本申請(qǐng)是2008年9月2日提交的題為“來自脂肪或胎盤組織的粘附細(xì)胞及其在治療中的用途”的中國專利申請(qǐng)200880116645.4的分案申請(qǐng)。發(fā)明領(lǐng)域和背景本發(fā)明涉及使用來自脂肪或胎盤組織的粘附細(xì)胞治療疾病的方法，更具體而言，涉及使用粘附細(xì)胞治療缺血和/或需要結(jié)締組織再生和/或修復(fù)的醫(yī)學(xué)狀況。在日益發(fā)展的醫(yī)學(xué)界，越來越需要大量的成體干細(xì)胞用于細(xì)胞移植物植入和組織工程。此外，成體干細(xì)胞療法正持續(xù)發(fā)展用以治療和治愈各種狀況，例如造血障礙、心臟病、帕金森病、阿耳茨海默病、中風(fēng)、燒傷、肌肉萎縮癥、自身免疫性病癥、糖尿病和關(guān)節(jié)炎。近些年來，大量的研究活動(dòng)集中在間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(mscs)用于包括受損器官例如大腦、心臟、骨骼和肝的組織修復(fù)以及支持骨髓移植(bmt)在內(nèi)的各種醫(yī)學(xué)應(yīng)用的治療潛能。mscs是獲自例如骨髓、脂肪組織、胎盤和血液的異源細(xì)胞群，可依靠來自各種生物活性因子的影響分化成不同類型的間充質(zhì)成熟細(xì)胞(例如，網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨前體細(xì)胞)。因此，mscs已在再生醫(yī)學(xué)中被廣泛研究作為構(gòu)造新組織例如骨、軟骨和脂肪的基礎(chǔ)用于損傷修復(fù)或病變組織的置換以及用于治療遺傳和獲得性疾病[fibbe和noort,annnyacadsci(2003)996:235-44；horwitz等,cytotherapy(2005)7(5):393-5；zimmet和hare,basicrescardiol(2005)100(6):471-81]。而且，mscs的多能性、它們的易于分離和培養(yǎng)以及它們的先體外后體內(nèi)(exvivo)高增殖潛能使它們成為有吸引力的治療工具[fibbe和noort,上文；minguell等expbiolmed(maywood)(2001)226(6):507-20]。源自胎盤的mscs顯示出許多與分離自其它組織的mscs共有的標(biāo)記，例如cd105、cd73、cd90和cd29，以及缺少造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和滋養(yǎng)層-特異細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。已在適當(dāng)條件下培養(yǎng)源自胎盤的mscs之后完成成脂性、成骨性和神經(jīng)原性分化[yen等,stemcells(2005)23(1):3-9]。而且，分離自胎盤并體外培養(yǎng)的mscs已被證明以與mscs相似的方式免疫赦免。因此，胎盤為實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供倫理上無爭(zhēng)議的并且易于獲得的mscs來源[zhang等,exphematol(2004)32(7):657-64]。本發(fā)明人之前已設(shè)計(jì)了適于源自胎盤的mscs擴(kuò)增的三維(3d)培養(yǎng)條件(pct申請(qǐng)第il2007/000380號(hào))，其完整內(nèi)容通過引用并于本文。mscs的主要臨床用途總結(jié)于下文。缺血外周動(dòng)脈病(pad)外周動(dòng)脈病(pad)為一種慢性疾病，其可進(jìn)行性限制肢體的血流從而可導(dǎo)致嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)并發(fā)癥。這一疾病通常與其他臨床狀況相關(guān)，包括高血壓、心血管病、高血脂癥、糖尿病、肥胖癥和中風(fēng)。嚴(yán)重肢體缺血(cli)用于描述患有慢性缺血誘導(dǎo)的疼痛、潰瘍、組織缺損或肢體壞疽的患者。cli代表pad患者的末期，它們需要通過血管外科或血管專家的綜合治療。與冠狀動(dòng)脈和大腦動(dòng)脈病相反，外周動(dòng)脈病(pad)仍然是未被完全了解的狀況，盡管病情嚴(yán)重且非常流行但很少被診斷出并且甚至更少被治療。結(jié)果，cli經(jīng)常導(dǎo)致截肢或死亡且pad患者的死亡率超過心肌梗塞和中風(fēng)患者的死亡率。為了治療缺血狀況已使用了多種成體干細(xì)胞。因此，源自脂肪組織的基質(zhì)細(xì)胞(adsc)和內(nèi)皮細(xì)胞(ec)的共培養(yǎng)主要通過vege和hgf的分泌引起ec存活率、遷移和管腔形成的顯著增加。將基質(zhì)細(xì)胞移植到缺血小鼠后肢四周后血管生成評(píng)分得到改善[nakagami等,jatherosclerthromb(2006)13(2):77-81]。moon等[cellphysiolbiochem.(2006)17:279-90]已檢測(cè)源自脂肪組織的祖細(xì)胞(adsc)治療免疫缺陷小鼠肢體缺血的能力并證明了adsc-移植組中激光多普勒灌注指數(shù)的顯著增加。此外，當(dāng)源自臍帶血(ucb)的間充質(zhì)干細(xì)胞被移植到四名已接受藥物治療和手術(shù)療法的伯格氏病患者中時(shí)，他們患肢的缺血性靜息痛突然消失[kim等,stemcells(2006)24(6):1620-6]。而且，將分離自足月胎盤胎膜的人間充質(zhì)干細(xì)胞(fmhmsc)移植入梗塞的大鼠心臟與毛細(xì)血管密度增加、左心室功能正常化以及瘢痕組織的顯著減少相關(guān)，這些情況在將干細(xì)胞與透明質(zhì)烷與丁酸和視黃酸形成的混合酯預(yù)處理時(shí)被增強(qiáng)[ventura等,(2007)j.biol.chem.,282:14243-52]。中風(fēng)中風(fēng)是全世界死亡的主要誘因之一，引起約9％的所有死亡并消耗約2-4％的總醫(yī)療費(fèi)用。盡管很可能因?yàn)樘岣吡藢?duì)中風(fēng)危險(xiǎn)因素(尤其是高血壓、糖尿病和吸煙)的控制，發(fā)達(dá)國家的中風(fēng)死亡率已持續(xù)降低，但是中風(fēng)仍然可導(dǎo)致永久性損傷(例如，組織損傷、神經(jīng)損傷)。新的中風(fēng)治療方案包括干細(xì)胞療法。已設(shè)想將干細(xì)胞或祖細(xì)胞局部或通過靜脈內(nèi)途徑移植入受損位點(diǎn)以替代無功能細(xì)胞、增強(qiáng)內(nèi)源干細(xì)胞或祖細(xì)胞的增殖和/或分化且提供必要的免疫調(diào)節(jié)子，并作為主要的以細(xì)胞為基礎(chǔ)的策略。干細(xì)胞/祖細(xì)胞的潛在來源包括胎兒神經(jīng)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)畸胎癌細(xì)胞、源自臍帶血的非造血干細(xì)胞、源自骨髓的干細(xì)胞以及源自胎盤的間充質(zhì)干細(xì)胞[andres等,neurosurgfocus(2008)24(3-4):e16]。在一項(xiàng)最近的研究中，koh等[koh等,brainres.(2008)]檢測(cè)了移植的源自人臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞(huc-mscs)在缺血中風(fēng)大鼠模型中的神經(jīng)保護(hù)作用和機(jī)制。體外誘導(dǎo)神經(jīng)元分化二十天后，huc-mscs顯示出神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特征并表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記和神經(jīng)元因子(例如，源自神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、源自腦的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)。而且，將huc-mscs體內(nèi)移植到免疫抑制的缺血中風(fēng)大鼠的受損腦半球可相對(duì)于對(duì)照大鼠改善神經(jīng)行為功能且減少梗塞體積。移植后三周，huc-mscs出現(xiàn)在受損半球中并表達(dá)神經(jīng)元-特異標(biāo)記，但這些細(xì)胞沒有成為功能活性神經(jīng)元細(xì)胞。矯形外科應(yīng)用多種狀況和病理需要結(jié)締組織(例如，骨、腱和韌帶)的再生和/或修復(fù)。這些包括，例如，骨折、燒傷、燒傷創(chuàng)面、深度創(chuàng)傷、退化骨、各種癌癥相關(guān)的結(jié)締組織損失(例如，骨癌、骨肉瘤、骨轉(zhuǎn)移)以及關(guān)節(jié)軟骨缺損。使用自體bm-mscs增強(qiáng)骨愈合已被描述用于獸醫(yī)和人的矯形外科應(yīng)用且包括經(jīng)皮注射骨髓用于韌帶愈合(carstanjen等,2006)、矯形臨床中通過骨髓的自體移植物或同種異體移植物治療骨缺損(horwitz等,1999,horwitz等,2002)、使用負(fù)載于由羥基磷灰石-磷酸三鈣組成的陶瓷圓柱體上的同種異體的[arinzehtl,等,jbonejointsurgam.2003,85-a(10):1927-35]或自體的[brudersp等,jbonejointsurgam.1998jul；80(7):985-96]骨髓-mscs在狗中，或使用同種異體的源自外周血的mscs(chao等,2006.)在兔子中進(jìn)行臨界大小骨缺損的再生，以及使用mscs移植在狒狒中進(jìn)行大量的骨形成(livingston等,2003)。在馬矯形外科領(lǐng)域中，bm和脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞已實(shí)驗(yàn)性用于手術(shù)治療軟骨下骨囊腫、骨折修復(fù)[kraus和kirker-head,vetsurg(2006)35(3):232-42]和軟骨修復(fù)[brehm等,osteoarthritiscartilage(2006)14(12):1214-26；wilke等,jorthopres(2007)25(7):913-25]以及臨床用于治療馬過度勞累引起的腱損傷。而且，已使用不同的治療方法促進(jìn)馬的懸韌帶愈合(herthel,2001)。herthel(2001)已證明了一種輔助懸韌帶愈合的新生物學(xué)方法，其涉及損傷內(nèi)注射自體干細(xì)胞和相關(guān)的骨髓組分以刺激天然韌帶再生。腱受損的兔子模型顯示經(jīng)msc-處理的組織比天然修復(fù)的組織更強(qiáng)狀和堅(jiān)硬(gordon等,2005)。此外，將培養(yǎng)的mscs接種到腱裂隙處引起顯著改善的修復(fù)生物力學(xué)(young等,1998,osiristherapeutics,www.osiris.com)。現(xiàn)正在患者體內(nèi)檢測(cè)osiris軟骨素原(成體間充質(zhì)干細(xì)胞)以評(píng)價(jià)其安全性和有效性。在經(jīng)msc處理的動(dòng)物中，手術(shù)移除的半月板組織再生，軟骨表面得到保護(hù)且與對(duì)照動(dòng)物相比觀察到關(guān)節(jié)損傷減少。這些益處在動(dòng)物模型中持續(xù)至少一年(osiristherapeutics,www.osiris.com)。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了治療需要其的受試者中缺血的方法，該方法包括給予受試者治療有效量的選自胎盤和脂肪組織的組織的粘附細(xì)胞，藉此治療受試者的缺血。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了治療需要其的受試者中的需要結(jié)締組織再生和/或修復(fù)的醫(yī)學(xué)狀況的方法，該方法包括給予受試者治療有效量的選自胎盤和脂肪組織的組織的粘附細(xì)胞，藉此治療受試者中需要結(jié)締組織再生和/或修復(fù)的醫(yī)學(xué)狀況。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了選自胎盤和脂肪組織的組織的粘附細(xì)胞在制備經(jīng)鑒定用于治療缺血的藥劑中的用途。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了選自胎盤和脂肪組織的組織的粘附細(xì)胞在制備經(jīng)鑒定用于治療需要結(jié)締組織再生和/或修復(fù)的醫(yī)學(xué)狀況的藥劑中的用途。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了一種制備物品，其包括包含用于治療缺血的標(biāo)簽的包裝材料，該包裝材料包裝藥用有效量的選自胎盤和脂肪組織的組織的粘附細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的一方面，提供了一種制備物品，其包括包含用于治療需要結(jié)締組織再生和/或修復(fù)的醫(yī)學(xué)狀況的標(biāo)簽的包裝材料，該包裝材料包裝藥用有效量的選自胎盤和脂肪組織的組織的粘附細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該粘附細(xì)胞可抑制受試者中的免疫反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，至少10％的粘附細(xì)胞處于增殖期。