本發明涉及藥物領域，具體涉及蓽茇明寧堿在制備治療帕金森病的藥物中的應用。

背景技術：

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是臨床上最常見的神經退行性疾病之一，其主要臨床表現是靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢不穩，而造成這些癥狀的主要原因在于PD中后期累及中樞神經系統后，疾病選擇性的損害中腦黑質多巴胺能神經元，導致黑質多巴胺能神經元進行性變性缺失，從而導致一系列運動及非運動癥狀。

伴隨著全球人口老齡化，PD的人口發病率呈明顯上升趨勢。流行病學研究顯示在中國65歲以上人群帕金森病發病率已接近2％，并伴隨著高致殘率，這嚴重影響著老年人口的健康水平和生活質量。由于PD病因復雜且致病機制尚不清楚，因此其治療手段也較為有限。目前PD的手段主要有：藥物治療、手術治療、細胞移植、轉基因技術等，而詢證醫學(evidence based medicine EBM)證據表明，目前藥物治療仍是最為常用且最為有效的治療方法。EBM證據表明臨床治療PD的首選藥物仍為以左旋多巴為主要成分的美多芭，其主要機制是補充多巴胺的不足而產生治療作用，本質上仍然是一種對癥性的替代療法，但是治療本身有諸多的局限性，由于L-dopa能夠進入中樞神經系統的量不足服用劑量的1％，大量的L-dopa在外周的代謝會產生諸多的藥物副作用，并且由于該藥物只能對癥治療以改善癥狀，對于患者的預后沒有明顯改善，因此仍然是一種治標而不治本的治療手段，隨著該藥應用時間的延長和劑量的加大，其治療作用越來越小，同時毒副反應卻越來越大。因此研發一種具有更好療效且更低毒副作用的藥物是基礎和臨床中厄待解決的問題。

近年來,對傳統中醫藥開放利用日趨具有研究前景，大量研究證實了傳統中醫藥可以通過保護黑質細胞、提高神經遞質含量、抑制氧化應激反應、降低興奮性毒性等作用達到治療帕金森病的目的,并且與西藥相比，傳統中醫藥物具有較低的毒副作用。

蓽茇是一種胡椒科胡椒屬植物，其干燥近成熟的果穗是中、蒙、藏醫習慣用藥，味辛、性熱，臨床用于治療胃腹冷痛、食欲不振、消化不良、腎寒、寒瀉、嘔吐等癥狀。蓽茇中含有豐富的生物堿、酰胺類、木脂素類、萜類、甾醇類及其它類的化合物，其中生物堿和酰胺類約35種，其中蓽茇明寧堿是蓽茇中主要單體成分之一。目前文獻中還未見報道蓽茇明寧堿藥物單體在魚藤酮誘導的帕金森病模型中治療方面的相關研究。

技術實現要素：

本發明的目的是提供蓽茇明寧堿的一種藥物新用途。

本發明所提供的蓽茇明寧堿的藥物新用途是其在制備具有下述1)-4)中至少一種功能的藥物中的應用：(請核實此處表述，并確保涵蓋了所有的范圍)

1)治療中樞神經系統疾病；

2)治療魚藤酮誘導的帕金森病模型；

3)抑制細胞凋亡；

4)減輕多巴胺神經元損傷。

上述應用中，所述中樞神經系統疾病具體可為帕金森病。

本發明還提供一種包含蓽茇明寧堿的具有下述1)-4)中至少一種功能的藥物制劑：

1)治療中樞神經系統疾病；

2)治療魚藤酮誘導的帕金森病模型；

3)抑制細胞凋亡；

4)減輕多巴胺神經元損傷。

上述藥物制劑可制成各種形式的口服制劑，包括：膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、丸劑、滴丸劑、緩控釋制劑、口服液、合劑和糖漿劑。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。

