；

圖10是本發明實施例所述的4％的凝膠化的毛發角蛋白的性狀。

具體實施方式

本發明實施例所述的一種應用于創面的復合敷料及其制備方法。下面以具體實驗案例為例來說明具體實施方式，應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

實施例1

一種應用于創面的復合敷料，所述敷料的成分為：毛發角蛋白和中藥成分，該中藥成分的成分包括三七、重樓、獨定子、冰片和麝香。

毛發角蛋白和中藥成分的重量比為1～3:3～1，優選1:1～2，例如1:1。

中藥成分中的各種成分的重量份數可以為：①三七20份、重樓25份、獨定子10份、冰片20份和麝香0.001份；②三七40份、重樓10份、獨定子20份、冰片40份和麝香0.8份；③三七30份、重樓18份、獨定子15份、冰片30份和麝香0.1份；④三七25份、重樓12份、獨定子18份、冰片35份和麝香0.03份；⑤三七33份、重樓23份、獨定子13份、冰片25份和麝香0.008份；⑥三七22份、重樓15份、獨定子11份、冰片38份和麝香0.08份。

作為進一步優選地實施方式，毛發角蛋白由毛發制備而成，毛發包括人頭發和動物毛發中的任意一種；動物毛發可為羊毛等。

作為進一步優選地實施方式，所述毛發角蛋白包括顆粒狀的毛發角蛋白或凝膠化的毛發角蛋白，優選凝膠化的毛發角蛋白。

作為進一步優選地實施方式，所述凝膠化的毛發角蛋白的濃度(質量/體積)可以為：①0.1％；②5％；③0.8％；④3％；⑤1.5％；⑥2％。

實施例2

一種根應用于創面的復合型敷料的制備方法，該方法具體方法如下：

(1)毛發角蛋白的制備：

S1：脫脂：稱取5g頭發，放在1000ml燒杯中。加入99.7％無水乙醇浸泡30分鐘，間隔5分鐘用玻璃棒攪拌一次，流水沖洗；

S2：軟化：將清洗后的頭發放置于≥10％次氯酸鈉10ml和蒸餾水90ml配置的溶液中，常溫浸泡30分鐘，間隔5分鐘用玻璃棒攪拌一次,流水沖洗；

S3：脫色：按5g頭發的重量，稱取99％焦磷酸鈉(Na₄P₂O₇)4g，99.5％過硫酸鉀(K₂S₂O₈)1.5g，30％雙氧水(H₂O₂)80ml，25％濃氨水27.5ml，蒸餾水400ml,配置成脫色溶液，將軟化的頭發置于此溶液中，放置37℃恒溫水槽中，每隔20分鐘用玻璃棒攪拌1次，觀察頭發顏色至淺黃色，這一過程用時一般2-3個小時，比傳統方法短很多；將脫色后的頭發放置在篩網上，流水沖洗，直至洗掉脫色溶液。

S4：清洗、烘干：取去離子水浸泡上述脫色后的頭發12小時以上，去除殘留試劑；去離子水沖洗，過濾后放置在鼓風干燥箱中37℃烘干過夜；

S5：研磨：將烘干后的頭發用剪刀剪碎后放在陶瓷研缽中，加入液氮冷凍研磨，至頭發成1mm長，得到頭發粗粉；

S6：球磨：稱取頭發粗粉2g，放在球磨罐中，放入瑪瑙珠，加入生理鹽水10ml,460轉/min，球磨2小時，倒置電子顯微鏡下觀察粒徑的大小，再加入生理鹽水5m繼續研磨1-2個小時，直至形成粒徑約60μm-80μm的人發角蛋白顆粒勻漿，優選70μm；上述的瑪瑙珠的數量：直徑1cm瑪瑙珠20顆，直徑60mm瑪瑙珠100顆；

S7：裝管：在上述勻漿中加入生理鹽水30ml，將球磨罐中的液體清洗轉移至50ml離心管中；

S8：離心：將離心管放在離心機的離心杯中，離心速度3000轉/min，離心20min,棄去上清液，用鑰匙去除角蛋白沉淀的表層和底層，取中段顆粒大小均勻的角蛋白移至新離心管中，加生理鹽水40ml混勻，繼續離心一次，棄去上清液，再用鑰匙去除角蛋白沉淀的表層和底層，取中段顆粒大小均勻的角蛋白移至新離心管中，再加生理鹽水40ml混勻，再次離心，棄上清液，再用鑰匙去除角蛋白沉淀的表層和底層，取中段顆粒大小均勻的角蛋白移至新離心管中，得到高純度的角蛋白泥，即顆粒狀的毛發角蛋白；暫時放置在4℃保存；

