本發明屬于生物材料合成技術領域，更具體地，涉及一種具有磁-ph值雙響應的藥物載體的制備方法。

背景技術：

在緩控釋及靶向藥物載體發展的基礎上，應答式制劑能根據人體生理、病理變化做出響應而釋放藥物，是新一代智能化藥物載體。藥物輸運體系的智能化要求載體材料具有環境敏感性，即對外部刺激（如磁場、超聲、光、熱等）或生理環境變化（如ph值、溫度、氧化還原環境等）的響應性。雙智能化因子的引入，使藥物載體能夠同時對外部刺激及生理環境做出響應，是應答式制劑開發的有效途徑之一。

磁響應材料能夠對外部磁場做出迅速響應，通過控制外部磁信號，啟動刺激-響應性控制釋放模式。fe3o4是常用磁性納米粒子之一，具有穩定、靶向性強及生物相容性好等特點，且制備方法已相當成熟，在靶向藥物載體領域具有廣泛的應用前景。

ph響應性載體是在體內偏酸或偏堿的特定情況下，載體性能發生變化，從而響應性地釋放藥物的一種給藥系統。在細菌感染導致的炎癥案例中，炎癥因子引起神經營養功能障礙以及炎癥區血液循環障礙，促使局部組織改變，ph降低，k⁺增多。由于炎癥區三大營養物質分解代謝增強，氧化不完全產物增多，ph降低，導致失償性酸中毒。隨著炎癥加劇，中心部位h⁺可增加50倍，化膿性炎癥的ph可達到6.5-5.6。另一方面，納米藥物通常通過內吞途徑進入細胞，而細胞內涵體與溶酶體的環境為酸性（約4-6.5）。使用對內涵體膜具有響應性的ph敏感高分子材料制備納米藥物制劑，可有效抑制經由內化途徑進入細胞的溶酶體轉運模式，這對提高藥物特別是易降解的生物大分子的生物利用度和抑制細胞的抗藥反應具有重要作用。β-環糊精（β-cd）是一種具有ph響應性的天然高分子：在酸性條件下（ph<5），cd錐形腔體結構被破壞；在堿性條件下（ph>8.5），cd結構往往只變得不規則。利用這一特性，可以實現在體內對某些病灶部位靶向控釋的目的。

疏水性藥物的生物利用率低，在一定程度限制了其臨床應用。β-cd能識別許多帶有疏水基團的化合物并與之形成主客體包合物，在藥物載體等領域中有著廣泛應用。尺寸合適的難溶性藥物能進入β-cd疏水空腔，與β-cd形成包合物，增加包合物的潤濕性，從而增加疏水性藥物的水溶性和生物利用度。

因此，尋求一種能將β-cd與疏水性抗菌藥物進行有效包合的藥物載體，且同時具備較高的藥物包載率和磁-ph響應性，具有極大的現實意義。

技術實現要素：

本發明的目的在于根據現有技術中的不足，提供了一種具有磁-ph值雙響應的藥物載體的制備方法。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

本發明提供了一種具有磁-ph值雙響應藥物載體的制備方法，包括如下步驟：

s1.將fe3o4納米粒子與乙醇、水混合，加入原硅酸四乙酯反應，得到fe3o4@sio2復合納米粒子；

s2.將β-cd加入硅烷偶聯劑進行改性，得到改性β-cd；

s3.將s1中fe3o4@sio2復合納米粒子與s2中改性β-cd反應，得到fe3o4@sio2/β-cd磁性復合納米材料；

s4.將s3中fe3o4@sio2/β-cd磁性復合納米材料加入到聚乙二醇溶液中反應，得到fe3o4@sio2/β-cd@peg復合材料；

s5.將β-cd和s4中fe3o4@sio2/β-cd@peg復合材料加入溶液中，超聲，于4℃條件下靜置反應12~24h，清洗，離心，收集沉淀，干燥后得到fe3o4@sio2/β-cd@peg/β-cd；