本發明以魚藤酮(Rotenone)損傷模型，即100nM魚藤酮處理SK-N-SH細胞系和原代神經元形成的細胞模型為細胞模型。

實驗證明：加入Rotenone(終濃度100nM)2小時，后加入蓽茇明寧堿(終濃度100nM)與Rotenone共培養24h。通過MTT、LDH的方法檢測細胞活力，結果顯示蓽茇明寧堿能夠顯著緩解Rotenone引起的細胞活力下降；通過PI/Hochest染色的方法檢測細胞死亡率，結果顯示蓽茇明寧堿能夠顯著緩解Rotenone引起的細胞死亡率升高；對Caspase 3、Caspase 9活力進行檢測，結果顯示蓽茇明寧堿能夠顯著緩解細胞凋亡。

為了進一步確定蓽茇明寧堿通過抑制細胞凋亡從而對魚藤酮誘導的帕金森病模型起到治療作用，本發明采用魚藤酮口服給藥C57BL小鼠動物模型。

上述模型制作是通過10mg/kg魚藤酮口服6周形成的模型。蓽茇明寧堿治療組是在魚藤酮口服6周后，分別用2mg/kg和4mg/kg口服給藥4周進行治療。

實驗證明：對C57BL小鼠進行行為學檢測，結果顯示蓽茇明寧堿可以顯著緩解魚藤酮誘導的帕金森病模型小鼠運動功能障礙以及嗅覺減退、抑郁的非運動癥狀；在紋狀體和中腦，對多巴胺能神經元特異性標志物酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)進行免疫組織化學染色及蛋白免疫印跡方法檢測，結果顯示蓽茇明寧堿可以抵抗魚藤酮誘導的模型小鼠TH陽性神經元缺失以及神經末梢的減少；通過高效液相(HPLC)的方法對紋狀體多巴胺含量進行檢測，結果顯示，蓽茇明寧堿可以減緩魚藤酮誘導的模型小鼠紋狀體多巴胺含量的下降；對模型小鼠腦組織進行Caspase 3、Caspase 9活力檢測，結果顯示蓽茇明寧堿可以緩解魚藤酮誘導的細胞凋亡。

上述實驗表明，蓽茇明寧堿可以抑制細胞凋亡，保護多巴胺能神經元，從而來治療中樞神經系統疾病。

附圖說明

圖1為在SK-N-SH細胞和原代神經元上檢測蓽茇明寧堿對的細胞活力的保護作用。圖示為魚藤酮處理2h，使用100nM蓽茇明寧堿PLG進行治療，共培養24h后，通過MTT、LDH方法檢測不同藥物處理組的細胞活力和細胞毒性。

圖2為在SK-N-SH細胞和原代神經元上，檢測各組細胞死亡率。圖示為魚藤酮處理2h，使用100nM蓽茇明寧堿PLG進行治療，共培養24h后，對細胞進行PI/Hochest染色，PI染死細胞為紅色，Hochest染總細胞為藍色，統計紅色/藍色的值可以用來評估細胞死亡率。

圖3為在C57BL小鼠上，檢測小鼠運動行為以及嗅覺、抑郁等非運動行為。圖示為C57BL小鼠魚藤酮10mg/kg口服6周后，口服蓽茇明寧堿PLG進行治療4周，劑量分別為2mg/kg和4mg/kg。后對小鼠進行轉棒檢測，爬桿檢測評估小鼠的運動行為，嗅覺檢測，糖水偏好試驗檢測來評估小鼠的非運動行為。

圖4為取C57BL小鼠的紋狀體和中腦檢測TH陽性神經元及其末梢。圖示為C57BL小鼠魚藤酮10mg/kg口服6周后，口服蓽茇明寧堿PLG進行治療4周，劑量分別為2mg/kg和4mg/kg。取小鼠紋狀體和中腦，通過免疫組織化學染色的方法檢測TH陽性神經元和神經末梢含量。