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該缺血為外周動(dòng)脈病(pad)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該外周動(dòng)脈病(pad)為嚴(yán)重肢體缺血(cli)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該缺血包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的缺血。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該缺血選自外周動(dòng)脈病、缺血性血管病、缺血性心臟病、缺血性腦病、缺血性腎病以及缺血胎盤。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該粘附細(xì)胞獲自三維(3d)培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該三維(3d)培養(yǎng)包括3d生物反應(yīng)器。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，在3d培養(yǎng)中的細(xì)胞培養(yǎng)在灌注下實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，三維培養(yǎng)的培養(yǎng)條件包括選自聚酯和聚丙烯的粘附材料。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，細(xì)胞培養(yǎng)至少進(jìn)行3天。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行至至少10％的細(xì)胞正在增殖。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該粘附細(xì)胞包含選自cd73、cd90、cd29和cd105的陽性標(biāo)記表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該粘附細(xì)胞包含選自cd3、cd4、cd45、cd80、hla-dr、cd11b、cd14、cd19、cd34和cd79的陰性標(biāo)記表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該粘附細(xì)胞包含基本上如本文所述的表達(dá)概況。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該粘附細(xì)胞包括包含基質(zhì)干細(xì)胞表型的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該基質(zhì)干細(xì)胞表型包括t細(xì)胞抑制活性。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該結(jié)締組織包括腱、骨和/或韌帶。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，需要結(jié)締組織再生和/或修復(fù)的醫(yī)學(xué)狀況選自骨折、骨癌、燒傷創(chuàng)面、關(guān)節(jié)軟骨缺損和深層創(chuàng)傷。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該醫(yī)學(xué)狀況選自軟骨下骨囊腫、骨折、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、退化骨、骨癌、軟骨損傷、關(guān)節(jié)軟骨缺損、視乳頭變性疾病、成骨不全(oi)、燒傷、燒傷創(chuàng)面、深層創(chuàng)傷、創(chuàng)傷愈合延遲、腱受損以及韌帶受損。除非另外指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管與本文所述那些相似或等同的方法和材料可用于實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明，但是下文仍描述了合適的方法和材料。如有矛盾之處，以專利說明書包括定義為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅用于說明且不具有限制性。附圖簡(jiǎn)述參考附圖僅以舉例方式在本文中描述本發(fā)明。現(xiàn)具體參考附圖的詳細(xì)內(nèi)容，強(qiáng)調(diào)的是，通過舉例方式顯示具體內(nèi)容且僅用于說明性討論本發(fā)明的實(shí)施方案，并且是為了提供什么被認(rèn)為是本發(fā)明原理和構(gòu)思方面的最有用和最易理解的說明而提出。在這一點(diǎn)上，不試圖顯示比基本理解本發(fā)明所需的更詳細(xì)的本發(fā)明結(jié)構(gòu)性細(xì)節(jié)，對(duì)附圖所作的說明使得本領(lǐng)域技術(shù)人員明白本發(fā)明的數(shù)種形式如何在實(shí)踐中具體化。附圖中：圖1a-g描述在包含3d載體的生物反應(yīng)器系統(tǒng)中產(chǎn)生的類骨微環(huán)境。圖1a-b為描述天然骨(圖1a)和接種粘附細(xì)胞，模擬骨微環(huán)境后7天plurixtm3d載體結(jié)構(gòu)(圖1b)的比較的電子顯微照片。圖1c-f為描述用骨髓產(chǎn)生的粘附細(xì)胞接種的plurixtm3d基質(zhì)在接種后20天(圖1c-d，分別放大x150和250)和40天(圖1e-f，分別放大x350和500)的電子顯微照片。圖1g為具有由編號(hào)定義的單獨(dú)部件的plurix3d活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器的圖：培養(yǎng)基庫(1)、混合氣體供給(2)、過濾器(3)、注射點(diǎn)(4)、在其中放置3d載體的柱(5)、流量監(jiān)控器(6)、流量閥(6a)、分離容器(7)、細(xì)胞生長(zhǎng)分析儀(8)、蠕動(dòng)泵(9)、取樣點(diǎn)(10)、溶o2測(cè)量電極(11)、ph測(cè)量電極(12)、控制系統(tǒng)(13)、新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基(14)、用過的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(15)。圖2是描述在生物反應(yīng)器系統(tǒng)內(nèi)3d生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的來源于胎盤的粘附細(xì)胞不同生產(chǎn)批次的圖(批次5-8)。將粘附細(xì)胞(2x106)以10000-15000個(gè)細(xì)胞/載體的密度接種到生物反應(yīng)器。培養(yǎng)12天后，3d-粘附細(xì)胞的密度達(dá)到150,000-250,000個(gè)細(xì)胞/載體或含有150個(gè)載體的生物反應(yīng)器中22.5-37.5x106。圖3a-b為描述比較在源自胎盤的3d-粘附細(xì)胞中表達(dá)的膜標(biāo)記(暗紫色)與在常規(guī)2d培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的胎盤細(xì)胞中的膜標(biāo)記(淡紫色)的表達(dá)水平差異的條形圖。粘附細(xì)胞在培養(yǎng)瓶(2d)中生長(zhǎng)4-6周，或在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中于聚苯乙烯載體(3d)上生長(zhǎng)2-3周。從培養(yǎng)瓶或載體收獲細(xì)胞后，孵育細(xì)胞并與識(shí)別粘附細(xì)胞(圖3a)或造血細(xì)胞(圖3b)特有的膜標(biāo)記的一組單克隆抗體(mab)結(jié)合。注意到與在3d培養(yǎng)的粘附細(xì)胞中表達(dá)的msc膜標(biāo)記相比在2d培養(yǎng)細(xì)胞中的msc膜標(biāo)記表達(dá)(如對(duì)于cd90、cd105、cd73和cd29膜標(biāo)記所示)明顯更高，尤其是cd105，其在3d培養(yǎng)細(xì)胞中顯示56％表達(dá)，相比較在2d培養(yǎng)細(xì)胞中為87％(圖3a)。2d和3d二者培養(yǎng)物中的粘附細(xì)胞都不表達(dá)任何造血膜標(biāo)記(圖3b)。圖4a-d為描述比較在2d和3d條件或在2d和3d條件培養(yǎng)基下培養(yǎng)的從胎盤產(chǎn)生的粘附細(xì)胞的蛋白質(zhì)水平的條形圖。圖4a-c描述由elisa分析以pg/ml(標(biāo)準(zhǔn)化為1x106個(gè)細(xì)胞/ml)為單位的2d和3d培養(yǎng)的粘附細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的flt-3配體(圖4a)、il-6(圖4b)和scf(圖4c)的水平。結(jié)果代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一。圖4d顯示不同細(xì)胞蛋白的表達(dá)水平，如用itraq試劑標(biāo)記其間比較的蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)譜法分析。蛋白樣品采自在2d(白條)和3d(灰條)條件下生長(zhǎng)的粘附細(xì)胞。該圖代表兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)之一。注意到細(xì)胞及2d和3d培養(yǎng)條件的條件培養(yǎng)基中某些蛋白的表達(dá)水平的差異。圖5a-d為描述源自胎盤的3d-粘附細(xì)胞在體外分化為成骨細(xì)胞的能力的顯微照片。將源自人胎盤的粘附細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含有10％fcs、100nm地塞米松、0.05mm抗壞血酸2-磷酸鹽、10mmb-甘油磷酸鹽的dmem)中培養(yǎng)3周時(shí)間。圖5a-b顯示表達(dá)鈣化基質(zhì)的細(xì)胞，如alizzarinreds染色所示。圖5c-d顯示不用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的對(duì)照細(xì)胞，其保持成纖維細(xì)胞樣表型并證明沒有礦化。圖6為描述在移植后3.5周用化學(xué)療法(連續(xù)2周腹膜內(nèi)注射25mg/kg白消安(busulfan))治療的nod-scid小鼠骨髓(bm)中檢測(cè)的人cd45+細(xì)胞百分比的圖表。將從源自臍帶血的單核細(xì)胞純化的cd34+細(xì)胞(100，000)單獨(dú)移植(5只小鼠，a)，或與在2d條件下培養(yǎng)的0.5x106個(gè)源自胎盤的粘附細(xì)胞共同移植(2d-粘附細(xì)胞；2只小鼠，b)，或與在plurixtm生物反應(yīng)器中3d條件下培養(yǎng)的源自胎盤的粘附細(xì)胞(3d-粘附細(xì)胞)共同移植(5只小鼠，c)。然后從小鼠大腿骨和脛骨收集bm。通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)bm中的人細(xì)胞。通過將細(xì)胞與抗人cd45-fitc孵育來測(cè)定表達(dá)cd45的人細(xì)胞的百分比。注意到與單用hsc處理小鼠中的人類細(xì)胞的百分比(a)相比，與2d-粘附細(xì)胞(b)以及與3d-粘附細(xì)胞(c)共同移植的小鼠骨髓中的人細(xì)胞(hcd45+)的百分比更高。在經(jīng)3d-粘附細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞處理的小鼠中觀察到比經(jīng)2d-粘附細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞處理的小鼠更高的移入，表明了經(jīng)3d培養(yǎng)的粘附細(xì)胞所特有的更高治療優(yōu)勢(shì)。圖7a-b是僅用cd34+細(xì)胞移植的小鼠中的人移植物cd45+細(xì)胞(圖7a)與cd34+細(xì)胞加源自脂肪組織的粘附細(xì)胞(圖7b)比較的facs分析。注意到與單用人cd34+處理的小鼠(7b-12％)相比，用源自脂肪組織的粘附細(xì)胞共同移植的小鼠中的人造血細(xì)胞群(hcd45+)百分比(7a-29％)顯著更高。圖8a為描述在人臍帶血單核細(xì)胞(cb)與等量經(jīng)輻射(3000rad)臍帶血細(xì)胞(icb)、源自人外周血的單核細(xì)胞(pbmc)、2d培養(yǎng)的(2d)或3d培養(yǎng)的(3d)源自胎盤粘附細(xì)胞、或pbmc和2d及3d培養(yǎng)的源自胎盤粘附細(xì)胞的組合(pbmc+2d和pbmc+3d)之間進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的條形圖。cb細(xì)胞群的大小由3h-胸苷吸收(以cpm測(cè)量)來表示，在培養(yǎng)的最后18小時(shí)內(nèi)測(cè)量。受刺激的cb細(xì)胞增殖升高表明較高的免疫應(yīng)答水平。注意到與粘附細(xì)胞孵育的細(xì)胞顯示出較低的免疫應(yīng)答水平，特別是在與粘附細(xì)胞共同孵育時(shí)，對(duì)pbmc的cb免疫應(yīng)答減少。每一反應(yīng)作三個(gè)重復(fù)。圖8b為描述通過celligentm從胎盤產(chǎn)生3d粘附細(xì)胞(命名為plx-c細(xì)胞)的流程圖。圖8c為從newbrunswickscientific網(wǎng)站調(diào)試的celligentm生物反應(yīng)器導(dǎo)管和端口的圖解。圖9a-b描述通過plurix(命名為plx,圖9b)和celligen(命名為plx-c,圖9a)進(jìn)行3d粘附細(xì)胞生產(chǎn)的細(xì)胞循環(huán)分析。將細(xì)胞固定于70％etoho.n，離心并重懸于碘化丙啶(pi)溶液，然后通過facs分析。圖10a-c描述了plx-c上的成纖維細(xì)胞-典型標(biāo)記的表達(dá)而不是內(nèi)皮典型標(biāo)記的表達(dá)。圖10a描述了內(nèi)皮標(biāo)記cd31的陰性表達(dá)；圖10b描述了內(nèi)皮標(biāo)記kdr的陰性表達(dá)；及圖10c描述了人成纖維細(xì)胞標(biāo)記(d7-fib)的陽性表達(dá)。注意到同種型igg1(fitc)的紅色直方圖表示陰性對(duì)照而藍(lán)色直方圖表示陽性染色細(xì)胞。圖11a-d描述了plx-c細(xì)胞上刺激分子和共刺激分子的表達(dá)。圖11a描述了cd80的plx-c表達(dá)；圖11b描述了cd86的plx-c表達(dá)；圖11c描述了cd40的plx-c表達(dá)，及圖11d描述了hla-a/b/c的plx-c表達(dá)。用相關(guān)同種型熒光分子制備陰性對(duì)照。注意到紅色直方圖表示表達(dá)plx-c標(biāo)記的細(xì)胞群，藍(lán)色直方圖表示表達(dá)骨髓(bm)標(biāo)記的細(xì)胞群，且綠色直方圖表示表達(dá)單核細(xì)胞(mnc)標(biāo)記的細(xì)胞群。圖12a-b描述了plx-c對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制。圖12a描述了利用用等量的經(jīng)輻射的(3000rad)源自pb的mnc(供體b)刺激2x105個(gè)源自外周血(pb)的mnc(供體a)然后向培養(yǎng)物中加入漸增量的plx-c細(xì)胞進(jìn)行的mlr檢測(cè)。將各組的三個(gè)重復(fù)接種于96孔板中。通過[3h]胸苷摻入測(cè)量增殖速率；圖12b描述用cona(1.5mg/ml)刺激的源自外周血(pb)的mnc。向培養(yǎng)物中加入漸增量的plx-c細(xì)胞。將各組的三個(gè)重復(fù)接種于96孔板中。通過[3h]胸苷摻入測(cè)量增殖速率。圖13a-c描述了與外周血細(xì)胞共培養(yǎng)后促炎癥反應(yīng)和抗炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子分泌的plx-c調(diào)節(jié)。圖13a-b描述了用cona刺激的源自人的mnc(分離自外周血)與plx-c共培養(yǎng)后ifnγ(圖13a)和tnfα(圖13b)的分泌；圖13c描述了用lps刺激的源自人的mnc(分離自外周血)與plx-c共培養(yǎng)后ifnγ、tnfα和il-10的分泌。收集上清并采用elisa進(jìn)行細(xì)胞因子分析。圖14描述了用于感染plx-c細(xì)胞的螢光素酶表達(dá)載體。來自omicslink的表達(dá)載體lv33用于本文。將該螢光素基因克隆至orf。圖15描述了感染的plx-c細(xì)胞的高螢光素酶表達(dá)。用螢光素酶表達(dá)載體感染細(xì)胞并在感染后48小時(shí)通過ivis系統(tǒng)使其可視化。注意到細(xì)胞顯示高水平的螢光素酶表達(dá)。圖16a-d描述了給scid/beige小鼠注射2x106個(gè)表達(dá)螢光素酶的plx-c細(xì)胞。一只小鼠im注射，一只iv注射。采用ivis系統(tǒng)監(jiān)測(cè)被注射小鼠以評(píng)價(jià)plx-c的體內(nèi)生物分布。顯示第1天(圖16a)、第4天(圖16b)、第6天(圖16c)和第22天(圖16d)的ivis結(jié)果。圖17為描述用本發(fā)明粘附細(xì)胞(命名為plx-c)治療的小鼠的髖和足灌注增加的圖。該圖描述了小鼠髖和足灌注百分?jǐn)?shù)的中值。采用非接觸激光多普勒儀在手術(shù)后第0、6、9、14和21天(顯示的為第21天的測(cè)量值)從兩邊測(cè)量髖和足的血流。結(jié)果表示為試驗(yàn)中缺血肢血流與正常肢血流的比。圖18為描述肢體功能和缺血損傷的體內(nèi)評(píng)價(jià)的圖。采用以下評(píng)分系統(tǒng)連續(xù)進(jìn)行缺血肢受損用途的半定量評(píng)價(jià)：3＝拖足,2＝無拖足但無跖屈,1＝跖屈,以及0＝彎曲腳趾以抵抗對(duì)尾巴的輕微牽引。圖19a-c描述了plx-c處理后增加的毛細(xì)血管密度。圖19a描述了用pbs處理的小鼠的毛細(xì)血管密度；圖19b描述了用plx-c細(xì)胞處理的小鼠的毛細(xì)血管密度；圖19c為描述每個(gè)肌肉細(xì)胞毛細(xì)血管數(shù)量的條形圖。注意到在由特異毛細(xì)血管染色驗(yàn)證的誘導(dǎo)的肢體缺血后，在plx-c處理小鼠中而不是在對(duì)照小鼠中觀察到增加的毛細(xì)血管密度。圖20a-b描述了plx-c給藥后減少的氧化應(yīng)激和內(nèi)皮炎癥。圖20a為描述氧化應(yīng)激(硝基酪氨酸染色)的條形圖；及圖20b為描述內(nèi)皮炎癥(vcam評(píng)價(jià))的條形圖。注意到在用plx-c處理的小鼠中觀察到減少的氧化應(yīng)激和內(nèi)皮炎癥。發(fā)明實(shí)施方案描述在一些實(shí)施方案中本發(fā)明為使用胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞增加組織中血管生成和治療缺血或需要結(jié)締組織再生和/或修復(fù)的醫(yī)學(xué)狀況的方法。通過參考附圖和附加說明可更好地理解本發(fā)明的原理和操作。在詳細(xì)解釋本發(fā)明至少一個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)理解的是本發(fā)明的應(yīng)用不受限于以下說明所列出的或?qū)嵤├C的詳細(xì)內(nèi)容。本發(fā)明可具有其他實(shí)施方案或以各種方式實(shí)施或進(jìn)行。而且，也應(yīng)理解的是本文應(yīng)用的措辭和術(shù)語用于描述目的且不應(yīng)被認(rèn)為具有限制性。在將本發(fā)明付諸實(shí)施時(shí)，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)源自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞在增加組織中血管生成和治療缺血和需要結(jié)締組織再生和/或修復(fù)的醫(yī)學(xué)狀況中高度有效。如下文和之后的實(shí)施例部分的實(shí)施例1-8所證明，本發(fā)明人可擴(kuò)增包含基質(zhì)干細(xì)胞性質(zhì)的源自脂肪和胎盤的粘附細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)據(jù)此擴(kuò)增的細(xì)胞在冷凍保藏后具有活力，如粘附性和再增殖測(cè)定法所證明(見實(shí)施例1)。源自胎盤的粘附細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析揭示了不同的標(biāo)記表達(dá)類型(見圖3a-b)。如下文實(shí)施例部分的實(shí)施例6中進(jìn)一步顯示，移植源自胎盤的粘附細(xì)胞顯著誘導(dǎo)被動(dòng)脈結(jié)扎(缺血后肢模型)的小鼠髖和足的血流(圖17)，顯著改善肢體功能(圖18)，增加毛細(xì)血管密度(圖19a-c)且減少氧化應(yīng)激和內(nèi)皮炎癥(圖20a-b)。因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面提供了增加組織中血管生成的方法。該方法通過使組織與選自胎盤和脂肪組織的組織的粘附細(xì)胞接觸實(shí)現(xiàn)，藉此增加組織中的血管生成。本文所用短語“增加組織中的血管生成”指增加(誘導(dǎo)、上調(diào))組織中生成新毛細(xì)血管的過程。本文所用短語“粘附細(xì)胞”指錨著依賴即需要附著在表面上以體外生長(zhǎng)的均質(zhì)或異質(zhì)細(xì)胞群。本文所用短語“脂肪組織”指包含脂肪細(xì)胞(脂細(xì)胞)的結(jié)締組織。本文所用術(shù)語“胎盤組織”指為子宮壁襯里并在懷孕期間包裹胎兒的哺乳動(dòng)物雌性器官的任何部分，胎盤和胎兒通過臍帶連接。出生后胎盤剝離(稱為產(chǎn)后胎盤)。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，胎盤指完整的胎盤。源自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞可使用二維或三維培養(yǎng)條件增殖。在2d培養(yǎng)中增殖粘附細(xì)胞的條件進(jìn)一步描述于下文和之后的實(shí)施例部分。本文所用短語“三維培養(yǎng)”指將細(xì)胞置于與細(xì)胞生長(zhǎng)相容同時(shí)使得細(xì)胞可以在多于一層上生長(zhǎng)的條件。已很好的認(rèn)識(shí)到細(xì)胞在活生物體(或組織)中的原位環(huán)境在三維構(gòu)造中。細(xì)胞被其它細(xì)胞圍繞。它們被固定在使得可建立各種局部微環(huán)境的納米級(jí)胞外基質(zhì)纖維的復(fù)合網(wǎng)絡(luò)中。它們的胞外配體不僅介導(dǎo)對(duì)基底膜的附著，而且還可及多種血管和淋巴管。氧、激素和營(yíng)養(yǎng)素被運(yùn)送到細(xì)胞而廢物則被運(yùn)出。本發(fā)明三維培養(yǎng)條件設(shè)計(jì)為模擬例如以下進(jìn)一步例證的環(huán)境。應(yīng)理解的是三維培養(yǎng)條件使能夠擴(kuò)增粘附細(xì)胞。本文所用術(shù)語“擴(kuò)增的”和“擴(kuò)增”指基本上不分化地維持細(xì)胞及最終細(xì)胞生長(zhǎng)，即，使細(xì)胞群增加(例如至至少2倍)而不存在伴隨所述增加的分化。本文所用術(shù)語“維持的”和“維持”指基本上不分化的細(xì)胞更新，即基本上穩(wěn)定細(xì)胞群而不存在伴隨所述穩(wěn)定的分化。如所述，本發(fā)明這一方面的粘附細(xì)胞回收自脂肪或胎盤組織。可從足月或早產(chǎn)胎盤得到胎盤細(xì)胞。優(yōu)選一旦外出血就收集胎盤。優(yōu)選以足夠除去殘留細(xì)胞的時(shí)間灌注胎盤。本文所用術(shù)語“灌注”指將流體傾注或使流體通過器官或組織的行為。胎盤組織可來自任何哺乳動(dòng)動(dòng)物；例如人的胎盤組織。方便的胎盤組織來源是來自產(chǎn)后胎盤(例如1-6小時(shí))，然而，胎盤組織或細(xì)胞的來源或分離胎盤組織的方法對(duì)于本發(fā)明而言并不重要。源自胎盤的粘附細(xì)胞可來自胎盤的胎兒(即羊膜或胎盤內(nèi)部部分，參見實(shí)施例1)和母體(即基蛻膜和壁蛻膜)部分。在生理緩沖液[例如磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)或hank’s緩沖液)中洗滌組織樣品。通過用消化酶處理組織(參見下文)或/和切碎(mince)并用洗滌介質(zhì)將組織部分沖洗過尼龍濾器或通過輕輕吸移(falcon，becton，dickinson，sanjose，ca)，制備單細(xì)胞懸浮液。源自脂肪組織的粘附細(xì)胞可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法來分離。例如，這樣的方法闡述于美國專利第6,153,432號(hào)。脂肪組織可源自網(wǎng)膜/內(nèi)臟、乳房、性腺或其它脂肪組織部位。脂肪組織的一種來源為網(wǎng)膜脂肪。在人類中，脂肪通常通過吸脂來分離。源自脂肪組織的分離粘附細(xì)胞可通過在如下條件處理組織得到：用消化酶(例如膠原酶、胰蛋白酶和/或分散酶；和/或有效濃度的透明質(zhì)酸酶或dna酶)；和乙二胺四乙酸(edta)；在25-50℃的溫度作用10分鐘到3小時(shí)。然后可以讓細(xì)胞通過20微米-1毫米的尼龍或粗棉布網(wǎng)濾器。然后讓細(xì)胞直接在培養(yǎng)基中或經(jīng)過ficoll或percoll或其它顆粒梯度進(jìn)行差速離心。細(xì)胞在4-50℃的溫度以100-3000xg速度離心1分鐘至1小時(shí)(參見美國專利第7,078,230號(hào))。除源自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞外，本發(fā)明還設(shè)想特征為基質(zhì)干細(xì)胞表型(其將在下文進(jìn)一步闡述)的來自其它細(xì)胞來源的粘附細(xì)胞的用途。可從其中提取粘附細(xì)胞的組織來源包括但不限于：臍帶血、頭皮、毛囊[例如美國專利申請(qǐng)第20060172304號(hào)所述]、睪丸[例如guank.等，nature.2006apr27；440(7088):1199-203所述]、人嗅覺粘膜[例如marshall，ct.等，histolhistopathol.2006jun:21(6):633-43所述]、胚胎卵黃囊[例如geijsenn，nature.2004jan8；427(6970):148-54所述]和羊水[pieternella等(2004)stemcells.22:1338-1345]，已知它們所有的都包含間充質(zhì)干細(xì)胞。來自這些組織來源的粘附細(xì)胞可以通過使這些細(xì)胞在粘附表面上培養(yǎng)分離，藉此從原始群中的其它細(xì)胞分離出粘附細(xì)胞。無論來源(例如胎盤或脂肪組織)，優(yōu)選在無菌條件下提取細(xì)胞。一旦得到分離的細(xì)胞，就使其粘附到粘附材料(例如構(gòu)成表面)上，藉此分離粘附細(xì)胞。培養(yǎng)可在如實(shí)施例部分的實(shí)施例4描述的2d條件下進(jìn)行且細(xì)胞可進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至3d條件。本文所用“粘附材料”指具有可讓細(xì)胞保持在表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)(例如，帶電荷的表面暴露基團(tuán))的人工合成、天然存在或其組合的無細(xì)胞毒性(即生物相容)材料。可用于本發(fā)明這方面的粘附材料的實(shí)例包括但不限于：聚酯、聚丙烯、聚鏈烯、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纖維素、玻璃纖維、陶瓷顆粒、matrigel、胞外基質(zhì)組分(例如纖維粘連蛋白、軟骨粘連蛋白、層粘連蛋白)、膠原、聚l乳酸和惰性金屬纖維。用本領(lǐng)域熟知方法可實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步純化或富集基質(zhì)干細(xì)胞的步驟(例如通過采用基質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)的facs，其在下文進(jìn)一步闡述)。用于本發(fā)明培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的非限制性實(shí)例包括極限必須培養(yǎng)基eagle、adc-1、lpm(無牛血清白蛋白)、f10(ham)、f12(ham)、dccm1、dccm2、rpmi1640、bgj培養(yǎng)基(進(jìn)行和不進(jìn)行fitton-jackson改良)、基本培養(yǎng)基eagle(bme-加入earle’s鹽基質(zhì))、dulbecco’s改良eagle培養(yǎng)基(dmem-無血清)、yamane、imem-20、glasgow改良eagle培養(yǎng)基(gmem)、leibovitzl-15培養(yǎng)基、mccoy’s5a培養(yǎng)基、培養(yǎng)基m199(m199e-含earle’s鹽基質(zhì))、培養(yǎng)基m199(m199h-含hank’s鹽基質(zhì))、極限必須培養(yǎng)基eagle(mem-e-含earle’s鹽基質(zhì))、極限必須培養(yǎng)基eagle(mem-h-含hank’s鹽基質(zhì))和極限必須培養(yǎng)基eagle(mem-naa，含非必須氨基酸)，在數(shù)目眾多的其他培養(yǎng)基中包括：培養(yǎng)基199、cmrl1415、cmrl1969、cmrl1066、nctc135、mb75261、mab8713、dm145、williams'g、neμman&tytell,higuchi、mcdb301、mcdb202、mcdb501、mcdb401、mcdb411,mdbc153。用于本發(fā)明的優(yōu)選培養(yǎng)基為dmem。這些和其它有用的培養(yǎng)基購自gibco，grandisland，n.y.，usa和biologicalindustries，bethaemek，israel等等。大量這些培養(yǎng)基概述于methodsinenzymology，第lviii卷，“cellculture”，第6272頁，williamb.jakoby和irah.pastan編輯，academicpress,inc.出版。培養(yǎng)基可添加例如血清(例如牛或其它物種的胎血清)和任選或備選以皮克/ml-毫克/ml水平濃度的生長(zhǎng)因子、維生素(例如抗壞血酸)、細(xì)胞因子、鹽(例如b-甘油磷酸鹽)、類固醇(例如地塞米松)以及激素(例如生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、白介素3、白介素6、白介素7、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、c-kit配體/干細(xì)胞因子、骨保護(hù)素配體、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、血小板源生長(zhǎng)因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白)。應(yīng)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到可將另外組分加入培養(yǎng)基中。這樣的組分可為抗生素、抗真菌素、白蛋白、氨基酸和本領(lǐng)域已知用于細(xì)胞培養(yǎng)的其它組分。此外，需要時(shí)可加入組分以增強(qiáng)分化過程(參見以下進(jìn)一步闡述)。應(yīng)理解的是當(dāng)本發(fā)明粘附細(xì)胞給予人受試者時(shí)，細(xì)胞和培養(yǎng)基(例如，含有上述培養(yǎng)基添加劑)應(yīng)基本上不含異源成分，即沒有任何動(dòng)物污染物例如支原體。例如，培養(yǎng)基可添加血清替代物、人血清和/或合成或重組產(chǎn)生的因子。如本文所述，一旦取得粘附細(xì)胞就可將其傳代到二維或三維環(huán)境(參見以下實(shí)施例部分的實(shí)施例1和4)。但是應(yīng)該了解，可在分離后立即將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3d構(gòu)造基質(zhì)中或在二維條件之后傳代到三維環(huán)境(如上文所述)。因此，配置本發(fā)明這方面的粘附材料用于3d培養(yǎng)，藉此提供基本上增加用于細(xì)胞粘附的可用附著表面的生長(zhǎng)基質(zhì)，以便模擬組織(例如胎盤)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)，可在3d生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)。這樣的物反應(yīng)器實(shí)例包括但不限于活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器、連續(xù)攪拌罐生物反應(yīng)器、固定床生物反應(yīng)器、celligen生物反應(yīng)器系統(tǒng)(newbrunswickscientific(nbs))或bioflo310生物反應(yīng)器系統(tǒng)(newbrunswickscientific(nbs)。如實(shí)施例部分的實(shí)施例4所示，celligen生物反應(yīng)器可在可控條件下(例如，ph、溫度和氧氣水平)且利用恒定的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基灌注來3d擴(kuò)增粘附細(xì)胞。而且，可直接監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物的葡萄糖、乳酸鹽、谷氨酰胺、谷氨酸和銨的濃度水平。粘附細(xì)胞的葡萄糖消耗速率和乳酸鹽形成速率使得可以測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)速率并確定收獲時(shí)間。可用于本發(fā)明的其它3d生物反應(yīng)器包括但不限于連續(xù)攪拌罐生物反應(yīng)器，其中使培養(yǎng)基連續(xù)進(jìn)料到生物反應(yīng)器中，將產(chǎn)物連續(xù)抽出，以維持反應(yīng)器內(nèi)的時(shí)間恒定穩(wěn)態(tài)。帶有纖維床籃的攪拌罐生物反應(yīng)器可購自例如newbrunswickscientificco.edison，nj、固定床生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器(其中空氣通常通入中央導(dǎo)管的底部，向上流動(dòng)同時(shí)形成氣泡，在柱頂分離廢氣)、含有polyactive泡沫的細(xì)胞接種灌注式生物反應(yīng)器(如wendt，d.等，biotechnolbioeng84:205-214，(2003)所述)、管狀聚l乳酸(plla)多孔支架徑向流灌注式生物反應(yīng)器[如kitagawa等，biotechnologyandbioengineering93(5):947-954(2006)所述]。可根據(jù)本發(fā)明使用的其它生物反應(yīng)器闡述于美國專利第6,277,151號(hào)、第6197,575號(hào)、第6139,578號(hào)、第6132,463號(hào)、第5902,741號(hào)和第5,629,186號(hào)。接種時(shí)優(yōu)選細(xì)胞接種達(dá)到100,000-1,500,000個(gè)細(xì)胞/mm。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，接種共150±30x106個(gè)細(xì)胞，接種3-5x106個(gè)細(xì)胞/gr載體，或接種0.015-0.1x106個(gè)細(xì)胞/ml。當(dāng)至少約10％的細(xì)胞增殖時(shí)收獲細(xì)胞且同時(shí)避免不可控的分化和衰老。培養(yǎng)進(jìn)行至少約2天、3天、4天、5天、10天、20天、1個(gè)月或甚至更長(zhǎng)。應(yīng)該了解，在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)可能延長(zhǎng)這一時(shí)間。在3d培養(yǎng)中培養(yǎng)粘附細(xì)胞可在連續(xù)流入培養(yǎng)基下實(shí)現(xiàn)。也可進(jìn)行傳代以增加細(xì)胞數(shù)目。應(yīng)了解的是可改變培養(yǎng)基以延長(zhǎng)和改進(jìn)培養(yǎng)條件。本發(fā)明一些實(shí)施方案的粘附細(xì)胞包含至少約10％、28％、30％、50％、80％或更多的增殖性細(xì)胞(可通過監(jiān)測(cè)s和g2/m期的facs測(cè)定)。本發(fā)明一些實(shí)施方案的粘附細(xì)胞可包含至少一種“基質(zhì)干細(xì)胞表型”。本文所用“基質(zhì)干細(xì)胞表型”指源自骨髓的基質(zhì)(即間充質(zhì))干細(xì)胞的典型結(jié)構(gòu)或功能表型。本文所用短語“干細(xì)胞”指沒有終末分化的細(xì)胞。因此，例如，細(xì)胞可能具有紡錘形。作為備選或另外，細(xì)胞可表達(dá)基質(zhì)干細(xì)胞典型的一種或一群標(biāo)記(例如表面標(biāo)記)。基質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記(陽性和陰性)的實(shí)例包括但不限于cd105+、cd29+、cd44+、cd73+、cd90+、cd3-、cd4-、cd34-、cd45-、cd80-、cd19-、cd5-、cd20-、cd11b-、cd14-、cd19-、cd79-、hla-dr-和fmc7-。其它基質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記包括但不限于酪氨酸羥化酶、巢蛋白和h-nf。根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)產(chǎn)生的胎盤組織的粘附細(xì)胞具有基本上如下文實(shí)施例部分的實(shí)施例4描述的基因表達(dá)概況。基質(zhì)干細(xì)胞典型的功能表型實(shí)例包括但不限于t細(xì)胞抑制活性(不刺激t細(xì)胞而相反地對(duì)其抑制)、造血干細(xì)胞支持活性以及成脂肪、成肝、成骨和成神經(jīng)分化之任一。任意這些結(jié)構(gòu)或功能特征可用于證明本發(fā)明細(xì)胞合格(見下文實(shí)施例部分的實(shí)施例4)。根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞群特征為獨(dú)特的蛋白質(zhì)表達(dá)概況，如實(shí)施例部分的實(shí)施例1所示。因此，例如，根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)產(chǎn)生的胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞能夠表達(dá)和/或分泌高水平的所選擇因子。例如，這樣的細(xì)胞表達(dá)或分泌的scf、flt-3、h2a組蛋白家族(h2af)或醛脫氫酶x(aldhx)為在2d培養(yǎng)中生長(zhǎng)的胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞表達(dá)或分泌的的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或甚至12倍。另外或作為備選，本發(fā)明細(xì)胞群分泌或表達(dá)il-6、真核翻譯延伸因子(eeef2)、網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白3、ef-手鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域(rcn2)或鈣調(diào)理蛋白1堿性平滑肌(cnn1)的水平為在2d培養(yǎng)中生長(zhǎng)的胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞表達(dá)或分泌的的至少2、3或5倍。另外或作為備選，本發(fā)明細(xì)胞群的特征為與2d培養(yǎng)的細(xì)胞相比各種其它蛋白表達(dá)水平較低。因此，例如，分泌或表達(dá)低于0.6、0.5、0.25或0.125的在2d培養(yǎng)中生長(zhǎng)的胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞表達(dá)或分泌的異源細(xì)胞核核糖核蛋白h1(hnrphl)、cd44抗原同種型2前體、3磷酸腺苷5磷酸硫酸合酶2同種型a(papss2)或核糖體蛋白l7a(rpl7a)的表達(dá)水平。如下文實(shí)施例部分的實(shí)施例3-4所示，粘附細(xì)胞尤其是3d-粘附細(xì)胞顯示可抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mlr)測(cè)定中人臍帶血單核細(xì)胞的免疫反應(yīng)，因此顯示可優(yōu)選用于臨床的生物活性(例如，t細(xì)胞抑制活性、造血干細(xì)胞支持活性)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的粘附細(xì)胞可抑制受試者中的免疫反應(yīng)。本文所用短語“抑制受試者中的免疫反應(yīng)”指降低或抑制發(fā)生在受試者中響應(yīng)抗原(例如，外源細(xì)胞或其部分)的免疫反應(yīng)。可被粘附細(xì)胞抑制的免疫應(yīng)答包括體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，其分別涉及通過抗體和t-淋巴細(xì)胞(t細(xì)胞的增殖)特異識(shí)別病原體抗原。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明粘附細(xì)胞的的特征為比生長(zhǎng)在二維(2d)培養(yǎng)中的胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞更高的免疫抑制活性。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，該免疫抑制活性包括t細(xì)胞增殖減少。如上文所述和下文實(shí)施例部分的實(shí)施例6所述，本發(fā)明的粘附細(xì)胞誘導(dǎo)體內(nèi)血管生成(例如髖和腿中的血流)、顯著改善動(dòng)脈結(jié)扎動(dòng)物的肢體功能、增加毛細(xì)血管密度并降低氧化應(yīng)激和內(nèi)皮炎癥。而且，如下文實(shí)施例部分的實(shí)施例7詳細(xì)描述，本發(fā)明粘附細(xì)胞顯著改善大鼠模型中從中風(fēng)的恢復(fù)。因此，根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供治療需要其的受試者中缺血的方法。該方法通過給予所述受試者治療有效量的本發(fā)明粘附細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，藉此治療該受試者的缺血。本文所用術(shù)語“缺血”指特征為血管生成不足或與其相關(guān)的任何病理(疾病、狀況、綜合征或病癥)。實(shí)例包括但不限于外周動(dòng)脈病(pad)例如肢體缺血和嚴(yán)重肢體缺血(cli)、缺血性心臟病、缺血性腦病(例如中風(fēng))、創(chuàng)傷愈合延遲、潰瘍愈合延遲、生殖相關(guān)病癥、動(dòng)脈硬化、缺血性血管疾病、缺血性心臟病、心肌缺血、冠狀動(dòng)脈病(cad)、動(dòng)脈粥樣硬化心血管疾病、冠狀動(dòng)脈左總干病、動(dòng)脈阻塞性疾病、外周缺血、外周血管病、腎血管病、外周動(dòng)脈病、肢體缺血、下肢缺血、腦缺血、腦血管病、視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜修復(fù)、重建障礙、vonhippel-lindau綜合征、遺傳性出血性telengiectasia缺血性血管病、buerger病、缺血性腎病以及缺血胎盤。本文所用術(shù)語“治療”指抑制或阻止病理(例如缺血)的發(fā)展和/或引起病理的減少、減輕或退行。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可使用各種方法學(xué)和測(cè)定法評(píng)價(jià)病理的發(fā)展，且相似地，各種方法學(xué)和測(cè)定法可用于評(píng)價(jià)病理的減少、減輕或退行。術(shù)語“治療”也可指緩解或減少與該病理相關(guān)的癥狀。本文所用術(shù)語“需要其的受試者”指任何受試者(例如，哺乳動(dòng)物)，例如被診斷出或患有該病理的人類受試者。如上文所述和下文實(shí)施例部分的實(shí)施例8所述，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的粘附細(xì)胞可使結(jié)締組織再生和/或修復(fù)。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了治療需要其的受試者中需要結(jié)締組織再生和/或修復(fù)的醫(yī)學(xué)狀況的方法。該方法通過給予受試者治療有效量的本發(fā)明粘附細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。術(shù)語“結(jié)締組織”指包含膠原束、彈性纖維(例如，肌肉和血管之間和周圍)和簡(jiǎn)單細(xì)胞的支撐框架組織。結(jié)締組織的實(shí)例包括但不限于密質(zhì)結(jié)締組織(例如，韌帶、腱、牙周韌帶)、蜂窩結(jié)締組織(例如，具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的纖維如膠原和彈力蛋白)、網(wǎng)狀結(jié)締組織、脂肪組織、血、骨、軟骨、皮膚、椎間盤、牙髓、牙本質(zhì)、牙齦、細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)-形成細(xì)胞、疏松結(jié)締組織和平滑肌細(xì)胞。本文所用短語“需要結(jié)締組織再生和/或修復(fù)的醫(yī)學(xué)狀況”指以結(jié)締組織受損(即，非功能組織、癌性的或癌前期組織、破裂組織、斷裂組織、纖維變性組織或缺血組織)或喪失(例如創(chuàng)傷、感染性疾病、遺傳病等后)為特征的病理。該病理的非限制性實(shí)例包括骨折、骨癌(例如骨肉瘤、骨癌轉(zhuǎn)移)、燒傷創(chuàng)面、關(guān)節(jié)軟骨缺損和深層創(chuàng)傷。術(shù)語“給予受試者”指將本發(fā)明細(xì)胞引入靶組織。這些細(xì)胞可源自接受者或來自同種異體或異種供體。這一短語也涵蓋將本發(fā)明細(xì)胞“移植”、“細(xì)胞替換”或“移入”受試者中。該受試者可為需要結(jié)締組織再生和/或修復(fù)的任意哺乳動(dòng)物，包括例如人或家養(yǎng)動(dòng)物，包括但是不限于馬(即馬科)、牛、山羊、綿羊、豬、狗、貓、駱駝、羊駝、美洲駝和牦牛。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的粘附細(xì)胞可用于治療包括以下的狀況：軟骨下骨囊腫、骨折、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、退化骨、各種結(jié)締組織喪失相關(guān)的癌癥(例如，骨癌、骨肉瘤、骨轉(zhuǎn)移)、軟骨損傷、關(guān)節(jié)軟骨缺損、視乳頭變性疾病、成骨不全(oi)、燒傷、燒傷創(chuàng)面、深層創(chuàng)傷、創(chuàng)傷愈合延遲、韌帶受損以及腱受損，例如馬和其他需要其的受試者(如上文所述)中由過度勞累引起的腱損傷。根據(jù)本發(fā)明這一方面給予的細(xì)胞包括上述可在三維或二維環(huán)境中培養(yǎng)的粘附細(xì)胞及其間充質(zhì)和非間充質(zhì)的部分或終末分化的衍生物。從本發(fā)明基質(zhì)干細(xì)胞中衍生譜系特異細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域熟知。參見例如美國專利第5,486,359號(hào)、第5,942,225號(hào)、第5,736,396號(hào)、第5,908,784號(hào)和第5,902,741號(hào)。這些細(xì)胞可為首次用于實(shí)驗(yàn)的或經(jīng)遺傳修飾的以衍生目標(biāo)譜系(參見美國專利申請(qǐng)第20030219423號(hào))。這些細(xì)胞可為自體或非自體來源(即同種異體或異種)的新鮮或冷凍(例如，冷凍保藏)制備物。根據(jù)醫(yī)學(xué)狀況，可給予受試者其他的化學(xué)藥物(例如免疫調(diào)節(jié)的、化學(xué)療法等)或細(xì)胞。因?yàn)榉亲泽w細(xì)胞在給予身體時(shí)會(huì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，所以已研發(fā)了數(shù)種方法以降低排斥非自體細(xì)胞的可能性。這些包括抑制受者的免疫系統(tǒng)或在移植前將非自體細(xì)胞膠囊化在免疫隔離的半透膜中。膠囊化(encapsulation)技術(shù)通常分類為微膠囊化，其涉及小的球狀載體，和大膠囊化(macroencapsulation)，其涉及較大的平板中空纖維膜(uludag，h.等，technologyofmammaliancellencapsulation.advdrugdelivrev.2000；42:29-64)。制備微膠囊的方法為本領(lǐng)域已知，包括例如如下公開的方法：lumz等，cellencapsulationwithalginateandalpha-phenoxycinnamylidene-acetylatedpoly(allylamine).biotechnolbioeng.2000,70:479-83,changtmandprakashs.proceduresformicroencapsulationofenzymes,cellsandgeneticallyengineeredmicroorganisms.molbiotechnol.2001,17:249-60和lumz等,anovelcellencapsulationmethodusingphotosensitivepoly(allylaminealpha-cyanocinnamylideneacetate).jmicroencapsul.2000,17:245-51。例如，通過將改良的膠原與甲基丙烯酸2-羥乙酯(hema)、甲基丙烯酸(maa)和甲基丙烯酸甲酯(mma)的三元聚合物殼絡(luò)合來制備微膠囊，得到2-5μm的膠囊厚度。這樣的微膠囊可進(jìn)一步用另外的2-5μm三元聚合物殼包囊，以提供帶負(fù)電荷的光滑表面并使血漿蛋白吸收最小化(chia,s.m.等，multi-layeredmicrocapsulesforcellencapsulationbiomaterials.200223:849-56)。其它微膠囊基于藻酸鹽、海洋多糖(sambanis,a.encapsulatedisletsindiabetestreatment.diabetestechnol.ther.2003,5:665-8)或其衍生物。例如，可通過在氯化鈣存在下聚陰離子藻酸鈉和纖維素硫酸鈉與聚陽離子聚(亞甲基共胍)鹽酸鹽之間的聚電解質(zhì)絡(luò)合作用來制備微膠囊。應(yīng)了解，當(dāng)使用較小的膠囊時(shí)改進(jìn)了細(xì)胞膠囊化。因此，當(dāng)膠囊大小從1mm減小到400μm時(shí)，膠囊化細(xì)胞的質(zhì)量控制、機(jī)械穩(wěn)定性、分散特性和體外活性都得到改進(jìn)(canaplel.等，improvingcellencapsulationthroughsizecontrol.jbiomaterscipolym編輯.2002；13:783-96)。此外，發(fā)現(xiàn)孔徑很好地控制在小至7nm的、表面化學(xué)經(jīng)處理(tailored)的和精確微構(gòu)造的納米孔生物膠囊成功地為細(xì)胞免疫隔離出微環(huán)境(williamsd.smallisbeautiful:microparticleandnanoparticletechnologyinmedicaldevices.meddevicetechnol.1999,10:6-9；desai,t.a.microfabricationtechnologyforpancreaticcellencapsulation.expertopinbiolther.2002,2:633-46)。免疫抑制劑實(shí)例包括但不限于：氨甲蝶呤(methotrexate)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、環(huán)孢霉素(cyclosporine)、環(huán)孢霉素a(cyclosporina)、氯喹(chloroquine)、羥氯喹、柳氮磺吡啶(sulfasalazine、sulphasalazopyrine)、金鹽、d-青霉胺(d-penicillamine)、來氟米特(leflunomide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、阿那白滯素(anakinra)、英夫利昔單抗(infliximab)(remicade)、依那西普(etanercept)、tnfα阻斷劑、靶向炎性細(xì)胞因子的生物藥物，和非固醇類抗炎藥物(nsaid)。