本發明涉及生物制劑領域，具體涉及一種含有rhIL-12治療非活動性乙肝的藥物組合物。
背景技術：
：乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致，為我國常見的疾病，具有一定的傳染性，其中，乙型肝炎患者和HBV攜帶者為本病的主要傳染源。臨床表現為乏力、畏食、惡心、腹脹、肝區疼痛等癥狀，嚴重者可發展為肝硬化和肝癌，嚴重影響我國人民的健康。目前乙肝治療主要包括抗病毒、免疫調節、抗纖維化和對癥治療。多采用核苷類似物、干擾素-α(IFN-α)及長效干擾素(PEGIFN-α)等藥物進行單一或聯合用藥，這種治療方法可以明顯抑制HBV的DNA復制，并使傳染性較強的乙肝e抗原(HBeAg)在血清中逐漸陰轉。從而使受損的肝功能恢復正常。但這些療法最后都無法清除血清中的乙肝表面抗原(HBsAg)，也不能使血清中產生乙肝表面抗體(HBsAb)。其根本原因在于感染者的免疫功能受到HBsAg的抑制。在先天固有免疫功能方面，參與非特異性免疫反應的重要蛋白分子Toll樣受體(TLR3、TLR7)的功能被抑制，HBV的持續存在使先天免疫清除功能失效。而在獲得性免疫方面，由于HBV持續存在，在CD4+、CD8+T細胞出現對免疫應答具有負性調節作用的程序性死亡-1受體(PD1)以及其配體(PDL-1)高表達，導致T細胞轉變為耗竭T細胞(Tcellexhausted)即無功能T細胞，使其不能很好地清除HBV，更不能形成免疫記憶，從而不能監控HBsAg的產生，導致HBsAg的持續存在及血清中持續陽性。因此，在目前的治療方法治療下，HBsAg持續存在而不能完全清除。有鑒于此，探索和尋找一種可以激活先天固有免疫和后天獲得性免疫以徹底治愈乙型肝炎的藥物或治療方法就成為一項緊迫而又有意義的工作。中國專利申請200610123433.1公開了一種治療性乙肝疫苗組合物，該組合物每毫升含有10～20μg重組HBsAg蛋白疫苗、10～20μg重組人白介素12、9～18億綠膿桿菌菌苗制劑和余量的水溶液。該發明的組合物可以活化多個免疫靶點如NKT細胞、NK細胞、DC和T細胞(CD4+T細胞、CD8+T細胞、記憶性T細胞)，對打破HBV免疫耐受，重建細胞免疫功能，對抑制和清除HBV將產生良好效果。技術實現要素：為解決現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種含有rhIL-12治療非活動性乙肝的藥物組合物。本發明的發明人通過大量的實驗發現，重組人白介素-12(rhIL-12)與乙型肝炎疫苗(重組HBsAg蛋白疫苗)和細胞免疫佐劑(母牛分枝桿菌疫苗)聯用，可以提高宿主對HBV的特異性和非特異性免疫反應，更好地治愈HBV感染，并促使HBsAg血清陰轉，可用于治療處于免疫耐受期、免疫清除期或非活動性HBsAg攜帶期的慢性乙型肝炎。進一步地，本發明的發明人發現，每毫升治療非活動性乙肝的藥物組合物中，各組份在下述的濃度范圍內均有較好的治療效果，其中，重組人白介素-1210～20μg、重組HBsAg蛋白疫苗10～60μg和母牛分枝桿菌疫苗5～20μg。進一步地，本發明的發明人發現，當每毫升治療非活動性乙肝的藥物組合物含有重組人白介素-1210μg、重組HBsAg蛋白疫苗60μg和母牛分枝桿菌疫苗10μg時的治療效果最佳。進一步地，本發明所述的治療非活動性乙肝的藥物組合物的劑型為水針劑，所述的水針劑中用于溶解重組人白介素-12、重組HBsAg蛋白疫苗和母牛分枝桿菌疫苗所用的溶劑為注射用水或生理鹽水。進一步地，本發明所述的治療非活動性乙肝的藥物組合物的劑型為凍干粉針劑，用于溶解凍干粉針劑的溶劑為注射用水或生理鹽水。本發明所述的rhIL-12是一種既可以激活人體先天固有免疫(如TLR3、TLR7和NK細胞)，又可以恢復耗竭的T細胞功能，且可以下調PD1的細胞因子。