圖5為取C57BL小鼠的紋狀體和中腦檢測TH蛋白含量。圖示為C57BL小鼠魚藤酮10mg/kg口服6周后，口服蓽茇明寧堿PLG進行治療4周，劑量分別為2mg/kg和4mg/kg。取小鼠紋狀體和中腦，通過western blot的方法檢測TH蛋白水平。

圖6為取C57BL小鼠紋狀體檢測多巴胺含量。圖示為C57BL小鼠魚藤酮10mg/kg口服6周后，口服蓽茇明寧堿PLG進行治療4周，劑量分別為2mg/kg和4mg/kg。取小鼠紋狀體，通過高效液相的方法檢測多巴胺含量。

圖7為在SK-N-SH細胞和原代神經元上檢測細胞凋亡水平。圖示為魚藤酮處理2h，使用100nM蓽茇明寧堿PLG進行治療，共培養24h后，收集細胞通過使用caspase-3和caspase-9活力檢測試劑盒檢測細胞caspase-3和caspase-9活力，從而評估細胞凋亡水平。

圖8為取C57BL小鼠中腦，檢測Caspase 3、Caspase 9活力。圖示為C57BL小鼠魚藤酮10mg/kg口服6周后，口服蓽茇明寧堿PLG進行治療4周，劑量分別為2mg/kg和4mg/kg。取小鼠中腦，使用caspase-3和caspase-9活力檢測試劑盒檢測細胞caspase-3和caspase-9活力，從而評估細胞凋亡水平。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明進行說明，但本發明并不局限于此。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法；下述實施例中所用的試劑、生物材料等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實施例中使用的細胞系如下：

SH-SY5Y細胞系：人多巴胺能神經母細胞瘤細胞(ATCC，本室凍存)(American Type Culture Collection)貨號CRL-2266^TM；

SPF級SD胎鼠：胎齡13.5d的SD胎鼠，購自北京維通利華實驗動物公司。

下述實施例中的試驗方法如下：

1.細胞活力的測定(MTT法)

(1)用胰蛋白酶消化細胞；

(2)用吸管充分吹打細胞，使其離壁，制備成單細胞懸液；

(3)或利用白細胞計數板對細胞進行計數；

(4)按照2-3×10⁴/孔的密度，將細胞用排槍將SK-N-SH的單細胞懸液加到96孔板中，以進行MTT實驗做準備；

(5)對個組進行相應處理后，向各孔加入MTT(5mg/ml)10μl，37℃，5％CO₂培養箱繼續培養4h；

(6)吸棄培養基，每孔加入100μl DMSO，振蕩10分鐘，使顆粒完全溶解；

(7)將孔板置于酶標儀中，讀取490nm波長處的吸光度值，統計作圖。

2.乳酸脫氫酶釋放率測定(LDH法)

(1)調整細胞濃度根據實驗設計種植于96孔板的相應孔板。1‐1.5×10⁴個細胞/孔，每孔50μl；

(2)待細胞貼壁后，用assay medium洗細胞2次后每孔加入assay medium50μl；

(3)取待測藥物原液稀釋至實驗設計的濃度，向各個實驗設計孔中加入相應濃度的藥物50μl；

(4)37℃、5％CO₂孵育12小時；

(5)加入Rotenone 100nM繼續孵育24小時；

(6)在高對照組加入lysis solution 5μl反應15min；

(7)每孔加入100μl reaction mixture(現配250μl catalyst+11.25ml dye solution)室溫反應30min，避光；

(8)每孔加入50μl stop solution終止反應；

(9)酶標儀490nm讀取吸光度值分析。

3.PI/Hochest染色

(1)細胞從培養箱內取出，在無菌超凈臺內用巴斯德管吸棄培養基；

(2)以PBS液洗滌細胞，以去除殘余培養基及血清成分，吸棄PBS液；

(3)向培養瓶中加入預熱37℃的0.5ml細胞消化液，使其充分與細胞接觸，吸棄消化液，倒置顯微鏡下觀察細胞，待細胞突起回縮，胞體開始變圓時，立即加入1ml DMEM，以終止胰酶消化作用；