s1中，fe3o4納米粒子與原硅酸四乙酯的質量體積比為1:(5~15)；反應中fe3o4的質量濃度為0.05~0.15g/l；

s2中，β-cd與硅烷偶聯劑的質量體積比為1:(1~3)；β-cd的質量濃度為45~55g/l；

s3中，fe3o4@sio2復合納米粒子與s2中β-cd的質量比為1:(2~4)；

s5中，β-cd和fe3o4@sio2/β-cd@peg的質量比為(8~12):1。

優選地，s1中，fe3o4納米粒子與原硅酸四乙酯的質量體積比為1:10；反應中fe3o4納米粒子的質量濃度為0.1g/l。

優選地，s2中，β-cd與硅烷偶聯劑的質量體積比為2.5:4；β-cd的質量濃度為50g/l；

s3中，fe3o4@sio2復合納米粒子與s2中β-cd的質量比為1:2.5；

s5中，β-cd和fe3o4@sio2/β-cd@peg的質量比為10:1。

優選地，s1中，fe3o4納米粒子進行分散后再與原硅酸四乙酯反應，分散處理為將fe3o4納米粒子放入0.1m的鹽酸溶液中進行超聲處理，然后清洗。

優選地，s1中原硅酸四乙酯反應前，加入少量氨水。其中，乙醇和水的體積比為4:1。

優選地，s2中具體改性步驟為：將β-cd溶解于二甲基甲酰胺中，加入少量氫化鈉，室溫攪拌15min，過濾，加入硅烷偶聯劑，在90℃氮氣條件下反應4~6h。

更優選地，所述硅烷偶聯劑為kh-560。

優選地，s3中加入少量氨水反應10~15h。

優選地，s5中，將fe3o4@sio2/β-cd@peg復合材料加入到β-cd的二甲基甲酰胺飽和溶液中，室溫下超聲10min，于4℃靜置過夜，施加磁場得到反應物，用二甲基甲酰胺溶液、水、乙醇依次清洗反應物，在3200r/min離心10min，收集沉淀。

優選地，s1中采用化學共沉淀法制備fe3o4納米粒子的方法為：將二價鐵鹽和三價鐵鹽混合，加入氨水，攪拌，分離，洗滌，再加入水和聚乙二醇，超聲混勻，于80℃加熱熟化30min。

優選地，采用現有的化學共沉淀法制備fe3o4納米粒子。

本發明提供的制備方法制備得到的載體，可以與疏水類藥物按一定濃度比例混溶，得到包覆該疏水類藥物的磁導向藥物載體。

所述疏水類藥物包括但不限于紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、麥迪霉素、吉他霉素、乙酰螺旋霉素素。

與現有技術相比，本發明具有以下優點及有益效果：

本發明制備方法簡單、成本低廉，可制備得到具有磁性及ph雙響應效果的應答式載藥體系。該藥物載體可在外加磁場下，靶向定位炎癥病灶部位（弱酸性），β-cd結構破壞，藥物快速釋放；而在人體正常組織（中性ph），β-cd結構穩定，藥物釋放緩慢，實現藥物對內環境ph的響應及控制釋放。

附圖說明

圖1為實施例1~3中磁性納米材料的傅里葉紅外圖譜。

圖2為實施例3中fe3o4@sio2/β-cd@peg/β-cd載體的粒徑分布和掃描電鏡圖。

圖3為實施例1~2中fe3o4、fe3o4@sio2、fe3o4@sio2/β-cd磁性納米粒子的x射線衍射圖。

圖4為實施例1~3中磁性納米材料的磁滯曲線和磁響應效果示意圖。

圖5為實施例2~3中fe3o4@sio2/β-cd和fe3o4@sio2/β-cd@peg/β-cd載體的水溶液穩定性效果示意圖。

圖6為實施例2~3中fe3o4@sio2/β-cd和fe3o4@sio2/β-cd@peg/β-cd載體在不同ph的pbs溶液中藥物釋放曲線。

具體實施方式

以下結合具體實施例和附圖來進一步說明本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。

除非特別說明，本發明所用試劑和材料均為市購。

名稱縮寫：

fe3o4@sio2為simnp

fe3o4@sio2/β-cd為cdmnp

fe3o4@sio2/β-cd@peg/β-cd為cdmnp-peg-cd

cd為β-cd

實施例1：

采用化學共沉淀法制備fe3o4納米粒子。將fe²⁺和fe³⁺按物質的量比1:2混合，加入過量氨水，在一定溫度下（約50℃）攪拌30min，磁鐵分離沉淀，0.5%氨水洗滌，沉淀，加適量去離子水及0.5g聚乙二醇，超聲混勻，于80℃加熱熟化30min（600r/min），去離子水反復洗滌，得黑色磁流體取fe3o4納米粒子放入鹽酸溶液（0.1m），超聲分散，去離子水清洗3次。simnp復合納米粒子的制備。取0.01g潔凈的fe3o4納米粒子，置入100ml乙醇溶液（乙醇與去離子水的體積比4:1），機械攪拌，滴加1ml氨水（25%），再滴加0.1ml原硅酸四乙酯，室溫攪拌12h；施加磁場富集吸出納米粒子，去離子水和乙醇漂洗3次，于60℃真空干燥12h，得棕黑色simnp復合納米粒子。

實施例2：

cdmnp磁性復合納米材料的制備。取2.5gβ-cd溶于50ml二甲基甲酰胺，加入0.5g氫化鈉，室溫攪拌15min，過濾，得白色透明溶液，加入4mlkh-560，于90℃氮氣保護下攪拌5h，。冷卻至室溫，得改性β-cd；加入1gsimnp，滴加1.5ml氨水（25%），室溫攪拌12h，磁鐵富集吸出，依次用二甲基甲酰胺、去離子水和乙醇漂洗3次，于50℃真空干燥12h，得棕黑色cdmnp磁性復合納米材料。

實施例3：

cdmnp-peg-cd載體的制備。取適量cdmnp磁性復合納米粒子，置于20%聚乙二醇溶液，室溫機械攪拌24h；產物富集吸出，水洗，真空干燥，得cdmnp-peg復合材料。取0.05gcdmnp-peg復合材料，置于0.5gβ-cd的二甲基甲酰胺飽和溶液，室溫超聲10min，于4℃靜置過夜；磁富集吸出，用二甲基甲酰胺、蒸餾水、乙醇清洗各1次,離心10min（3200r/min），磁吸附收集沉淀；此過程重復3次，以除去殘余的β-cd和cdmnp-peg復合材料。沉淀真空干燥，封存備用。