S9：滅菌：將得到的高純度的顆粒狀的毛發角蛋白裝于塑料袋中，密封好，用紙箱包裝后送到輻射中心進行Co⁶⁰照射滅菌，劑量12Kg，放置在4℃冰箱，待用；

將制備好的高純度的角蛋白泥(即顆粒狀的毛發角蛋白)在光鏡觀察(×20)下觀察，其保持了毛發原有穩定的束狀結構，如圖1所示。

圖2～5為該顆粒狀的毛發角蛋白電鏡圖，圖2為人發橫斷面SEM(1.69×10³)，圖3為人發表面SEM(1.25×10³)，圖4為人發TEM(1×10⁵)，圖5為人發皮質TEM(2×10⁵)。

由掃描電鏡(SEM)可見，經本專利方法處理的毛發材料表面比較光滑，無正常黑發的鱗片結構，呈淺凹凸斑片狀；橫斷面毛皮質仍呈無結構均質狀。由透射電鏡(TEM)可見毛發角蛋白顆粒材料中黑色素都已崩解。

(2)中藥成分的制備：

按比例稱取中藥成分中的三七、重樓、獨定子、冰片和麝香，將各種分別研磨成粉末，大小為80～200目，優選120～150目，并將各種成分的粉末混合均勻得到中藥成分。

(3)敷料的制備：

將步驟(1)中制備得到的顆粒狀的毛發角蛋白與步驟(2)中得到的中藥成分按比例混合分散均勻，得到復合輔料，如圖6所示，圖6為載有中藥成分的毛發角蛋白的掃描電鏡圖SEM(3.88×10²)。

步驟(2)和(3)中的毛發角蛋白與中藥成分的比例以及中藥成分中各種成分的量如實施例1所示，這里不再重復限定。

實施例3

本發明中的凝膠化得毛發角蛋白的制備方法可以為以下兩種方法的任意一種：

1、稱取本發明得到的(例如實施例2)高純度的顆粒狀的毛發角蛋白50mg中加入5ml的水中，充分混勻，放置于溫箱中孵育2-3小時，至呈現較為均一的顏色和性狀為止；滅菌，得到凝膠化的毛發角蛋白，其濃度為1％。

2、S1：稱取10g羊毛或人頭發，放入裝有180ml無水乙醇和20ml蒸餾水的混合溶液的三口燒瓶中，加熱15分鐘后升溫至75℃，溶液開始回流；然后，邊回流邊滴加2ml的NaOH溶液，至氧化角蛋白的pH值為7，回流與滴加同時結束，時間持續90分鐘；滴加和回流結束后，在25℃繼續攪拌5小時，使反應完全，得到成鹽毛發角蛋白。

S2：將成鹽毛發角蛋白濾出，并用洗液沖洗，該洗液為無水乙醇與等量蒸餾水混合，除去未反應的NaOH，用pH試紙檢測是否呈堿性，洗滌至不呈堿性，放入60℃鼓風干燥箱中干燥6小時，得到干燥的毛發角蛋白磺酸鹽；

S3：經過上述處理而得到的毛發角蛋白磺酸鹽呈脆性，在流星式球磨罐中粉碎得到角蛋白粉末，控制球磨條件(球料比，研磨時間，轉速等)使毛發角蛋白磺酸鹽粉末的顆粒在50μm左右，凍干；

S4：凝膠化的毛發角蛋白：在超凈臺里操作，取100mg步驟S3中得到的凍干后的毛發角蛋白磺酸鹽粉中加入5ml無菌水，先采用攪拌器手工混勻材料，再用斡旋混勻機充分混勻，放置于37℃溫箱孵育約2-3小時，則得到顏色和性狀較為均一的毛發角蛋白凝膠，然后，采用鈷60輻照法滅菌，得到凝膠化的毛發角蛋白，其濃度為2％。

圖10為濃度是4％的凝膠化的毛發角蛋白的性狀，2％的凝膠化的毛發角蛋白的性狀更稀一些。

然后該凝膠化的毛發角蛋白與本發明的細中藥成分制成本發明的復合敷料。毛發角蛋白與中藥成分的比例如實施例1所示，這里不再重復限定。

實施例4

應用于創面的復合敷料的毒性測試如下：

(1)試樣浸提液制備：載藥敷料(即含有中藥成分的毛發角蛋白)1g加入10ml生理鹽水中，經液氮冷凍固化后粉碎，取1g加入10ml生理鹽水中，振蕩混勻后在細胞培養孵箱中37℃放置7d，離心后吸出上清液，制備載藥敷料浸提液原液(初始100％濃度毛發材料100mg∶浸液1ml＝100mg/ml)，過濾除菌，備用。