nsaid實(shí)例包括但不限于：乙酰水楊酸、水楊酸膽堿鎂、二氟尼柳(diflunisal)、水楊酸鎂、雙水楊酸酯、水楊酸鈉、雙氯芬酸(diclofenac)、依托度酸、非諾洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸、甲氯芬那酸酯、萘普生(naproxen)、萘丁美酮(nabumetone)、保泰松(phenylbutazone)、吡羅昔(phenylbutazone)、吡羅昔康(piroxicam)、舒林酸、托美丁(tolmetin)、對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、cox-2抑制劑和曲馬多(tramadol)。在本文所述任一方法中，可以給予細(xì)胞本身，或優(yōu)選作為進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物的一部分來給予。本文所用“藥物組合物”指含其它化學(xué)組分(例如藥學(xué)上可接受的載體和賦形劑)的本發(fā)明粘附細(xì)胞(即選自胎盤和脂肪組織的組織的粘附細(xì)胞，其獲自三維培養(yǎng))的制劑。藥物組合物的目的是方便將細(xì)胞給予受試者。下文所用術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指載體或稀釋劑，其不會(huì)引起對(duì)受試者的明顯刺激，不消除所給予化合物的生物學(xué)活性和特性。載體的非限制性實(shí)例為丙二醇、鹽水、乳液和有機(jī)溶劑與水的混合物。本文所用術(shù)語“賦形劑”指加到藥物組合物中以進(jìn)一步方便給予化合物的惰性物質(zhì)。賦形劑的非限制性實(shí)例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各種類型淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，藥學(xué)載體為水性鹽溶液。配制和給予藥物的技術(shù)可在“remington'spharmaceuticalsciences”，mackpublishingco.,easton，pa，最新版本中找到，其通過引用并于本文。可以全身方式給予藥物組合物(如上文所述)。或者，可局部給予藥物組合物，例如直接將藥物組合物注射到患者的組織區(qū)。可通過本領(lǐng)域熟知的方法來制備本發(fā)明藥物組合物，例如通過常規(guī)的混合、溶解、制粒、制成糖錠劑、研粉、乳化、膠囊化、包載或凍干的方法。因此，可用一種或更多種包含賦形劑和助劑的生理學(xué)上可接受的載體以常規(guī)方式來配制用于本發(fā)明的藥物組合物，所述載體方便將活性成分加工成可在藥學(xué)上使用的制劑。合適的制劑取決于所選擇的給藥途徑。對(duì)于注射而言，可在水溶液中配制藥物組合物的活性成分，優(yōu)選生理上相容的緩沖液例如hank’s溶液、ringer’s溶液、生理鹽緩沖液或包含冷凍保護(hù)劑的冷凍介質(zhì)。對(duì)于經(jīng)粘膜給藥而言，制劑中使用適于待滲透的屏障的滲透劑。這樣的滲透劑通常為本領(lǐng)域所知。對(duì)于用于本發(fā)明方法中的任何制劑而言，可從體外和細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定中初步估計(jì)治療有效量或劑量。優(yōu)選在動(dòng)物模型中調(diào)配劑量以達(dá)到所需的濃度或滴度。這樣的信息可用于更準(zhǔn)確地確定用于人的劑量。可通過體外標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中測(cè)定本文所述活性成分的毒性和療效。從這些體外和細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究中得到的數(shù)據(jù)可用于調(diào)配供人類使用的一系列劑量。劑量可視所用劑型和所用給藥途徑而變化。可通過個(gè)別醫(yī)生考慮患者狀況選擇確切的制劑、給藥途徑和劑量(參見例如fingl等，1975，thepharmacologicalbasisoftherapeutics，第1章第1頁)。例如，可對(duì)帕金森患者進(jìn)行顯示對(duì)治療的陽性反應(yīng)的改善的運(yùn)動(dòng)功能的癥狀監(jiān)測(cè)。對(duì)于注射而言，可在水溶液中調(diào)配藥物組合物的活性成分，優(yōu)選生理上相容的緩沖液例如hank’s溶液、ringer’s溶液或生理鹽緩沖液。可個(gè)別調(diào)整劑量和給藥間隔，以使活性成分水平足以通過移植的細(xì)胞來有效調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)合成。達(dá)到理想效果所需的劑量將視個(gè)體特征和給藥途徑而定。檢測(cè)試驗(yàn)可用于測(cè)定血漿濃度。根據(jù)待治療狀況的嚴(yán)重程度和反應(yīng)性，可單次或復(fù)數(shù)次給藥，且療程持續(xù)若干天到若干周，或達(dá)到減輕疾病狀態(tài)。當(dāng)然，待給予的組合物的量將視正接受治療的個(gè)體、病痛的嚴(yán)重程度、給藥方式、主治醫(yī)生的判斷等等而定。給藥劑量和時(shí)間安排應(yīng)該對(duì)仔細(xì)連續(xù)監(jiān)測(cè)的個(gè)體狀況變化做出反應(yīng)。例如，基于監(jiān)測(cè)的指征，將給予被治療的帕金森患者足以緩解疾病癥狀的細(xì)胞量。韌帶損傷模型包括但不限于使用間充質(zhì)干細(xì)胞再建前十字韌帶的兔子模型[jit-kheng等,arthroscopy(2004)20(9):899-910]，用于前十字韌帶修復(fù)的長(zhǎng)效生物再吸收支架的山羊模型[altman等,jamacadorthopsurg.(2008)16(4):177-187]。腱修復(fù)的模型包括但不限于自體間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的腱修復(fù)的成體新西蘭白兔模型[awad等,tissueeng.(1999)5(3):267-77]。骨修復(fù)模型描述于例如stemcellsinendocrinology,humanapress(2005)183-206,其描述了操作間充質(zhì)干細(xì)胞用于骨修復(fù)。本發(fā)明細(xì)胞經(jīng)移植后優(yōu)選在患病區(qū)域存活一段時(shí)間(例如約1個(gè)月)，以便觀察治療效果。包括調(diào)配在藥物相容性載體中的本發(fā)明制劑在內(nèi)的組合物可以經(jīng)制備、置于合適的容器中；并標(biāo)記用于指示狀況的治療。若有需要，本發(fā)明組合物可以存于包或分配裝置(dipenserdevice)例如fda批準(zhǔn)的試劑盒中，其可包含含有活性成分的一個(gè)或更多個(gè)單位劑型。所述包可例如包含金屬或塑料薄片，例如泡罩包(blisterpack)。所述包或分配裝置可附有給藥說明。包或分配裝置還可提供與由管理藥物生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式的容器有關(guān)的公告，所述公告反映該機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的組合物形式或人類給藥或獸用給藥形式。這樣的公告例如可以是由美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)的處方藥物標(biāo)簽或批準(zhǔn)的產(chǎn)品說明書。本發(fā)明粘附細(xì)胞可適當(dāng)?shù)嘏渲瞥煽珊线m地包裝為制備物品的藥物組合物。該制備物品包括包裝材料，其包括用于增加組織血管生成、治療缺血和/或治療需要結(jié)締組織再生和/或修復(fù)的病理的標(biāo)簽；其中所述包裝材料包裝本發(fā)明粘附細(xì)胞。應(yīng)了解的是本發(fā)明粘附細(xì)胞可誘導(dǎo)受試者中的免疫抑制和/或耐受。因此，該粘附細(xì)胞可用于治療需要免疫抑制和/或耐受的任何狀況、該狀況包括但不限于自身免疫疾病和炎性疾病(包括急性和慢性炎性疾病)，包括但不限于心血管疾病、類風(fēng)濕病、腺病、胃腸道疾病、皮膚病、肝病、神經(jīng)病、肌肉病、腎病、生殖相關(guān)疾病、結(jié)締組織疾病和全身性疾病。自身免疫性心血管病的實(shí)例包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化(matsuurae.等,lupus.1998；7suppl2:s135)、心肌梗塞(vaaralao.lupus.1998；7suppl2:s132)、血栓癥(tincania.等，lupus1998；7suppl2:s107-9)、wegener’s肉芽腫病、takayasu’s動(dòng)脈炎、kawasaki綜合征(praprotniks.等,wienklinwochenschr2000aug25；112(15-16):660)、抗-viii因子自身免疫病(lacroix-desmazess.等,seminthrombhemost.2000；26(2):157)、壞死性小血管血管炎、微小多脈管炎、churg-strauss綜合征、少免疫(pauci-immune)局灶性壞死性和新月體性腎小球腎炎(noellh.annmedinterne(paris).2000may；151(3):178)、抗磷脂綜合征(flamholzr.等,jclinapheresis1999；14(4):171)、抗體誘導(dǎo)心力衰竭(wallukatg.等,amjcardiol.1999jun17；83(12a):75h)、血小板減少性紫癜(mocciaf.annitalmedint.1999apr-jun；14(2):114；semplejw.等,blood1996may15；87(10):4245)、自身免疫性溶血性貧血(efremovdg.等,leuklymphoma1998jan；28(3-4):285；sallahs.等,annhematol1997mar；74(3):139)、chagas病中的心臟自身免疫(cunha-netoe.等,jclininvest1996oct15；98(8):1709)和抗-輔助t淋巴細(xì)胞自身免疫(caporossiap.等,viralimmunol1998；11(1):9)。自身免疫性類風(fēng)濕病的實(shí)例包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(krennv.等,histolhistopathol2000jul；15(3):791；tischr,mcdevittho.procnatlacadsciunitssa1994jan18；91(2):437)和強(qiáng)直性脊柱炎(janvoswinkel等,arthritisres2001；3(3):189)。自身免疫性腺病的實(shí)例包括但不限于胰病、i型糖尿病、甲狀腺病、格雷夫斯病、甲狀腺炎、自發(fā)性自身免疫性甲狀腺炎、hashimoto’s甲狀腺炎、特發(fā)性粘液性水腫、卵巢自身免疫、自身免疫性抗精子不育、自身免疫性前列腺炎以及i型自身免疫性多腺體綜合征。疾病包括但不限于胰臟的自身免疫性疾病、i型糖尿病(castanol.和eisenbarthgs.ann.rev.immunol.8:647；zimmetp.diabetesresclinpract1996oct；34suppl:s125)、自身免疫性甲狀腺病、格雷夫斯病(orgiazzij.endocrinolmetabclinnortham2000jun；29(2):339；sakatas.等,molcellendocrinol1993mar；92(1):77)、自發(fā)性自身免疫性甲狀腺炎(braley-mullenh.和yus,jimmunol2000dec15；165(12):7262)、hashimoto’s甲狀腺炎(toyodan.等,nipponrinsho1999aug；57(8):1810)、特發(fā)性粘液性水腫(mitsumat.nipponrinsho.1999aug；57(8):1759)、卵巢自身免疫(garzakm.等,jreprodimmunol1998feb；37(2):87)、自身免疫性抗精子不育(diekmanab.等,amjreprodimmunol.2000mar；43(3):134)、自身免疫性前列腺炎(alexanderrb.等,urology1997dec；50(6):893)以及i型自身免疫性多腺體綜合征(harat.等,blood.1991mar1；77(5):1127)。自身免疫性胃腸道疾病的實(shí)例包括但不限于慢性炎性腸道疾病(garciaherolaa.等,gastroenterolhepatol.2000jan；23(1):16)、腹部疾病(landauye.和shoenfeldy.harefuah2000jan16；138(2):122)、結(jié)腸炎、回腸炎和crohn’s病。自身免疫性皮膚病的實(shí)例包括但不限于自身免疫性大皰性皮膚病，例如但不限于尋常型天皰瘡、大皰性類天皰瘡和落葉性天皰瘡。自身免疫性肝病的實(shí)例包括但不限于肝炎，自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎(francoa.