rhIL-12能使活化的T細胞增殖并增加其細胞毒活性，誘導NK細胞和T細胞產生大量的內源性的γ-干擾素(IFN-γ)，這種內源性IFN-γ可以進入肝細胞等感染了HBV的細胞內阻止HBV的復制和再生產過程，形成細胞內非溶細胞性病毒清除模式，清除細胞內的HBV的DNA及HBsAg。rhIL-12還可通過調節輔助性T細胞(Th1/Th2細胞)發育，促使其向Th1細胞分化，啟動和調節細胞介導的免疫反應。本發明所述的重組HBsAg蛋白疫苗為酵母細胞、哺乳動物細胞或其他可用細胞表達的基因工程重組蛋白，為具有治療作用的特異性免疫調節劑。一定劑量的重組HBsAg蛋白疫苗長期反復免疫可以誘導機體免疫系統產生特異性的免疫應答(趨向Th1型)，上調非溶細胞性和溶細胞性的細胞免疫應答，并能降低HBV感染后HBV的復制和表達。本發明所述的母牛分枝桿菌疫苗為雙向免疫調節劑，具有較強的細胞免疫增強作用，能夠激發特異性的Th1免疫，并下調Th2，從而控制免疫病理反應。母牛分枝桿菌疫苗對免疫功能低下和亢進者均有調節和治療的作用，以其作為細胞免疫佐劑，結合rhIL-12和重組HBsAg蛋白疫苗對HBV感染者實施聯合免疫治療，可同時提高HBV感染者的細胞免疫和體液免疫功能，以打破免疫耐受狀態，有效清除體內的HBV，以達到徹底治愈HBV感染，并使HBsAg血清陰轉的目的。本發明通過探索rhIL-12對健康人及慢性乙型肝炎患者(包括免疫耐受期、免疫清除期、非活動性HBsAg攜帶期)的外周血單個核細胞(Peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)誘生IFN-γ(主要由Th1細胞分泌)和IL-4(主要由Th2細胞分泌)的情況，了解rhIL-12對增強慢性乙型肝炎患者Th1優勢表達，調整Th1/Th2細胞平衡的作用。結果顯示，rhIL-12呈劑量關系地促進健康人以及免疫耐受期、免疫清除期、非活動性HBsAg攜帶期患者的PBMCs誘生IFN-γ，但對PBMCs誘生IL-4無明顯影響。以上結果表明，rhIL-12可增強Th1型細胞因子的優勢表達，rhIL-12對不同臨床分期的慢性乙型肝炎患者PBMCs均具有增強細胞免疫功能的作用。進一步地，本發明分別將rhIL-12、重組HBsAg蛋白疫苗、母牛分枝桿菌疫苗單獨應用或者兩兩組合應用或者三者組合應用以評價對健康人和慢性乙型肝炎(CHB)患者的PBMCs誘生IFN-γ的影響，并以抗人CD3單抗作為陽性對照，確定rhIL-12、重組HBsAg蛋白疫苗、母牛分枝桿菌疫苗三者增強CHB患者PBMCs對HBV抗原產生特異性細胞免疫應答的影響。結果顯示，重組HBsAg蛋白疫苗、母牛分枝桿菌疫苗單獨刺激慢性乙肝患者或健康人的PBMCs時，僅有少量IFN-γ產生。單獨應用rhIL-12刺激，產生的IFN-γ與陰性對照組比較有統計學差異(P＜0.05)，但仍處于較低水平。用重組HBsAg蛋白疫苗或母牛分枝桿菌疫苗聯合rhIL-12刺激慢性乙肝患者和健康人的PBMCs，發現聯合組與單獨組比較，IFN-γ水平都有明顯上升，差異有統計學意義(P＜0.01)。用重組HBsAg蛋白疫苗和母牛分枝桿菌疫苗聯合rhIL-12刺激慢性乙肝患者和健康人的PBMCs，發現三種刺激物聯合組與重組HBsAg蛋白疫苗或母牛分枝桿菌疫苗聯合rhIL-12兩種刺激物聯合組比較，IFN-γ水平都有明顯上升，差異有統計學意義(P＜0.01)。以上結果表明，rhIL-12、重組HBsAg蛋白疫苗、母牛分枝桿菌疫苗三者聯合應用具有協同作用，可顯著增強慢性乙型肝炎患者PBMCs的細胞免疫功能。進一步地，本發明還探討了rhIL-12、重組HBsAg蛋白疫苗、母牛分枝桿菌疫苗三者聯合應用對健康志愿者PBMCs誘生IFN-γ來源的主要細胞亞群及PD-1、TLR的表達的影響。結果顯示，健康愿者PBMCs經抗原聯合rhIL-12孵育后，CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞內分泌IFN-γ的細胞百分數與陰性對照組比較有顯著差異(P＜0.05)；CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞PD-1的表達與陰性對照組比較有顯著差異(P＜0.01)；CD14+細胞TLR3、TLR7的表達與陰性對照組比較有顯著差異(P＜0.01)；CD1a+細胞TLR3、TLR7的表達與陰性對照組比較有顯著差異(P＜0.01)。以上結果表明，抗原聯合rhIL-12可活化T淋巴細胞亞群，促進CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞分泌IFN-γ，并抑制CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞表達PD-1；抗原聯合rhIL-12還可活化單核細胞和樹突狀細胞(DC細胞)，促進CD14+細胞和CD1a+細胞表達Toll樣受體，增強特異性免疫和非特異性免疫功能，打破HBV免疫耐受，重建細胞免疫功能，對抑制和清除HBV將產生良好效果。此外，小鼠動物試驗證實，單獨應用重組HBsAg蛋白疫苗或母牛分枝桿菌疫苗，小鼠血清中僅有少量IFN-γ產生。與生理鹽水組比較，單獨應用rhIL-12可顯著增加小鼠血清中IFN-γ的含量(P＜0.001)，用重組HBsAg蛋白疫苗和母牛分枝桿菌疫苗聯合rhIL-12進行應用，增加小鼠血清中IFN-γ的含量更為明顯(P＜0.001)。與現有技術相比，本發明的優勢在于：本發明所述的治療非活動性乙肝的藥物組合物可活化T淋巴細胞亞群，促進CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞產生大量的內源性IFN-γ，并可抑制CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞表達PD-1，改善獲得性免疫功能；還可活化單核細胞和樹突狀細胞(DC細胞)，促進CD14+細胞和CD1a+細胞表達Toll樣受體，改善先天免疫功能；所述的藥物組合物可打破HBV免疫耐受，重建細胞免疫功能，更好地治愈HBV感染，并促使HBsAg血清陰轉。具體實施方式以下通過具體實施方式進一步描述本發明，但本發明不僅僅限于以下實施例。實施例1rhIL-12對健康人及CHB患者PBMCs誘生IFN-γ的作用1.試驗資料：本實施例中的rhIL-12購自廣州市愷泰生物科技有限公司；人IFN-γELISA試劑盒購自BD/Pharmingen公司(BectonDickinson/PharMingenUSA)；RPMI-1640培養液、谷氨酰胺和Hanks液購自GIBCO公司(USA)；葡聚糖泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)購自上海華精生物科技公司；胎牛血清購自GIBCO。篩選健康人20例，CHB患者62例(其中免疫耐受期21例、免疫清除期22例、非活動性HBsAg攜帶期19例)。其中，健康人選擇標準：HBsAg陰性，HBsAb陽性。所有乙肝患者均不合并丙型肝炎感染，所有受試者年齡為15-55歲，性別不限。2.試驗方法：取健康人或CHB患者外周靜脈血5ml，肝素20U/ml抗凝，經RPMI-1640培養基1:1稀釋后，使用Ficoll淋巴細胞分離液按常規方法分離單個核細胞(PBMCs)，再用RPMI-1640基礎培養液洗兩次，最終用1ml含10％滅活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640懸浮細胞，計數細胞，調整細胞濃度為2×106/ml。取配置好的100μl細胞懸液加入96孔培養板，再加入100μl用RPMI-1640(10％FBS，室溫)稀釋好的不同濃度的rhIL-12，并設RPMI-1640基礎培養液空白對照孔和抗人CD3單抗(eBioscience公司)陽性對照孔，同一濃度刺激孔均設復孔，置37℃、5％CO2培養箱孵育72h后，在無菌條件下收集無細胞上清液，ELISA方法測定IFN-γ和IL-4含量，結果見下表1-4。3.數據處理：數據用表示，采用SPSS13.0統計軟件進行重復測量方差分析。滿足方差齊性條件，用ONE-WAYANOVA；不滿足參數條件，采用Kruskal-Wallis檢驗，顯著性檢驗標準為P＜0.05。4.試驗結果表1rhIL-12對健康人PBMCs誘生IFN-γ和IL-4的影響注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，***P＜0.001；與rhIL-120.01ng/m1組比較，#P＜0.05，###P＜0.001。結果顯示，rhIL-120.01ng/m1、0.1ng/m1和1.0ng/m1三個劑量與健康人PBMCs孵育72h后產生的IFN-γ水平，具有劑量依賴關系。其中，0.1ng/m1和1.0ng/m1rhIL-12組與陰性對照組相比均有顯著差異(P＜0.05，P＜0.001)，與0.01ng/m1rhIL-12組比較也具有顯著差異(P＜0.05，P＜0.001)。各rhIL-12濃度對PBMCs誘生IL-4無明顯差異。表2rhIL-12對免疫耐受期患者PBMCs誘生IFN-γ和IL-4的影響注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與rhIL-120.01ng/m1組比較，##P＜0.01。結果顯示，rhIL-120.01ng/m1、0.1ng/m1和1.0ng/m1三個劑量與免疫耐受期患者的PBMCs孵育72h后產生的IFN-γ水平呈明顯的量效關系。其中，0.01ng/m1、0.1ng/m1和1.0ng/m1rhIL-12組與陰性對照組相比均有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01)，并且1.0ng/m1rhIL-12組與0.01ng/m1rhIL-12組比較具有顯著差異(P＜0.05)。各rhIL-12濃度對PBMCs誘生IL-4無明顯差異。表3rhIL-12對免疫清除期患者PBMCs誘生IFN-γ和IL-4的影響注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，***P＜0.001；與rhIL-120.01ng/m1組比較，##P＜0.01，###P＜0.001。結果顯示，rhIL-120.01ng/m1、0.1ng/m1和1.0ng/m1三個劑量與免疫清除期患者的PBMCs孵育72h后產生的IFN-γ水平呈明顯的量效關系。其中，0.01ng/m1、0.1ng/m1和1.0ng/m1rhIL-12組與陰性對照組相比均有顯著差異(P＜0.05，P＜0.001)，并且0.1ng/m1rhIL-12組和1.0ng/m1rhIL-12組與0.01ng/m1rhIL-12組比較均具有顯著差異(P＜0.01，P＜0.001)。各rhIL-12濃度對PBMCs誘生IL-4無明顯差異。表4rhIL-12對非活動性HBsAg攜帶期患者PBMCs誘生IFN-γ和IL-4的影響注：與陰性對照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與rhIL-120.01ng/m1組比較，##P＜0.01，###P＜0.001。結果顯示，rhIL-120.01ng/m1、0.1ng/m1和1.0ng/m1三個劑量與免疫清除期患者的PBMCs孵育72h后產生的IFN-γ水平呈明顯的量效關系。其中，0.1ng/m1rhIL-12組與陰性對照組相比均有顯著差異(P＜0.01)，并與0.01ng/m1rhIL-12組比較均具有顯著差異(P＜0.001)。各rhIL-12濃度對PBMCs誘生IL-4無明顯差異。綜上所述，rhIL-12呈劑量關系地促進健康人以及免疫耐受期、免疫清除期、非活動性HBsAg攜帶期乙肝患者的PBMCs誘生IFN-γ，但對PBMCs誘生IL-4無明顯影響。rhIL-12可增強Th1型細胞因子的優勢表達，rhIL-12對不同臨床分期的慢性乙型肝炎患者PBMCs均具有增強細胞免疫功能的作用。實施例2rhIL-12與特異性抗原聯合應用對BALB/c小鼠產生IFN-γ的影響1.試驗資料：本實施例中的rhIL-12購自廣州市愷泰生物科技有限公司；RPMI1640基礎培養液、FBS購自GIBCO公司(USA)；Ficoll淋巴細胞分離液購自上海華精生物科技公司。清潔級BALB/c小鼠40只，雌雄各半，體重20g，購自南方醫科大學實驗動物中心。2.試驗方法：將40只小鼠隨機分入生理鹽水組(生理鹽水150μl/只)及rHBsAg組(10μg/只)、母牛分枝桿菌組(10μg/只)、rhIL-12組(0.3μg/只)、rHBsAg(10μg/只)+母牛分枝桿菌(10μg/只)+rhIL-12(0.3μg/只)組，共五組，每組8只，雌雄各半。給藥兩次，第一次給藥72h后再給藥一次。注射部位為小鼠頸背部皮下。分別于給藥前，第一次給藥后24、72h以及第二次給藥后24h眼眶采血，分離血清檢測IFN-γ濃度，結果見表5。3.數據處理：數據用表示，采用SPSS13.0統計軟件進行重復測量方差分析。滿足方差齊性條件，用ONE-WAYANOVA；不滿足參數條件，采用Kruskal-Wallis檢驗，顯著性檢驗標準為P＜0.05。4.試驗結果表5rmIL-12對BALB/c小鼠血清中產生IFN-γ影響注：與生理鹽水組比較，***P＜0.001；與rhIL-12組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。結果顯示，給藥后小鼠血清中IFN-γ的濃度在24h達到高峰，rmIL-12組和rHBsAg+母牛分枝桿菌+rhIL-12組與生理鹽水組比較明顯升高(P＜0.001)。至72h時血清中的IFN-γ恢復接近給藥前水平。此時再給藥一次，24h時rmIL-12組和rHBsAg+母牛分枝桿菌+rhIL-12組血清中的IFN-γ與生理鹽水組比較明顯升高(P＜0.001)。實施例3rhIL-12與特異性抗原聯合應用對健康人及CHB患者PBMCs產生IFN-γ的作用1.試驗資料：本實施例中的rhIL-12購自廣州市愷泰生物科技有限公司；rHBsAg購自深圳康泰生物科技有限公司；注射用母牛分枝桿菌購自安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司；人IFN-γELISA試劑盒均購自BD公司。篩選慢性乙肝患者15例，年齡17-49歲，平均31.17歲。所有患者排除甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)感染和其他原因(藥物、酒精、中毒)等造成的急慢性肝損害。另選取9名健康志愿者作為對照，對照組全部接種過重組HBsAg疫苗，血清中除了HBsAb陽性外，其余HBV血清學指標均為陰性。2.試驗方法：健康人及乙肝患者PBMCs的分離及培養方法同實施例1。96孔細胞培養板每孔中含細胞懸液及相應濃度刺激物各100μl，各刺激物濃度均設3個復孔，置37℃、5％CO2培養箱培養72h，ELISA測定培養上清中IFN-γ的濃度。