(2)體外急性全身毒性試驗：對載藥敷料(即本發明所述的敷料)制備過程中可能造成的急性毒性加以初步評價。

結果顯示：按照急性毒性試驗的標準方案，對實驗小鼠進行常規灌胃，并與術后不同時間點進行觀察。結果顯示，小鼠一般情況較好，7天觀察期內無死亡，72h觀察期內各組動物未見中毒癥狀或不良反應，無死亡，體重增長正常，方差分析表明兩試驗組與生理鹽水組之間小鼠體重變化不存在明顯差異，這表明毛發角蛋白顆粒和凝膠化的毛發角蛋白兩種形式材料浸提液均無急性毒性作用。

(3)細胞毒性試驗：MTT法法測定細胞相對數和相對活力：

結果顯示：載藥敷料材料的不同濃度浸提液在三個時間點測得的細胞相對增殖率均達80％以上，細胞毒性分級為一級，具有良好的細胞相容性，無細胞毒性，說明在加工過程中并為造成毛發自身性質和相容性的改變。見表1：

表1粉體MTT結果統計分析

小鼠骨髓嗜多染紅細胞(PCE)微核試驗：評價材料可能的遺傳毒性。微核率指含有微核的嗜多染紅細胞數，以千分率(‰)表示。

結果顯示：粉體勻漿組(即本發明所述的毛發角蛋白)的微核發生率與陰性對照組無顯著差異(P>0.05)，而與陽性對照組比較差異顯著(P<0.01)，受試物小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗呈陰性，說明毛發角蛋白顆粒組無致染色體畸變毒性作用。見表2

表2骨髓嗜多染紅細胞(PCE)微核試驗結果

實施例5

動物實驗研究：

1、不同比例中藥成分人發角蛋白材料對創面愈合影響的實驗研究

創面修復實驗

取健康SD大鼠，戊巴比妥麻醉(30mg/kg)，在其背部脊柱一側旁開1cm，利刀全層切除皮膚，形成一個直徑1.8cm、面積2.54cm²的圓形全層皮膚切除創面，對側對稱部位皮膚作為正常自身對照。將制備的毛發角蛋白和成纖維細胞組織復合而成的本發明的復合型敷料均勻敷于創面，紗布覆蓋創面，打包法處理傷口，如圖7所示。

觀察：實驗組動物傷后3d天創面有所縮小，可見新生肉芽組織生成。傷后21～28d，大部分創面愈合，如圖8所示。

2、不同比例中藥成分人發角蛋白粉劑對創面愈合影響的實驗研究

HE染色組織切片觀察：測真皮層增厚，4周時平均厚度約0.58mm，可見大量的角蛋白顆粒真皮下聚集，角蛋白之間有細胞及纖維組織生長，有少量多核巨細胞，內吞噬有角蛋白顆粒。

免疫組織化學染色觀察：切片中鼠真皮成纖維細胞大量分泌Ⅰ型膠原蛋白，膠原纖維排列緊密，染色呈褐色，Ⅰ型膠原蛋白與組織細胞交錯分布；第8周后填充部位皮膚免疫組織化學染色觀察圖如圖9所示，圖9為染色顯示Ⅰ型膠原蛋白分泌情況。

3.細菌感染觀察：在受傷至痊愈后未見明顯細菌感染情況。

結論：本發明的復合敷料效果非常顯著，在沒有任何用藥的情況下，未出現明顯發炎，且傷后21－28d，絕大部分創面愈合，12周時角蛋白凝膠可基本降解。

具體地，毛發角蛋白生物材料具有利于細胞滲入、粘附和增殖的三維支架結構，在細胞粘附和增殖方面具有明顯優于其他材料的特性，同時具有神經誘導性，在止血方面也顯示出很好的效果；再配合本發明的毛發角蛋白，使其效果極其顯著。

實施例6

對于本發明應用于創面的復合敷料的臨床應用情況如下：

(1)受試者選擇：選擇成人各種創面各30例。

(2)處理方法：常規處理創面，分別采用含有本發明的中藥成分的人發角蛋白凝膠/粉劑(粉劑即本發明的顆粒)處覆蓋創面，與傳統處理方法比較。

(3)觀測指標

觀察周期：1個月；

局部大體觀察：凹陷填充部位平整度的變化，注射部位皮膚有無紅腫滲液及硬結等；

本發明的含有中藥成分和毛發角蛋白的復合敷料效果非常顯著，在志愿者在沒有任何用藥的情況下，未出現明顯發炎，且傷后21－28d，絕大部分創面恢復良好。

注：上述研究均在倫理委員會和受試者知情同意的情況下進行。

最后應說明的是：以上所述的各實施例僅用于說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或全部技術特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍。