本發明屬于基因的功能與應用領域，涉及血小板-白細胞C激酶底物同源域家族A成員3(PleckstrinHomology-likeDomainFamilyAMember3，PHLDA3)在治療心肌肥厚中的應用。
背景技術：
：心肌肥厚是心肌對長期生物力學壓力或容積負荷增加的代償性反應，常見于高血壓、主動脈瓣狹窄等心血管疾病，其主要表現為心肌細胞體積增大、蛋白合成增多、細胞外基質增多等特征[1-3]。高血壓、老年退行性主動脈瓣膜疾病在我國發病率呈逐年上升趨勢。由高血壓等疾病所致的心肌肥厚、高血壓心臟發病率也隨之增加。盡管心肌肥厚可以使心肌細胞增大，心肌收縮力增強，是一種維持正常心輸出量的代償機制，但長期持續性的壓力或容積負荷過重則會引起心肌重構，同時由于心肌需氧量增大，而冠狀動脈血供相對不足，引起心肌缺血、心肌細胞凋亡，進而導致失代償，從而引起心力衰竭、惡性心律失常，甚至猝死等[4、5]。研究表明隨著心臟左室肥厚的發生與發展，心肌缺血、室性心率失常、心力衰竭、猝死等心血管事件的發生率增加6～10倍[6]。近年來，全世界眾多學者對心肌肥厚的發生發展機制開展了大量研究，發現了一些參與心肌肥厚病理生理過程的關鍵基因及重要信號傳導通路，并且對其中的可干預因素進行了深入研究[7-9]。然而，心肌肥厚的發生發展機制至今仍未完全明確，現有的研究及發現在臨床實踐中仍具有一定的局限性，尚不能形成真正有效的針對心肌肥厚的防治措施。因此，發現參與心肌肥厚的特異性分子及信號傳導通路，對進一步系統闡明心肌肥厚發生發展機制，從細胞分子水平對心肌肥厚進行調控，探索新的防治心肌肥厚的治療靶點，具有非常重要的理論和實踐意義。PHLDA3，是PH同源域家族A中三個相似的小蛋白的其中一個，三者有一個共同的PH同源結構域。PHLDA3和相關PHLDA1的表達發生在一些胎兒和成體組織中，這不同于PHLDA2在小鼠組織中更受限制的表達[10]。在一項關于腫瘤發育過程中p53和Akt蛋白的反作用的研究中，證據表明PHLDA3通過p53參與促細胞凋亡。腫瘤抑制基因p53結合PHLDA3的啟動子誘導其轉錄。誘導PHLDA3的過度表達促進細胞凋亡，而敲除PHLDA3會使Akt的活性增加，并抑制p53介導的細胞凋亡[11]。在一項關于胰腺神經內分泌腫瘤的研究中，PHLDA3的存在會與Akt競爭結合到PIP，防止Akt活化并促進Akt誘導的細胞存活信號通路[12]。然而，關于PHLDA3在心血管系統疾病中的作用仍未有報道，有待進一步研究。參考文獻：[1]LiH,HeC,FengJ,ZhangY,TangQ,BianZ,BaiX,ZhouH,JiangH,HeximerSP,QinM,HuangH,LiuPP,HuangC.RegulatorofGproteinsignaling5protectsagainstcardiachypertrophyandfibrosisduringbiomechanicalstressofpressureoverload.ProcNatlAcadSciUSA.2010；107(31):13818-23.[2]LuJ,BianZY,ZhangR,ZhangY,LiuC,YanL,ZhangSM,JiangDS,WeiX,ZhuXH,ChenM,WangAB,ChenY,YangQ,LiuPP,LiH.Interferonregulatoryfactor3isanegativeregulatorofpathologicalcardiachypertrophy.BasicResCardiol.2013；108(2):326.[3]LiH,TangQZ,LiuC,MoonM,ChenM,YanL,BianZY,ZhangY,WangAB,NghiemMP,LiuPP.CELLULARFLICE-inhibitoryproteinprotectsagainstcardiacremodelinginducedbyangiotensinIIinmice.Hypertension.2010；56(6):1109-17.[4]BuiAL,HorwichTB,FonarowGC.Epidemiologyandriskprofileofheartfailure.NatRevCardiol.2011；8(1):30-41.[5]DiwanA,DornGW2nd.Decompensationofcardiachypertrophy:cellularmechanismsandnoveltherapeutictargets.Physiology(Bethesda).2007；22:56-64.[6]ZileMR,GottdienerJS,HetzelSJ,McMurrayJJ,KomajdaM,McKelvieR,BaicuCF,MassieBM,CarsonPE.Prevalenceandsignificanceofalterationsincardiacstructureandfunctioninpatientswithheartfailureandapreservedejectionfraction.Circulation.2011；124(23):2491-501.[7]MailletM,vanBerloJH,MolkentinJD.Molecularbasisofphysiologicalheartgrowth:fundamentalconceptsandnewplayers.NatRevMolCellBiol.2013；14(1):38-48.[8]ShahAM,MannDL.Insearchofnewtherapeutictargetsandstrategiesforheartfailure:recentadvancesinbasicscience.Lancet.2011；378(9792):704-12.[9]SongK,NamYJ,LuoX,QiX,TanW,HuangGN,AcharyaA,SmithCL,TallquistMD,NeilsonEG,HillJA,Bassel-DubyR,OlsonEN.Heartrepairbyreprogrammingnon-myocyteswithcardiactranscriptionfactors.Nature.2012；485(7400):599-604.[10]FrankD,MendelsohnCL,CicconeE,SvenssonK,OhlssonR,TyckoB.Anovelpleckstrinhomology-relatedgenefamilydefinedbyIpl/Tssc3,TDAG51,andTih1:tissue-specificexpression,chromosomallocation,andparentalimprinting.MammGenome.1999；10(12):1150-9.[11]KawaseT,OhkiR,ShibataT,TsutsumiS,KamimuraN,InazawaJ,OhtaT,IchikawaH,AburataniH,TashiroF,TayaY.PHdomain-onlyproteinPHLDA3isap53-regulatedrepressorofAkt.Cell.2009；136(3):535-50.[12]OhkiR,SaitoK,ChenY,KawaseT,HiraokaN,SaigawaR,MinegishiM,AitaY,YanaiG,ShimizuH,YachidaS,SakataN,DoiR,KosugeT,ShimadaK,TyckoB,TsukadaT,KanaiY,SumiS,NamikiH,TayaY,ShibataT,NakagamaH.PHLDA3isanoveltumorsuppressorofpancreaticneuroendocrinetumors.ProcNatlAcadSciUSA.2014；111(23):E2404-13.技術實現要素：為解決臨床防治心肌肥厚疾病現有技術的缺陷和不足，本發明的目的在于確定PHLDA3基因的表達與心肌肥厚疾病之間的相互關系。提供一個用于治療心肌肥厚疾病的靶基因PHLDA3的新用途，進而把PHLDA3基因應用于心肌肥厚疾病的治療。本發明的目的通過下述技術方案實現：1、PHLDA3基因敲除顯著促進了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能本發明選用心臟特異性PHLDA3基因敲除小鼠(PHLDA3-/-)和心臟特異性Cre小鼠(α-MHC-Cre，PHLDA3+/+)進行試驗，并將每種小鼠分成假手術組和手術組，每組10只小鼠。手術組給予主動脈弓縮窄手術，假手術組不予主動脈弓縮窄，然后通過對假手術組和手術組的各組小鼠進行心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測定，研究PHLDA3基因敲除對主動脈弓縮窄誘導的心肌肥厚的影響。結果表明敲除PHLDA3基因所致的PHLDA3缺陷顯著加重心肌肥厚、纖維化及惡化心功能。2、PHLDA3基因過表達顯著抑制了心肌肥厚及其纖維化，改善心功能本發明選用心臟特異性PHLDA3轉基因小鼠和非轉基因小鼠進行試驗，并將每種小鼠分成假手術組和手術組，每組10只小鼠。手術組給予主動脈弓縮窄手術，假手術組不予主動脈弓縮窄，然后通過對假手術組和手術組的各組小鼠進行心臟心肌肥厚、纖維化及心功能的測定，研究PHLDA3基因過表達對主動脈弓縮窄誘導的心肌肥厚的影響。結果表明過表達PHLDA3基因顯著抑制心肌肥厚及纖維化，保護心功能。3、PHLDA3干擾(AdshPHLDA3)及過表達(AdPHLDA3)腺病毒對經AngII誘導的心肌細胞肥大模型的影響本發明通過構建重組腺病毒AdshPHLDA3及AdPHLDA3感染SD乳鼠原代心肌細胞，予以AngII刺激構建心肌細胞肥大模型，對照組則予以PBS，經免疫熒光監測及心肌細胞表面積統計表明，在AngII刺激下PHLDA3干擾病毒明顯促進心肌細胞肥大，心肌細胞表面積增大；PHLDA3過表達病毒顯著抑制心肌細胞肥大，心肌細胞表面積減小。由以上結果可知在發生心肌肥厚的模型中，抑制PHLDA3的表達顯著促進了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能；促進PHLDA3過度表達則顯著抑制心肌肥厚、纖維化，保護心功能；因此PHLDA3具有保護心功能和抑制心肌肥厚及纖維化的作用，特別是PHLDA3具有能夠抑制主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關疾病發生的作用。一種PHLDA3基因在心肌肥厚疾病中的功能，主要體現在PHLDA3抑制心肌肥厚及其纖維化，改善心功能。針對PHLDA3的上述功能，主要體現在PHLDA3在保護心臟、抗心肌纖維化和治療心肌肥厚中的應用，特別是PHLDA3在篩選或制備保護心臟功能、抗心肌纖維化，和/或預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物中的應用，該應用是非診斷和非治療的目的。所述的應用包括PHLDA3直接作為保護心臟功能、抗心肌纖維化，和/或預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物或藥物的有效成分；篩選包括能夠促進PHLDA3表達或增強PHLDA3作用的化學物質間接作為保護心臟功能、抗心肌纖維化，和/或預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物或藥物的有效成分。一種保護心臟功能的藥物，包括PHLDA3。一種抗心肌纖維化的藥物，包括PHLDA3。一種預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物，包含PHLDA3。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：(1)本發明發現PHLDA3基因的新功能，即PHLDA3基因具有抑制心肌肥厚及其纖維化，改善心功能的作用。(2)基于PHLDA3的作用，其可以用于篩選或制備保護心臟功能、抗心肌纖維化，和/或預防、緩解和/或治療心肌肥厚疾病的藥物，為這些疾病的治療提供了一條有效的新途徑。附圖說明圖1是心臟特異性PHLDA3基因敲除小鼠構建策略圖。圖2是心臟特異性PHLDA3轉基因小鼠構建策略圖。圖3是PHLDA3+/+和PHLDA3-/-小鼠AB術4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統計柱狀圖，結果顯示敲除PHLDA3HW/BW、LW/BW及HW/TL升高(*：p＜0.05vsPHLDA3+/+Sham組，*#：p＜0.05vsPHLDA3+/+AB組)。圖4是PHLDA3+/+和PHLDA3-/-小鼠AB術4周后心臟表型、心臟組織HE染色及心肌細胞橫截面積統計柱狀圖，結果顯示PHLDA3敲除促進心肌細胞肥大(*：p＜0.05vsPHLDA3+/+Sham組，*#：p＜0.05vsPHLDA3+/+AB組)。圖5是PHLDA3+/+和PHLDA3-/-小鼠AB術4周后心臟組織天狼星紅染色圖，結果顯示PHLDA3敲除促進心臟(心肌間質和血管周圍)的纖維化(*：p＜0.05vsPHLDA3+/+Sham組，*#：p＜0.05vsPHLDA3+/+AB組)。圖6是NTG和TG小鼠AB術4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的統計柱狀圖，結果顯示PHLDA3過表達則HW/BW、LW/BW及HW/TL降低(*：p＜0.05vsNTGSham組，*#：p＜0.05vsNTGAB組)。圖7是NTG和TG小鼠AB術4周后心臟表型、心臟組織HE染色及心肌細胞橫截面積統計柱狀圖，結果顯示PHLDA3過表達會抑制心肌細胞肥大(*：p＜0.05vsNTGSham組，*#：p＜0.05vsNTGAB組)。圖8是NTG和TG小鼠AB術4周后心臟組織天狼星紅染色圖，結果顯示PHLDA3過表達會抑制心臟(心肌間質和血管周圍)的纖維化(*：p＜0.05vsNTGSham組，*#：p＜0.05vsNTGAB組)。圖9是PHLDA3+/+和PHLDA3-/-小鼠AB術4周后超聲檢測心功能結果統計柱狀圖，結果顯示PHLDA3敲除惡化心功能；其中，LVEDD為左室舒張末期內徑、LVESD為左室收縮末期內徑、FS為短軸縮短率(*：p＜0.05vsPHLDA3+/+Sham組，*#：p＜0.05vsPHLDA3+/+AB組)。圖10是NTG和TG小鼠AB術4周后超聲檢測心功能結果統計柱狀圖，結果顯示PHLDA3過表達能保護心功能；其中，LVEDD為左室舒張末期內徑、LVESD為左室收縮末期內徑、FS為短軸縮短率(*：p＜0.05vsNTGSham組，*#：p＜0.05vsNTGAB組)。圖11是SD乳鼠原代心肌細胞用腺病毒AdGFP、AdPHLDA3感染，經AngII刺激后的免疫熒光及細胞表面積統計柱狀圖，PHLDA3的過表達病毒抑制心肌細胞肥大。(*：p＜0.05vsAdGFPPBS組，*#：p＜0.05vsAdGFPAngII組)。圖12是SD乳鼠原代心肌細胞用腺病毒AdshRNA、AdshPHLDA3感染，經AngII刺激后的免疫熒光及細胞表面積統計柱狀圖，PHLDA3的干擾病毒促進心肌細胞肥大。(*：p＜0.05vsAdshRNAPBS組，*#：p＜0.05vsAdshRNAAngII組)。具體實施方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實驗用動物及飼養實驗動物：選用8-10周齡、體重在23.5-27.5g、雄性的心臟特異性Cre小鼠(α-MHC-Cre(命名PHLDA3+/+)，背景為C57BL/6，購自JacksonLaboratory，貨號005650)、心臟特異性PHLDA3基因敲除小鼠(PHLDA3-/-)、心臟特異性PHLDA3轉基因小鼠(TG)及非轉基因小鼠(NTG，同齡同窩對照非轉基因小鼠)為實驗對象。飼養環境：所有實驗小鼠均飼養在武漢大學SPF級實驗動物中心。SRF級小鼠飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養條件：室溫在22-24℃之間，濕度在40-70％之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水攝食。實施例1心臟特異性PHLDA3基因敲除小鼠以及PHLDA3轉基因小鼠的構建1.心臟特異性PHLDA3基因敲除小鼠的構建(構建策略見圖1)利用CRISPR-Cas9技術構建心臟特異性PHLDA3基因敲除小鼠。首先，通過在線CRISPR設計工具(http://crispr.mit.edu)分別在小鼠PHLDA3基因外顯子1的非編碼區以及內含子1中各設計一個CRISPR的打靶位點，靶序列分別為：PHLDA3-sgRNA1：CTACTCTCTCGCCGCCGGCTTGG，PHLDA3-sgRNA2：TCTTCGGATCTACGCTCTGTTGG。此外還設計了一個用于同源修復的供體載體(DonorVector)，它包括兩側同源臂、中間的外顯子1以及兩個同向的loxp序列。(1)打靶載體的構建：分別將sgRNA1和sgRNA2對應的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經過限制性內切酶BsaI處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個T7啟動子，可以用于后續的體外轉錄實驗。(2)條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp的構建：分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescriptIISK(+)載體用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測序正確的載體用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L)雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescriptSK(+)-2loxp。(3)供體載體的構建：根據引物設計原則，設計如下引物(表1)用于擴增供體載體的左右同源臂(LA和RA)以及中間的外顯子部分(M)。擴增得到的產物經表1中所示限制性內切酶酶切后得到3個片段，將其分別連入條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp中，得到供體載體。表1構建供體載體所需引物序列及對應酶切位點引物名稱引物序列酶切位點PHLDA3LA-FGGGGTACCTCAATGCTCTGTGAGACAACCKpnIPHLDA3LA-RACGCGTCGACGCTTGGAACCCTGCGCGCCSalIPHLDA3M-FGGCGATATCCGGCGGCGAGAGAGTAGCATCEcoRVPHLDA3M-RCCGGAATTCTGTTGGTCCCAACAACCTTCTCEcoRIPHLDA3RA-FCGACGCGTGAGCGTAGATCCGAAGAGAATGTMluIPHLDA3RA-RATAAGAATGCGGCCGCTGGACCCATTCTTAGCCCAGNotI(4)打靶載體的轉錄：對CRIPR/Cas9系統包含的兩個部分(負責切割作用的Cas9蛋白和引導Cas9蛋白定位到靶位點的gRNA)分別進行轉錄。對于Cas9蛋白，將其表達載體pST1374-Cas9(Addgene44758)用PmeI進行酶切，以純化后回收線性化質粒為轉錄模板，用T7mMESSAGEmMACHINE試劑盒(AM1345，Ambion)進行體外轉錄，獲得加帽的mRNA產物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對上述產物加尾，獲得成熟的mRNA產物；對于sgRNA，使用MEGAshortscriptTMKit(AM1354，Ambion公司)進行體外轉錄。將轉錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit(Qiagen，217084)進行純化。(5)PHLDA3-flox條件性敲除小鼠的制作將上述成熟的mRNA產物與供體載體一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內進行培育。得到的小鼠進行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發生同源重組的小鼠中隨機挑選一只作為F0代進行后續的繁殖，最終獲得PHLDA3-flox純合小鼠。(6)心臟特異性PHLDA3基因敲除小鼠的制作將上述PHLDA3-flox小鼠與心臟特異性α-MHC-Cre(購自JacksonLaboratory，貨號005650)轉基因小鼠交配，篩選得到PHLDA3flox/flox/α-MHC-Cre小鼠，待該小鼠長至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen(他莫昔芬)，誘導Cre酶的表達，Cre酶特異性的識別兩個同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個loxp，最后得到心臟細胞特異性PHLDA3基因敲除小鼠。2.心臟特異性PHLDA3轉基因小鼠的構建(構建策略見圖2)以C57BL/6小鼠PHLDA3基因的cDNA為模板，用如下引物PCR擴增小鼠PHLDA3基因(NCBI，GeneID：27280，CCDS35722.1)：上游引物：5’-AGCTTTGTTTAAACGCCACCATGACGGCGGCGGCGACCGTGCTGAAGGAGG-3’，下游引物：5’-CTAGCTAGCTTAGGACACAAGGGTCCCAGTCC-3’。把擴增得到的產物和pCAG-CAT-LacZ載體(北京協和醫學院基礎學院楊青林老師實驗室提供，制備過程參見參考文獻：KimT,ZhelyabovskaO,LiuJ,etal.GenerationofanInducible,Cardiomyocyte-SpecificTransgenicMouseModelwithPPARb/dOverexpression[J].PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptors(PPARs),57.)用限制性內切酶PmeI(NEB，R0560L)和NheI(NEB，R0131L)酶切后連接，得到轉基因載體pCAG-CAT-PHLDA3-polyA，IRF6的表達由CAG啟動子驅動得到。將構建的pCAG-CAT-PHLDA3-polyA載體通過顯微注射構造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到PHLDA3-floxed轉基因小鼠。心臟特異性PHLDA3轉基因小鼠由PHLDA3-floxed轉基因小鼠和α-MHC-Cre(購自JacksonLaboratory，貨號005650)小鼠雜交繁殖得到，方法同上述基因敲除小鼠的構建。實施例2心肌肥厚模型的獲得1.實驗動物分組：雄性C57BL/6背景的心臟特異性Cre小鼠(α-MHC-Cre(命名PHLDA3+/+)、心臟特異性PHLDA3基因敲除小鼠(PHLDA3-/-)及心臟特異性PHLDA3轉基因小鼠(TG)和非轉基因小鼠(NTG)，通過主動脈縮窄術(AB)建立心肌肥厚模型。隨機分為8組，分組如下：C57BL/6背景心臟特異性Cre小鼠假手術組(PHLDA3+/+Sham)及AB術組(PHLDA3+/+AB)、PHLDA3基因敲除小鼠假手術組(PHLDA3-/-Sham)及AB術組(PHLDA3-/-AB)、非轉基因小鼠假手術組(NTGSham)及AB術組(NTGAB)、心臟特異性PHLDA3轉基因小鼠假手術組(TGSham)及AB術組(TGAB)。2.心肌肥厚模型采用主動脈弓縮窄手術，模型操作流程：2.1術前準備(1)麻醉：先給小鼠稱重，按照90mg/kg體重計算所需麻藥(3％戊巴比妥鈉)量，通過腹腔注射，并記錄注射時間點。夾尾、夾趾無明顯反應且小鼠狀態良好為麻醉成功標準(一般注射后約10min無明顯反應，以麻醉后約50min小鼠夾趾有反應，麻醉后30min左右為最佳手術時間)。(2)術區準備：將小鼠左胸部、左側胸部及左前肢腋下的皮膚去毛。剃毛后用濕紗布擦拭術區去除鼠毛，以不影響手術視野為宜。(3)氣管插管：用橡皮筋將小鼠上門齒固定于V形板斜面上，并迅速將氣管插管經聲門準確插入氣管內，隨后右側臥位置于加熱墊上(加熱墊需提前預熱)，然后將氣管插管與呼吸機連接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏與呼吸機頻率一致，說明氣管插管成功。2.2主動脈弓降支結扎術取右側臥位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用醫用膠帶將兩前肢固定。右胸部下方墊入棉簽，抬高胸廓，依次用碘酒及體積分數為的75％酒精對手術區域皮膚消毒。左手持眼科鑷將左胸部皮膚捏起，右手持眼科剪剪開皮膚約1cm，依次分離肌肉及軟組織，于第2-3肋水平打開胸腔，用棉簽稍撥開左肺，游離主動脈弓降支，將7-0手術縫線穿過血管，并在血管上方平行放置一段26G(25.0-27.5g小鼠)或者27G(23.5-25.0g)注射器針頭，將血管及針頭一起結扎好，再抽出針頭即可達到相應程度的血管縮窄。結扎完畢后依次縫合，關閉胸腔，用注射器從縫口處插入胸腔并抽出1cc氣體以恢復胸腔內負壓，拔出注射器后迅速縫合皮膚切口。假手術組(Sham)在游離出主動脈降支后只穿線不結扎，其余步驟同心肌肥厚模型組。2.3術后護理主動脈弓降支結扎術后，待小鼠出現自主呼吸、夾趾出現強烈反應，拔出氣管插管，并將小鼠放入裝有高壓滅菌過的墊料、飼料和飲用水的飼養籠內，于飼養室繼續飼養觀察。PHLDA3-/-小鼠及PHLDA3+/+小鼠術后4周、非轉基因小鼠及心臟特異性PHLDA3轉基因小鼠術后4周分別進行各項指標的檢測。實施例3心肌肥厚模型小鼠心肌肥厚及纖維化檢測1.取材(1)前期工作：預先準備裝有20mL的體積分數10％甲醛的尿杯，并貼好標簽(小鼠編號、組別、手術類型及取材日期)。將倒滿質量分數10％KCl溶液的培養皿置于取材處。打開分析天平，調零備用。再稱重處死小鼠。(2)取材：眼科彎鑷夾住心耳下方的血管蒂，剪下心臟，迅速置于質量分數10％KCl溶液中。待心臟停跳在舒張期后，置于滅菌紗布上，輕輕擠壓心腔內液體，蘸干表面液體后，稱重并記錄，將心臟放入相應的尿杯中，固定48h后用于病理學檢測。(3)相關測量及計算：取出小鼠肺臟，修剪后濾紙吸干，稱重并記錄。剪開小鼠后肢脛骨處皮膚，測量并記錄脛骨長度。計算心重與體重的比值(HW/BW)，肺重與體重的比值(LW/BW)以及心重與脛骨長度的比值(HW/TL)。2.病理學檢測2.1制備石蠟標本切片主要操作程序包括修剪心臟→包埋框處理→流水沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→攤片→晾干或烘烤后備用。2.2蘇木精-伊紅(HE)染色主要步驟為：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→雙蒸水1min→蘇木素溶液(珠海貝索，BA-4021)5min→水洗1min→1％鹽酸酒精(取3mL濃鹽酸與297mL70％酒精充分混合均勻)1-3s→水洗1min→Scott液(碳酸氫鈉0.35g，七水硫酸鎂2g，兩者溶于100mL蒸餾水)1min→水洗1min→伊紅溶液(珠海貝索，BA-4024)3-5min→蒸餾水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通風櫥內吹干，顯微鏡拍照。HE染色圖片統計：每張圖片選擇3個以上邊界清楚，核大致位于中央的細胞，用Image-ProPlus6.0軟件圈細胞面積。2.3天狼星紅(PSR)染色主要步驟為：55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→流水沖洗10min→雙蒸水1min→質量分數0.2％磷鉬酸2min→0.1％天狼猩紅苦味酸溶液滴于組織上，濕盒中染色90min→去除殘液→0.01N鹽酸4s→70％酒精1次→90％酒精1次→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即蓋玻片封片，顯微鏡拍照。心肌組織由心肌細胞和間質組織組成，心臟是一終末分化器官，心肌細胞失去增殖能力，各種生理或病理性刺激引起的心肌細胞反應，只能是單個細胞的體積增大而不能在數量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理過程中，主要表現為心肌細胞體積增大，肌節數量增多，細胞排列紊亂，心臟間質改變包括心肌成纖維細胞的增殖與轉化，膠原纖維密度增加，膠原分泌增加，膠原比例平衡失調等。PHLDA3+/+和PHLDA3-/-小鼠AB術后的表型結果見圖3、圖4、圖5。Sham(假手術)組中PHLDA3+/+小鼠和PHLDA3-/-小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之間的差異均無統計學意義；PHLDA3+/+小鼠AB術后4周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham組；AB術后4周，PHLDA3-/-小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均較PHLDA3+/+小鼠升高(圖3)。心臟表型，Sham組心臟無明顯差異，AB組較Sham組的心臟均增大，PHLDA3-/-小鼠的心臟明顯大于PHLDA3+/+組小鼠。HE染色切片可觀察到：Sham組心肌肌原纖維細胞排列整齊、致密，形態完整，胞核及核仁結構清晰；AB組肌絲排列紊亂、松散，心肌細胞體積明顯增大，形態不規整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，PHLDA3-/-組則比PHLDA3+/+組細胞肥大明顯，差異有統計學意義(圖4)。PSR染色后，發現AB組心室心肌間質膠原含量較Sham組增加，動脈血管周圍膠原增加更為明顯，膠原增粗，排列紊亂成網絡狀；AB術后PHLDA3-/-小鼠膠原含量及血管周圍膠原含量大于PHLDA3+/+組小鼠(圖5)。以上結果說明經AB術后，小鼠發生明顯的心肌肥厚，PHLDA3-/-小鼠的心肌肥厚及纖維化程度大于PHLDA3+/+小鼠。圖6、圖7、圖8是NTG和TG小鼠AB術后的表型結果。同樣NTG小鼠AB術后4周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham組；AB術后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明顯小于NTG小鼠(圖6)。心臟表型，AB組較Sham組的心臟均增大，且AB術后TG小鼠心臟增大的程度遠小于NTG小鼠。HE染色切片可觀察到：TG小鼠AB術后心肌細胞橫截面積大于Sham組，顯著小于NTG小鼠AB組(圖7)。PSR染色可見，TG小鼠AB術后心肌間質及血管周圍膠原含量均小于NTG小鼠AB組(圖8)。以上結果說明經AB術后，小鼠發生明顯的心肌肥厚，TG小鼠的心肌肥厚及纖維化程度小于NTG小鼠。實施例4心肌肥厚模型小鼠超聲檢測心功能1.前期準備(1)麻醉機準備：先連接氧氣瓶和麻醉機上的進氣接口，再擰開麻醉機上加藥口密封蓋，迅速加入異氟烷至安全刻度后擰緊密封蓋。擰開氧氣瓶上總閥門，調整流量控制閥的旋鈕，出氣壓力維持在0.2-0.3mPa。(2)待測小鼠準備：待檢測小鼠用異氟烷迅速麻醉后，左胸前區剃毛，將處理好的小鼠頭部伸入麻醉劑導管套頭內，以1.5-2.0％異氟烷維持小鼠穩定的麻醉狀態。2.心功能檢測小鼠取左側臥位或仰臥位，并在剃毛區均勻涂抹超聲耦合劑(天津成信公司)。采用高頻超聲診斷儀，頻率為15MHz，選取標準左心室乳頭肌短軸切面，測量左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)及短軸縮短率(FS)。本實施例運用M型超聲心動圖檢測評價心肌肥厚和心功能。圖9是PHLDA3+/+和PHLDA3-/-小鼠AB術后心功能檢測結果。與PHLDA3+/+Sham組相比，PHLDA3+/+小鼠AB術后4周表現出心功能減弱和心肌肥厚，主要表現為心肌肥厚的指標LVEDD、LVESD均不同程度的增加，而反映心功能的指標FS則下降。AB術后4周，PHLDA3-/-小鼠心肌肥厚指標增大的程度及反映心功能的指標下降的程度比PHLDA3+/+小鼠明顯。說明PHLDA3-/-小鼠的心功能更顯著惡化、心肌肥厚程度更嚴重，這些結果均與PHLDA3-/-小鼠心肌肥厚更為顯著的結果一致。圖10是NTG和TG小鼠AB術后的超聲檢測結果。與NTGSham組相比，NTG小鼠AB術后4周表現出心功能減弱和心肌肥厚。主要表現為心肌肥厚的指標LVEDD、LVESD增大，而反映心功能的指標FS則下降。AB術后4周，與NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指標增大的程度及反映心功能的指標下降的程度則小于NTG組。這些結果與TG小鼠心肌肥厚被抑制的結果一致。實施例5PHLDA3干擾(AdshPHLDA3)及過表達(AdPHLDA3)腺病毒對AngII刺激的原代心肌細胞肥大的影響1.原代新生SD大鼠心肌細胞培養(1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，頸部以下75％酒精消毒，用眼科剪和顯微鑷取下心臟，放入盛有10mLDMEM/F12培養基的玻璃平皿中。再取另一只，重復以上過程。(2)用DMEM/F12培養基清洗心臟，并將心臟剪成1-2mm3的碎片。轉入到放有轉子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。轉速為120r/min，消化15min，靜止數秒鐘，棄去上清液。(3)加入胰酶消化液，轉速為120r/min，消化15min。靜止數秒鐘，吸取上清液，用含20％小牛血清的DMEM/F12培養基終止消化，并置于4℃冰箱保存。重復該步驟，循環若干次。取上清時應盡量取盡，當組織塊變白并明顯變小時，終止消化。(4)將收集好的心肌細胞懸液以1500rpm轉速離心8min，棄去上清液。在離心管中加入適量培養基，輕柔吹打重懸細胞，集中至1個50mL離心管中，細胞懸液用細胞40μm過濾網過濾。(5)將細胞接種在100mm的培養皿中，差時貼壁90min，吸取未貼壁的細胞懸液過濾。根據細胞懸液的總量加入Brdu(終濃度0.1mM)，混勻之后，加入到用0.1％明膠包被的器皿中。(6)輕搖分散細胞，勿漩渦搖晃。37℃、5％CO2孵育48小時用PBS清洗1次，更換培養基。2.PHLDA3干擾(AdshPHLDA3)及過表達(AdPHLDA3)腺病毒對經AngII誘導的心肌細胞肥大模型的影響AdshRNA(含shRNA(沉默RNA)的腺病毒，用作對照)、AdshPHLDA3(含shRNA-PHLDA3(沉默RNA-PHLDA3融合蛋白)的腺病毒，沉默PHLDA3表達)、AdGFP(含GFP(綠色熒光蛋白)的腺病毒，用作對照)及AdPHLDA3(含GFP-PHLDA3(綠色熒光蛋白-PHLDA3融合蛋白)的腺病毒，PHLDA3過表達)。(1)重組腺病毒構建從美國InvivoGen公司購得PHLDA3的表達載體，應用腺病毒表達系統AdenoVec構建重組AdGFP、AdPHLDA3；從美國SuperArray公司購得shRNA、shPHLDA3載體，然后應用腺病毒表達系統AdenoVec構建重組AdshRNA、AdshPHLDA3。(2)重組腺病毒的鑒定取病毒粗提液加入裂解液，經混勻、離心后取上清液作為模板進行PCR擴增，產物通過凝膠電泳鑒定。(3)重組腺病毒的擴增：轉染前接種HEK293細胞，待細胞達到50-70％匯合時換液，加入含有重組腺病毒載體的新鮮培養液，培養90分鐘后再添加新鮮培養液，培養至大約有50％的細胞從培養板上脫落時，收集細胞懸液。反復凍融以制備病毒粗提液，通過CsCl密度梯度超速離心法純化病毒液。(4)重組腺病毒滴度測定：在96孔板中接種HEK293細胞，24小時后加入倍比稀釋的病毒液，1-10列加入稀釋的病毒液，每個濃度8個重復孔，11-12列加入無病毒完全培養液，培養10天后在顯微鏡下觀察細胞病變效應(CPE)，計算每個濃度的陽性率。病毒滴度采用Spearman-KarberMethod計算：滴度(pfu/mL)＝10(x+0.8)，x＝各濃度陽性率總和。前提條件：陰性對照無CPE和生長抑制現象；最小稀釋濃度組均有CPE；最大稀釋濃度組均無CPE。(5)重組腺病毒作用的鑒定：用2×108pfu/virus濃度的AdPHLDA3和AdGFP及AdshPHLDA3和AdshRNA感染6孔培養板中培養的心肌細胞(約80％匯合度)，24小時后收集細胞，加入蛋白裂解液裂解50分鐘后收集上清，取50μg樣品經10％SDS-PAGE電泳分離后，用PHLDA3特異性抗體做WesternBlot分析。根據PHLDA3蛋白的表達，確定腺病毒AdPHLDA3和AdGFP及AdshPHLDA3和AdshRNA是否能發揮預期作用。由AdGFP和AdshRNA感染的細胞PHLDA3蛋白表達含量不變。由AdshPHLDA3感染的細胞PHLDA3蛋白表達含量顯著減少；相反的，由AdPHLDA3感染的細胞PHLDA3蛋白表達含量顯著增加。腺病毒10MOIs分別感染培養3天的原代心肌細胞，12小時后用1μM血管緊張素II(AngII)(購自Sigma公司，A9525)或對照PBS刺激48小時，然后進行免疫熒光試驗。結果表明，經AdPHLDA3腺病毒感染的心肌細胞表面積相比對照組AdGFP明顯降低(圖11)，而AdshPHLDA3腺病毒感染后的心肌細胞表面積較AdshRNA對照組顯著增大(圖12)。即PHLDA3的干擾腺病毒促進心肌細胞肥大，PHLDA3的過表達腺病毒抑制心肌細胞肥大。由以上結果可知，在主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚疾病模型中，PHLDA3基因缺陷顯著促進了心肌肥厚、纖維化，惡化心功能，PHLDA3基因過表達顯著抑制了心肌肥厚、纖維化，保護心功能。因此PHLDA3基因具有保護心功能和抑制心肌肥厚及纖維化的作用，特別是PHLDA3基因能夠抑制主動脈弓縮窄引起的心肌肥厚相關疾病發生的作用。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>武漢大學<120>PH同源域家族A成員3（PHLDA3）在治療心肌肥厚中的應用<130>1<160>14<170>PatentInversion3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>Musmusculus<400>1ctactctctcgccgccggcttgg23<210>2<211>23<212>DNA<213>Musmusculus<400>2tcttcggatctacgctctgttgg23<210>3<211>54<212>DNA<213>Artificial<220><223>loxp1-F<400>3agcttgacgtcataacttcgtatagcatacattatagcaatttataccggtgat54<210>4<211>50<212>DNA<213>Artificial<220><223>loxp1-R<400>4atcaccggtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatgacgtca50<210>5<211>52<212>DNA<213>Artificial<220><223>loxp2-F<400>5gatcccttaagataacttcgtatagcatacattatagcaatttatacgcgta52<210>6<211>52<212>DNA<213>Artificial<220><223>loxp2-R<400>6ctagtacgcgtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatcttaagg52<210>7<211>29<212>DNA<213>Artificial<220><223>PHLDA3LA-F<400>7ggggtacctcaatgctctgtgagacaacc29<210>8<211>29<212>DNA<213>Artificial<220><223>PHLDA3LA-R<400>8acgcgtcgacgcttggaaccctgcgcgcc29<210>9<211>30<212>DNA<213>Artificial<220><223>PHLDA3M-F<400>9ggcgatatccggcggcgagagagtagcatc30<210>10<211>31<212>DNA<213>Artificial<220><223>PHLDA3M-R<400>10ccggaattctgttggtcccaacaaccttctc31<210>11<211>31<212>DNA<213>Artificial<220><223>PHLDA3RA-F<400>11cgacgcgtgagcgtagatccgaagagaatgt31<210>12<211>36<212>DNA<213>Artificial<220><223>PHLDA3RA-R<400>12ataagaatgcggccgctggacccattcttagcccag36<210>13<211>51<212>DNA<213>Artificial<220><223>上游引物<400>13agctttgtttaaacgccaccatgacggcggcggcgaccgtgctgaaggagg51<210>14<211>32<212>DNA<213>Artificial<220><223>下游引物<400>14ctagctagcttaggacacaagggtcccagtcc32當前第1頁1 2 3