實施例4：

針對實施例1~3制備得到的載體進行紅外檢測，結果見圖1所示。其中，a~d分別為mnp，simnp，cdmnp和cdmnp-peg-cd。對比mnp的紅外光譜（a），simnp（b）在802.6cm^-1出現si-o-si的對稱伸縮振動吸收峰，958.4cm^-1為si-o-h的特征峰，1097.3cm^-1為si-o-si反對稱伸縮振動的吸收峰。結果表明，sio2已經成功包覆fe3o4。cdmnp的紅外光譜（c）中，799.6cm^-1、958.4cm^-1及1091.6cm^-1為sio2的特征峰；3439.3cm^-1為-oh的伸縮振動吸收峰，峰強度降低；2926.4cm^-1和1086.0cm^-1分別是cd烷烴鏈中c-h和c-o的伸縮振動峰，表明β-cd已經成功接枝到simnp表面。cdmnp-peg-cd的紅外光譜（d）中，2942cm^-1是cd烷烴鏈中c-h的伸縮振動峰，2870.0cm^-1是聚乙二醇端羥基的伸縮振動峰，證實復合材料中引入了聚乙二醇。

實施例5：

采用納米激光粒度儀對實施例3制備得到的cdmnp-peg-cd載體（圖2a）的粒徑分布，粒徑約為334nm，cv為0.56%。圖2（b）為cdmnp-peg-cd載體的掃描電鏡圖，可見粒徑均勻的復合磁性納米顆粒。

實施例6：

針對實施例1~2制備得到的mnp、simnp以及cdmnp復合納米粒子進行x-射線衍射分析，如圖3所示。simnp和cdmnp仍保留mnp的特征峰，說明四氧化三鐵納米粒子的晶體結構在包埋前后沒有發生明顯改變；在2θ=27~29°處的寬峰是核殼結構中無定形sio2殼層的特征峰。選取cdmnp的最強衍射峰(311)，由scherrer公式計算出的平均粒徑為78.32nm，與粒度儀測得的粒徑數據接近。

d=0.9λ/bcosθ

式中d為粒子平均直徑/nm，0.9為scherrer常數，λ為x-射線波長0.154nm，b為衍射峰的半高寬，θ為衍射角/rad。

實施例7：

針對實施例1~3制備得到的載體進行磁性分析，結果見圖4所示。mnps、cdmnp、cdmnp-peg-cd三種磁性納米顆粒的磁滯回線（b）均是由磁化曲線和退磁曲線重合而構成的單一曲線，表明本發明后續的改性方法未對材料的磁性產生不利影響，未顯示磁滯現象，仍具有典型的超順磁行為。三者的飽和磁化強度約為46.89emu/g，磁響應性較好。磁性直觀示意圖如圖4（a）所示。分散良好的cdmnp水溶液，在玻璃瓶壁放置一磁鐵，3min內復合磁性粒子貼壁富集，水溶液變得澄清，表明良好的磁響應性。

實施例8：

針對實施例2~3制備得到的載體的水溶液穩定性進行測試，如圖5所示。分別取1gcdmnp和cdmnp-peg-cd，置于適量蒸餾水，超聲30min，靜置觀察。cdmnp-peg-cd溶液穩定，40min時依然有良好的分散性，直至3h才沉降較完全。而cdmnp在40min時顯著沉降，穩定性較差。由此可知，cdmnp-peg-cd明顯改善了水溶液的穩定性，能更好的應用于人體的體內環境。

實施例9

針對實施例2~3制備得到的cdmnp和cdmnp-peg-cd載體的載藥量進行分析。取一定量cdmnp和cdmnp-peg-cd載體，加入到1ml5mg/ml羅紅霉素（rox）的乙醇溶液，振蕩8h，磁鐵吸附材料，取上清，用光度法測濃度。結果表明，1mgcdmnp-peg-cd載體對rox的包封量為0.132mg，明顯高于cdmnp載體對rox的包封量0.072mg。

針對實施例2~3制備得到的cdmnp（圖6a）和cdmnp-peg-cd（圖6b）載體的藥物釋放進行分析，如圖6所示。取負載rox的載體，投入不同ph的pbs溶液，測定特定時間的藥物濃度，繪制藥物釋放曲線。相比cdmnp載體，cdmnp-peg-cd載體的最大藥物釋放量有所提高，且在酸性條件下，20min內載體可釋放近80%的藥物(圖6b)，而堿性條件下藥物釋放速率受到抑制。如釋藥30min時，cdmnp-peg-cd載體在ph=1時的藥物釋放量為ph=7.4時的1.6倍，為ph=8時的2.0倍；ph=4時藥物釋放量為ph=7.4的1.3倍，為ph=8時的1.6倍，表明良好的ph響應性，實現藥物對內環境ph的響應及控制釋放。