其中，各組的給藥濃度如下：(1)陰性對照：培養液；(2)rHBsAg(0.5μg/ml)；(3)母牛分枝桿菌(0.225μg/ml)(4)rhIL-12(1ng/ml)；(5)rHBsAg(0.5μg/ml)聯合rhIL-12(1ng/ml)；(6)母牛分枝桿菌(0.225μg/ml)聯合rhIL-12(1ng/ml)；(7)rHBsAg(0.5μg/ml)、母牛分枝桿菌(0.225μg/ml)聯合rhIL-12(1ng/ml)；(8)陽性對照：0.2μg/ml抗人CD3單抗。結果見下表6。3.數據處理：數據用表示，采用SPSS13.0統計軟件進行重復測量方差分析。滿足方差齊性條件，用ONE-WAYANOVA；不滿足參數條件，采用Kruskal-Wallis檢驗，顯著性檢驗標準為P＜0.05。4.試驗結果表6rhIL-12聯合抗原治療對健康人和CHB患者PBMCs誘生IFN-γ和IL-4的影響組別健康人CHB患者陰性對照(培養液)7.94±6.19117.40±108.52rHBsAg38.83±26.88105.00±97.35母牛分枝桿菌53.64±46.82107.48±106.71rhIL-12153.92±117.84*693.35±610.48*rHBsAg+rhIL-12414.66±158.66##△△■■2382.93±1089.27##△△■■母牛分枝桿菌+rhIL-12293.66±173.10##△△■■1441.45±1034.16##△△■■rHBsAg+母牛分枝桿菌+rhIL-12761.72±546.53☆☆3934.27±2434.75☆☆抗人CD3單抗13246.45±11092.8214605.66±12465.30注：與陰性對照組比較，*P＜0.05；與rHBsAg組比較，##P＜0.01；與母牛分枝桿菌組比較，△△P＜0.01；與rhIL-12組比較，■■P＜0.01；與rHBsAg+rhIL-12組比較，P＜0.01；與母牛分枝桿菌+rhIL-12組比較，☆☆P＜0.01。結果顯示，用0.5μg/mlrHBsAg、0.225μg/ml母牛分枝桿菌單獨刺激CHB患者或健康人的PBMCs時，發現僅有少量IFN-γ產生。單獨應用rhIL-12(1ng/ml)刺激，產生的IFN-γ與陰性對照組比較有統計學差異(P＜0.05)，但IFN-γ處于較低水平。用rHBsAg(0.5μg/ml)或母牛分枝桿菌(0.225μg/ml)聯合rhIL-12(1ng/ml)刺激CHB患者和健康人PBMCs，發現聯合組與單獨組比較，IFN-γ水平都有明顯上升，差異有統計學意義(P＜0.01)。用rHBsAg(0.5μg/ml)和母牛分枝桿菌(0.225μg/ml)聯合rhIL-12(1ng/ml)刺激CHB患者和健康人PBMCs，發現三種刺激物聯合組與HBsAg(0.5μg/ml)或母牛分枝桿菌(0.225μg/ml)聯合rhIL-12(1ng/ml)兩種刺激物聯合組比較，IFN-γ水平都有明顯上升，差異有統計學意義(P＜0.01)。以上結果表明，rhIL-12、rHBsAg、母牛分枝桿菌疫苗三者聯合應用具有協同作用，可顯著增強CHB患者PBMCs的細胞免疫功能。實施例4rhIL-12與特異性抗原聯合應用對健康人誘生IFN-γ來源的主要細胞亞群及PD-1、TLR的表達研究1.試驗資料：本實施例中的rhIL-12購自廣州市愷泰生物科技有限公司；RPMI1640基礎培養液、FBS購自GIBCO公司(USA)；Ficoll淋巴細胞分離液購自上海華精生物科技公司；CD3PE、CD8FITC、CD4PreCP、CD1aPE、CD14PE、IFN-γAPC、PD-1APC、TLR3Alexaflour647、TLR7Alexaflour488均購自美國BD公司。招募健康志愿者8例，均曾接種過乙肝疫苗，HBV血清學指標如下：HBsAg(-)、抗HBs(+)、HBeAg(-)、抗Be(-)、抗HBc(-)。無菌采靜脈血10ml。2.試驗方法：(1)健康人PBMCs的分離及培養方法同實施例1。(2)將濃度為2×106/ml的細胞分別加入2管15ml細胞離心管中，每管1ml，分兩個組，其中一組加入rHBsAg(0.5μg/ml)、母牛分枝桿菌(0.225μg/ml)聯合rhIL-12(1ng/ml)，另一組做陰性對照，混勻，37℃，5％CO2溫育6h。(3)溫育至最后2h加蛋白轉運抑制劑(BFA)10μl/ml，混勻。(4)細胞用PBS洗2次(1000r/min、5min)，用紙吸干后加固定液，每管各加4％PFA(多聚甲醛)2ml，混勻，室溫8分鐘。(5)用PBS洗2次(2000r/min、10min)，用紙吸干，各加破膜劑(buffer3)400μl，4℃過夜。(6)染色：每管四個組合，每組100μl細胞。第一組加入PE標記的CD3抗體、PreCP標記的CD4抗體、FITC標記的CD8抗體、APC標記的IFN-γ抗體；第二組加入PE標記的CD3抗體、PreCP標記的CD4抗體、FITC標記的CD8抗體、APC標記的PD-1抗體；第三組加入Alexaflour488標記的TLR7抗體、PE標記的CD1a抗體、Alexaflour647標記的TLR3抗體；第四組加入Alexaflour488標記的TLR7抗體、PE標記的CD14抗體、Alexaflour647標記的TLR3抗體。每種抗體加入量均為5μl。4℃，避光30分鐘。(7)用破膜劑(buffer3)洗2次。(8)每管各加含0.1％BSA的PBS300μl，重懸細胞，上機分析。以淋巴細胞設門分析T細胞亞群IFN-γ和PD-1的表達，分別以單核細胞和樹突狀細胞(DC細胞)設門分析TLR的表達。結果見表7-8。3.數據處理：數據用表示，采用SPSS13.0統計軟件進行重復測量方差分析。滿足方差齊性條件，用ONE-WAYANOVA；不滿足參數條件，采用Kruskal-Wallis檢驗，顯著性檢驗標準為P＜0.05。4.試驗結果表7健康人PBMCs經抗原聯合rhIL-12孵育6h后T細胞亞群IFN-γ及PD-1的表達(％)注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。表8健康人PBMCs經抗原聯合rhIL-12孵育6h后單核細胞和樹突細胞TLR的表達(％)注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。結果顯示，健康志愿者PBMCs經抗原聯合rhIL-12孵育后，CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞內分泌IFN-γ的細胞百分數與陰性對照組比較有顯著差異(P＜0.05)；CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞PD-1的表達與陰性對照組比較有顯著差異(P＜0.01)；CD14+細胞TLR3、TLR7的表達與陰性對照組比較有顯著差異(P＜0.01)；CD1a+細胞TLR3、TLR7的表達與陰性對照組比較有顯著差異(P＜0.01)。以上結果表明，本發明所述的治療非活動性乙肝的藥物組合物可活化T淋巴細胞亞群，改善獲得性免疫功能；還可活化單核細胞和樹突狀細胞(DC細胞)，改善先天免疫功能；所述的藥物組合物可打破HBV免疫耐受，重建細胞免疫功能，更好地治愈HBV感染，并促使HBsAg血清陰轉。以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，上述優選實施方式不應視為對本發明的限制，本發明的保護范圍應當以權利要求所限定的范圍為準。對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明的精神和范圍內，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3