等,clinimmunolimmunopathol1990mar；54(3):382)、原發(fā)性膽汁性肝硬變(jonesde.clinsci(colch)1996nov；91(5):551；strassburgcp.等,eurjgastroenterolhepatol.1999jun；11(6):595)和自身免疫性肝炎(mannsmp.jhepatol2000aug；33(2):326)。自身免疫性神經(jīng)疾病的實(shí)例包括但不限于多發(fā)性硬化癥(crossah.等,jneuroimmunol2001jan1；112(1-2):1)、阿爾茨海默氏病(oronl.等,jneuraltransmsuppl.1997；49:77)、重癥肌無力(infanteaj.和kraige,intrevimmunol1999；18(1-2):83；oshimam.等,eurjimmunol1990dec；20(12):2563)、神經(jīng)病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病(kornbergaj.jclinneurosci.2000may；7(3):191)；格-巴二氏綜合征和自身免疫性神經(jīng)病(kusunokis.amjmedsci.2000apr；319(4):234)、肌無力、lambert-eaton肌無力綜合征(takamorim.amjmedsci.2000apr；319(4):204)；副腫瘤性神經(jīng)疾病、小腦萎縮、副腫瘤性小腦萎縮和僵人綜合征(hiemstrahs.等,procnatlacadsciunitssa2001mar27；98(7):3988)；非副腫瘤性僵人綜合征、進(jìn)行性小腦萎縮、腦炎、rasmussen’s腦炎、肌萎縮性側(cè)索硬化、sydenham舞蹈病、抽動(dòng)穢語綜合征以及自身免疫性多內(nèi)分泌病(antoinejc.和honnoratj.revneurol(paris)2000jan；156(1):23)；免疫異常性神經(jīng)病(nobile-orazioe.等,electroencephalogrclinneurophysiol增刊1999；50:419)；獲得性神經(jīng)性肌強(qiáng)直、先天性多關(guān)節(jié)攣縮(vincenta.等,annnyacadsci.1998may13；841:482)、神經(jīng)炎、視神經(jīng)炎(soderstromm.等,jneurolneurosurgpsychiatry1994may；57(5):544)以及神經(jīng)變性疾病。自身免疫性肌肉疾病的實(shí)例包括但不限于肌炎、自身免疫性肌炎和原發(fā)性sjogren’s綜合征(feiste.等,intarchallergyimmunol2000sep；123(1):92)以及平滑肌自身免疫病(zaulid.等,biomedpharmacother1999jun；53(5-6):234)。自身免疫性腎病的實(shí)例包括但不限于腎炎和自身免疫性間質(zhì)性腎炎(kellycj.jamsocnephrol1990aug；1(2):140)。生殖相關(guān)的自身免疫疾病的實(shí)例包括但不限于反復(fù)性胎兒流失(fetalloss)(tincania.等,lupus1998；7suppl2:s107-9)。自身免疫性結(jié)締組織疾病的實(shí)例包括但不限于耳病、自身免疫性耳病(yootj.等,cellimmunol1994aug；157(1):249)和內(nèi)耳的自身免疫性疾病(gloddekb.等,annnyacadsci1997dec29；830:266)。自身免疫性全身性疾病的實(shí)例包括但不限于全身性紅斑狼瘡(eriksonj.等,immunolres1998；17(1-2):49)和全身性硬化癥(renaudineauy.等,clindiagnlabimmunol.1999mar；6(2):156)；chanot.等,immunolrev1999jun；169:107)。此外，粘附細(xì)胞可用于治療移植物移植相關(guān)的疾病，包括但不限于移植物排斥、慢性移植物排斥、亞急性移植物排斥、過急移植物排斥、急性移植物排斥和移植物抗宿主病。本文所用術(shù)語“約”指±10％。在考察下文非限制性實(shí)施例之后，本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點(diǎn)和新特征對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將顯而易見。此外，如上文描繪和下文權(quán)利要求部分所要求的每一本發(fā)明各種實(shí)施方案和方面可在下文的實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。實(shí)施例現(xiàn)在參考以下實(shí)施例，其與上述說明一起以非限制方式闡明本發(fā)明。本文所用命名法和本發(fā)明所用的實(shí)驗(yàn)操作通常包括分子、生化、微生物學(xué)和重組dna技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡的解釋。參見例如："molecularcloning:alaboratorymanual"sambrook等，(1989)；"currentprotocolsinmolecularbiology"第i-iii卷，ausubel,r.m.編輯(1994)；ausubel等，"currentprotocolsinmolecularbiology",johnwiley和sons,baltimore,maryland(1989)；perbal，"apracticalguidetomolecularcloning",johnwiley&sons,newyork(1988)；watson等，"recombinantdna",scientificamericanbooks,newyork；birren等(編輯)"genomeanalysis:alaboratorymanualseries"，第1-4卷，coldspringharborlaboratorypress,newyork(1998)；如美國專利第4,666,828號(hào)、第4,683,202號(hào)、第4,801,531號(hào)、第5,192,659號(hào)和第5,272,057號(hào)提出的方法；"cellbiology:alaboratoryhandbook",第i-iii卷cellis,j.e.編輯(1994)；"currentprotocolsinimmunology"第i-iii卷coliganj.e.編輯(1994)；stites等(編輯)，"basicandclinicalimmunology"(第8版),appleton&lange,norwalk,ct(1994)；mishell和shiigi(編輯)，"selectedmethodsincellularimmunology",w.h.freeman和co.,newyork(1980)；有用的免疫測(cè)定法廣泛闡述于專利和科學(xué)文獻(xiàn)中，參見例如美國專利第3,791,932號(hào)、第3,839,153號(hào)、第3,850,752號(hào)、第3,850,578號(hào)、第3,853,987號(hào)、第3,867,517號(hào)、第3,879,262號(hào)、第3,901,654號(hào)、第3,935,074號(hào)、第3,984,533號(hào)、第3,996,345號(hào)、第4,034,074號(hào)、第4,098,876號(hào)、第4,879,219號(hào)、第5,011,771號(hào)和第5,281,521號(hào)；"oligonucleotidesynthesis"gait，m.j.編輯(1984)；"nucleicacidhybridization"hames,b.d.，和higginss.j.編輯(1985)；"transcriptionandtranslation"hames，b.d.，和higginss.j.編輯(1984)；"animalcellculture”freshney，r.i.編輯(1986)；"immobilizedcellsandenzymes"irlpress，(1986)；"apracticalguidetomolecularcloning"perbal，b.，(1984)和"methodsinenzymology"第1-317卷，academicpress；"pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications",academicpress,sandiego,ca(1990)；marshak等，"strategiesforproteinpurificationandcharacterization-alaboratorycoursemanual"cshlpress(1996)；以上所有如同在本文完全闡述一樣通過引用并于本文。貫穿本文獻(xiàn)提供了其它一般的參考資料。認(rèn)為其中的方法為本領(lǐng)域熟知，提供它們是為了方便讀者。其中所包含的所有信息通過引用并于本文。實(shí)施例1從骨髓、胎盤和脂肪組織生產(chǎn)和培養(yǎng)粘附細(xì)胞在含3d載體的生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)粘附細(xì)胞以產(chǎn)生3d-粘附細(xì)胞，其特征為特異的細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)概況。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)生長(zhǎng)效率。通過在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)檢測(cè)這些細(xì)胞的分化能力。材料和實(shí)驗(yàn)操作骨髓粘附細(xì)胞-從正在進(jìn)行心臟直視手術(shù)或bm活檢的血液學(xué)健康的供者吸出的胸骨骨髓獲得骨髓(bm)粘附細(xì)胞。將骨髓吸出物以hank’s平衡鹽溶液(hbss；gibcobrl/invitrogen，gaithersburgmd)稀釋三倍并進(jìn)行ficoll-hypaque(robbinsscientificcorp.sunnyvale，ca)密度梯度離心。之后，收集骨髓單核細(xì)胞(<1.077gm/cm3)，在hbss中洗滌三次并重懸于生長(zhǎng)培養(yǎng)基[添加了10％fcs(gibcobrl)、10-4m巰基乙醇(merck,whitehousestation,nj)、青霉素-鏈霉素-制霉菌素混合物(100u/ml:100μg/ml:1.25un/ml；beitha'emek)、2mml-谷氨酰胺(beitha'emek)的dmem(biologicalindustries,beitha'emek,israel)]。在組織培養(yǎng)瓶中(corning,acton,ma)于37℃(5％co2)分別培養(yǎng)來自各個(gè)供者的細(xì)胞，每周更換培養(yǎng)基。每3-4天用0.25％胰蛋白酶-edta(beitha'emek)分裂細(xì)胞。傳2-40代后，當(dāng)達(dá)到60-80％匯合時(shí)，收集細(xì)胞用于分析或用于在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)。源自胎盤的粘附細(xì)胞-在無菌條件下切下足月分娩胎盤的里面部分(bneizion醫(yī)學(xué)中心，haifa，israel)，以hank’s緩沖液洗滌3次，于37℃與0.1％膠原酶(lmg/ml組織；sigma-aldrich，st.lewis，mo)孵育3小時(shí)。輕輕抽吸，然后用添加了10％fcs、青霉素-鏈霉素-制霉菌素混合物(100u/ml:100μg/ml:1.25un/ml)和2mml-谷氨酰胺的dmem洗滌懸浮的細(xì)胞，接種到75cm2培養(yǎng)瓶中并于37℃在5％co2增濕條件下于組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中孵育。此后使細(xì)胞在塑料表面粘附72小時(shí)，然后每3-4天換一次培養(yǎng)基。當(dāng)達(dá)到60-80％匯合(通常10-12天)時(shí)，用0.25％胰蛋白酶-edta從生長(zhǎng)培養(yǎng)瓶分離細(xì)胞，并接種到新培養(yǎng)瓶中。此后收集培養(yǎng)的細(xì)胞用于分析或用于在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)。源自脂肪組織的粘附細(xì)胞-從吸脂操作的人脂肪組織(rambamhaifa，israel)獲得粘附細(xì)胞。用等體積的pbs徹底洗滌脂肪組織，用膠原酶(20mg/ml)于37℃消化30分鐘。然后用含有10％fcs、青霉素-鏈霉素-制霉菌素混合物(100u/ml:100μg/ml:l.25un/ml)和l-谷氨酰胺的dmem洗滌細(xì)胞，以1200rpm在室溫(rt)下離心10分鐘，用裂解液重懸(1:10；biologicalindustries，beitha'emek，israel，以棄掉紅細(xì)胞)，離心，用含有10％fcs、青霉素-鏈霉素-制霉菌素混合物(100u/ml:100μg/ml:1.25un/ml)和l-谷氨酰胺的dmem重懸。然后以3-10x107個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)瓶將洗滌過的細(xì)胞接種到無菌組織培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。