(4)用吸管充分吹打細胞，使其離壁，制備成單細胞懸液；

(5)根據細胞密度，將細胞接種于96孔板，37℃孵育；

(6)至細胞密度達到70％，魚藤酮組加入100nM Rotenone每孔100μl，PLG組和CSA組在Rotenone處理后兩小時進行治療，37℃孵育24小時；

(7)吸棄培養基，用培養基稀釋PI，hochest至10μM/ml，每孔加100μl，孵育30分鐘，利用高內涵分析系統檢測。

4.免疫組化步驟：

(1)動物經灌注固定，立即取腦，先后放入含20％、30％蔗糖的4％多聚甲醛溶液內后固定4℃過夜；

(2)冰凍切片，40μm，切片放入0.01M PBST液(pH7.2-7.5)內待染；

(3)切片入0.01M PBST液中浸洗三次，5min；

(4)切片入1N鹽酸，抗原修復30min，室溫；

(5)切片入PBST浸洗三次10min；

(6)切片入3％H2O2消除內源性過氧化物酶的活性10min；

(7)切片入PBST浸洗三次，每次10min；

(8)切片入5％正常羊血清封閉1h，室溫(抑制非特異性染色)，棄血清，切片不清洗，直入適當稀釋的一抗TH(0.01M PBST稀釋)，孵育4℃過夜；

(9)切片入PBST浸洗三次，每次5min；

(10)切片入1:300生物素標記的Ⅱ抗(0.01M PBST稀釋)2-3h，室溫；

(11)切片入PBST浸洗三次，每次5min；

(12)切片入1:300辣根酶標記的鏈霉卵白素Ⅲ抗(0.01M PBST稀釋)2-3h，室溫；

(13)切片入PBST浸洗三次，每次5min；

(14)切片入DAB顯色，5-10min，室溫；

(15)切片入流水，充分浸洗；

(16)切片入0.01M PB液中裱片，自然干燥；

(17)切片上行脫水，透明，封固。

實施例1、蓽茇明寧堿PLG抑制魚藤酮誘導的細胞損傷。

1、通過MTT的方法檢測原代神經元細胞活力。

MTT法是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在540nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比，即吸光值越大，其活性越強。

2、通過LDH的方法檢測原代神經元細胞毒性。

LDH(乳酸脫氫酶)是穩定的胞漿酶，存在所有的細胞中，當胞膜損傷時快速釋放到細胞培養液中。LDH活性通過兩個酶催化反應：LDH氧化乳酸鹽生成丙酮酸鹽，然后丙酮酸鹽和四唑鹽INT反應生成甲(formazan)結晶。甲(formazan)結晶量在培養液中的增加，與裂解的細胞數增加直接相關。甲(formazan)結晶染料是水溶的，可以用分光光度計在500nm波長檢測。通過檢測細胞培養上清中LDH的活性，可判斷細胞受損的程度此分析靈敏、方便、精確，適用于許多種細胞毒性分析。

3、通過PI/Hochest染色的方法檢測原代神經元細胞死亡率。

Hochest33342是一種能與細胞DNA結合的藍色特異性染料，能穿透活細胞膜，故能標記活細胞和死細胞。而PI染料是不能進入細胞膜完整的細胞中，即活細胞對PI(碘化丙啶)染料拒染，而壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損，可被PI染料染色發出紅色熒光。根據這些特性，用PI/Hoechst雙染色經常被用于檢測細胞死亡比例。其比值越大，表明細胞死亡率越高。

4、實驗結果

用100nM魚藤酮處原代神經元2h后，用100nM蓽茇明寧堿PLG進行治療，再共同孵育24h，后進行MTT細胞活力檢測和LDH細胞毒性檢測。實驗結果顯示，魚藤酮處理后原代神經元的細胞活力均明顯降低且細胞毒性明顯增加，而PLG治療組則有明顯改善。

在原代神經元上，使用PI/Hochest雙染的方法檢測了細胞死亡率，PI可以染死細胞，呈紅色，Hochest可以染總細胞數，成藍色，計算紅色/藍色可以得到細胞死亡率。結果顯示，魚藤酮處理細胞后，細胞死亡率明顯增加，而PLG治療后均有改善。

實施例2、蓽茇明寧堿PLG緩解魚藤酮誘導的帕金森病模型小鼠的行為學障礙和多巴胺缺失

1、通過轉棒檢測、爬桿檢測、嗅覺檢測、糖水偏好檢測評估魚藤酮誘導的帕金森病模型小鼠的行為學

轉棒實驗和爬桿實驗常用于檢測小鼠運動協調能力和抗疲勞能力。轉棒儀實驗是將動物放置在粗糙滾筒上避免滑落，轉動滾筒后，如果動物滑落下來，就會停止下面對應的傳感器并自動記錄結果。爬桿實驗是將一個直徑為2.5cm的塑料球固定于一個長60cm，粗1cm的木桿頂端，木桿上纏上紗布防止打滑。將小鼠放置于木桿頂端，記錄小鼠從木桿頂端回到地面的時間。時間越短，表示小鼠運動協調能力越強。

食物埋藏實驗常用于小鼠嗅覺檢測。小鼠在進行嗅覺檢測前進食14h，檢測時，將1mm³食物埋藏于待檢測鼠籠墊料下0.5cm處，將小鼠放入待檢測鼠籠中央，記錄小鼠從放入鼠籠到找到食物的時間。尋找食物時間越短，表示小鼠嗅覺能力越好。

糖水偏好實驗常用于檢測小鼠抑郁。實驗時，將兩瓶水放入鼠籠中，一瓶為自來水，另一瓶為1％的蔗糖水，由小鼠自行飲用1h，后記錄兩瓶水分別的飲用量，計算SP值＝糖水量/(糖水量+純水量)*100％，SP值越小，表示老鼠抑郁程度增加。

2、通過高效液相的方法檢測紋狀體多巴胺水平

去小鼠斷頭后迅速取腦組織，分離紋狀體組織，用于檢測DA含量。測定時，準確稱取腦組織重量，按質量體積比1:19加入19倍樣品處理液(500ml水+14.35ml高氯酸+5.5ml 200μg/ml DHBA+90mg EDTA)，冰上勻漿制備5％的組織勻漿液，12000r/min 4℃離心20min，取上清過0.22μm濾膜用于檢測。

3、通過免疫組化的方法檢測中腦和紋狀體的TH陽性神經元和神經末梢

免疫組化，是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原，對其進行定位、定性及相對定量的研究。本實驗中，通過免疫組化對小鼠中腦和紋狀體TH染色，來評估中腦和紋狀體多巴胺能神經元和神經末梢含量。

4、實驗結果

本實驗動物為C57BL小鼠，魚藤酮口服給藥劑量為10mg/kg，給藥六周，每兩周進行一次行為學檢測。行為學結果顯示，魚藤酮處理后，老鼠體重較對照組降低，且出現運動能力下降，抑郁，嗅覺減退等癥狀。

小鼠魚藤酮口服給藥六周后，口服給蓽茇明寧堿PLG進行治療，劑量為2mg/kg,4mg/kg,給藥4周。每兩周進行一次行為學檢測。而PLG治療后，治療組老鼠較損傷組運動障礙，嗅覺減退，抑郁均有不同程度緩解。

通過高效液相的方法對老鼠紋狀體多巴胺含量進行了檢測，結果顯示損傷組老鼠DA含量較對照組明顯降低，而PLG治療組有所改善。

通過免疫組化的方法對紋狀體和中腦黑質兩個部位進行TH染色，結果顯示魚藤酮處理后，小鼠腦組織紋體和黑質部位TH水平較對照組明顯降低，而PLG治療有明顯改善。