第二天用pbs洗滌細(xì)胞以除掉殘留的rbc和死細(xì)胞。于37℃在5％co2增濕條件下于組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中保持細(xì)胞。每3-4天更換培養(yǎng)基。在60-80％匯合時(shí)，用0.25％胰蛋白酶-edta從生長(zhǎng)培養(yǎng)瓶分離細(xì)胞，并接種到新培養(yǎng)瓶中。傳2-40代后，當(dāng)達(dá)到60-80％匯合時(shí)，收集細(xì)胞用于分析或用于在生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)。plurixtm活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器-用由非編織纖維聚酯基質(zhì)構(gòu)成的1-100ml填充的3dporrosive載體(直徑4mm)裝載plurixtm活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器(pluristem，haifa，israel；如圖1g所述，也參見美國專利第6,911,201號(hào))。這些載體使得可在相對(duì)小的體積內(nèi)繁殖大量細(xì)胞數(shù)。玻璃器皿由pluristem(pluristem,haifa,israel)設(shè)計(jì)并制造。生物反應(yīng)器保持于37℃培養(yǎng)箱中，且由閥門(圖1g中的6a)和蠕動(dòng)泵(圖1g中的9)調(diào)節(jié)并監(jiān)測(cè)流速。生物反應(yīng)器包含取樣和注射點(diǎn)(圖1g中的4)，使得可連續(xù)接種細(xì)胞。從庫(圖1g中的1)中供給ph6.7-7.4的培養(yǎng)基。向該庫供給含有不同比例的空氣/co2/o2(由生物反應(yīng)器中的細(xì)胞密度而定)的已過濾氣體混合物(圖1g中的2、3)。o2的比例適合生物反應(yīng)器出口的溶o2水平，其由監(jiān)測(cè)器(圖1g中的6)測(cè)定。經(jīng)由硅酮管或擴(kuò)散器(deganiabet，emekhayarden，israel)將氣體混合物提供給所述庫。培養(yǎng)基流經(jīng)能夠收集循環(huán)中的非粘附細(xì)胞的分離容器(圖1g中的7)。通過蠕動(dòng)泵(圖1g中的9)使得培養(yǎng)基循環(huán)。生物反應(yīng)器進(jìn)一步配有附加的取樣點(diǎn)(圖1g中的10)和用于連續(xù)交換培養(yǎng)基的容器。生產(chǎn)3d-粘附細(xì)胞-用胰蛋白酶處理按上文所述培養(yǎng)的非匯合原代人粘附2d細(xì)胞培養(yǎng)物，洗滌，重懸在添加了10％fbs、青霉素-鏈霉素-制霉菌素混合物(100u/ml:100ug/ml:1.25un/ml)和2mml-谷氨酰胺的dmem中，經(jīng)由注射點(diǎn)接種(103-105個(gè)細(xì)胞/ml)到無菌活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器(參見圖1g)中的3d載體上。接種前將pbs-ca-mg(biologicalindustries，beitha'emek，israel)填入生物反應(yīng)器，高壓滅菌(120℃，30分鐘)，用含有10％熱滅活的胎牛血清和青霉素-鏈霉素-制霉菌素混合物(100u/ml:100ug/ml:1.25un/ml)的dulbecco’s生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌。流速保持在0.1-5ml/分鐘。接種過程涉及停止循環(huán)2-48小時(shí)，藉此使得細(xì)胞沉積到載體上。生物反應(yīng)器保持在受控的溫度(37℃)和ph條件(ph＝6.7-7.4)下；根據(jù)需要使用供給無菌空氣和co2的培養(yǎng)箱。每周置換2-3次生長(zhǎng)培養(yǎng)基。用新鮮的dmem培養(yǎng)基每4小時(shí)至7天替換循環(huán)培養(yǎng)基。在密度為1x106-1x107個(gè)細(xì)胞/ml(生長(zhǎng)后12-40天)時(shí)，從生物反應(yīng)器去除總培養(yǎng)基體積，用pbs將生物反應(yīng)器和載體洗滌3-5次。然后用胰蛋白酶-edta從載體分離3d-粘附細(xì)胞；(biologicalindustries，beitha'emek，israel；輕輕振蕩3-15分鐘，1-5次)，此后重懸于dmem并冷凍保藏。3d-粘附細(xì)胞質(zhì)量生物學(xué)測(cè)定-解凍并計(jì)數(shù)冷凍保藏的3d-粘附細(xì)胞。為評(píng)估細(xì)胞生存力，將2x105個(gè)細(xì)胞接種到150cm2的組織培養(yǎng)培養(yǎng)瓶中，在接種后7天內(nèi)評(píng)估其粘附能力和再增殖。此后用熒光單克隆抗體流式細(xì)胞儀(beckmancoulter，fullerton，ca)分析3d-粘附細(xì)胞膜標(biāo)記表型。用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定法比較3d和2d培養(yǎng)的粘附細(xì)胞的細(xì)胞膜標(biāo)記概況。將來自2d培養(yǎng)物和3d流動(dòng)系統(tǒng)培養(yǎng)物中的100,000-200,000個(gè)粘附細(xì)胞懸浮于5ml試管中的0.1ml培養(yǎng)基中，與飽和濃度的下述各mab孵育(4℃，30分鐘，暗環(huán)境)：fitc-綴合的抗人cd90(chemiconinternational公司，temecula，ca)、pe綴合的抗人cd73(bactlabdiagnostic，ceasarea，israel)、pe綴合的抗人cd105(ebioscience，sandiego，ca)、fitc綴合的抗人cd29(ebioscience，sandiego，ca)、cy7-pe綴合的抗人cd45(ebiosience)、pe綴合的抗人cd19(iqproducts，groningen，thenetherlands)、pe綴合的抗人cd14mab(iqproducts)、fitc綴合的抗人cd11b(iqproducts)和pe綴合的抗人cd34(iqproducts)或fitc綴合的抗人hla-drmab(iqproducts)。孵育后在包含1％熱滅活的fcs的冰冷pbs中洗滌細(xì)胞兩次，重懸于500μl0.5％甲醛中，用fc-500流式細(xì)胞儀(beckmancoulter，fullerton，ca)分析。用質(zhì)譜分析比較3d和2d培養(yǎng)的粘附細(xì)胞的蛋白概況。如上所述從胎盤生產(chǎn)源自2d和3d培養(yǎng)程序的粘附細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，通過在增濕5％co2氣氛下于37℃在175cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)0.3-0.75x106個(gè)細(xì)胞4天直至達(dá)到60-80％匯合來生產(chǎn)2d培養(yǎng)物。通過在含有2000個(gè)載體的生物反應(yīng)器中接種2-10x106個(gè)細(xì)胞/克并培養(yǎng)18天來生產(chǎn)3d培養(yǎng)物。收獲后洗滌細(xì)胞(x3)以去除所有血清，沉淀并冷凍。根據(jù)廠商的方案，從沉淀物分離蛋白質(zhì)[使用tri試劑盒(sigma,saintlouis,usa)，用胰蛋白酶消化并用itraq試劑標(biāo)記(appliedbiosciences，fostercity，ca)]。簡(jiǎn)言之，itraq試劑為非多聚體的同量異序標(biāo)記試劑。用四種同量異序的同位素編碼標(biāo)記中的一種經(jīng)由其n末端和/或賴氨酸側(cè)鏈標(biāo)記每一樣品中的肽。混合四個(gè)經(jīng)標(biāo)記的樣品，用質(zhì)譜法分析肽。肽片段化后，每種標(biāo)記釋放獨(dú)特的質(zhì)量報(bào)告離子，因此，四種報(bào)告離子的比值給出樣品中特定肽的相對(duì)豐度(信息見：http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/00113379.pdf)在smoler蛋白質(zhì)組中心(departmentofbiology，technion，haifa，israel)用lc-ms/ms在qtof-premier(waters,sanfrancisco，ca)上進(jìn)行源自胎盤的粘附細(xì)胞的2d培養(yǎng)物對(duì)3d培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)組分析，且通過pep-miner軟件[beer，i.等，proteomics，4，950-60(2004)]針對(duì)nr數(shù)據(jù)庫的人類部分進(jìn)行鑒定和分析。被分析的蛋白質(zhì)有：異質(zhì)細(xì)胞核核糖核蛋白h1(hnrph1，genebank登錄號(hào)np_005511)、h2a組蛋白家族(h2af，genebank登錄號(hào)np_034566.1)、真核細(xì)胞翻譯延伸因子2(eeef2，genebank登錄號(hào)np_031933.1)、網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白3、ef-手鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域(rcn2，genebank登錄號(hào)np_065701)、cd44抗原同種型2前體(genebank登錄號(hào)np_001001389)、鈣調(diào)理蛋白1堿性平滑肌(cnn1，genebank登錄號(hào)np_001290)、3磷酸腺苷5磷酸硫酸合酶2同種型a(papss2，genebank登錄號(hào)np_004661)、核糖體蛋白l7a(rpl7a，genebank登錄號(hào)np_000963)和醛脫氫酶x(aldhx，genebank登錄號(hào)p47738)。每一實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2次。因?yàn)榉治龅奶匦裕恳坏鞍踪|(zhì)按照出現(xiàn)在樣品中的肽數(shù)目來分析(在每一次分析中蛋白質(zhì)出現(xiàn)2-20次)。用elisa比較3d和2d培養(yǎng)的粘附細(xì)胞中分泌的蛋白質(zhì)-如上所述生產(chǎn)來自胎盤的源自2d和3d培養(yǎng)操作的粘附細(xì)胞，且3d培養(yǎng)持續(xù)24天。此后收集條件培養(yǎng)基，在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，用elisa(r&d系統(tǒng)，minneapolis，mn)對(duì)flt-3配體、il-6、促血小板生成素(tpo)和干細(xì)胞因子(scf)進(jìn)行分析。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為1x106個(gè)細(xì)胞/ml。成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基-通過在由添加了10％fcs、100nm地塞米松、0.05mm抗壞血酸2-磷酸鹽、10mmb-甘油磷酸鹽的dmem組成的成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞3周來評(píng)估成骨細(xì)胞分化。由alizzarinreds染色顯示鈣化基質(zhì)，由堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒(所有試劑來自sigma-aldrich，st.lewis，mo)檢測(cè)堿性磷酸酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果plurixtm生物反應(yīng)器系統(tǒng)創(chuàng)造了生理樣微環(huán)境為了給粘附細(xì)胞提供有效的培養(yǎng)條件，用plurix生物反應(yīng)器(pluristem，haifa，israel；載體闡明于圖1g，在接種前顯示于圖1b中)人工創(chuàng)造生理樣環(huán)境(圖1a中所述)。如圖1c-f所示，骨髓產(chǎn)生的3d-粘附細(xì)胞在3d基質(zhì)上在接種后20天(圖1b-c，分別放大x150和250)和40天(圖1c-d，分別放大x350和500)成功培養(yǎng)并擴(kuò)增。生長(zhǎng)在plurix生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的細(xì)胞被顯著擴(kuò)增-不同生產(chǎn)批次的源自胎盤的3d-粘附細(xì)胞在plurix生物反應(yīng)器系統(tǒng)中生長(zhǎng)。接種密度為13，300個(gè)細(xì)胞/載體(至總量為2x106個(gè)細(xì)胞)。接種14天后，細(xì)胞密度增加至15倍，達(dá)到約200,000個(gè)細(xì)胞/載體(圖2)，或150個(gè)載體的生物反應(yīng)器中30x106個(gè)。在不同的實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞以1.5x104個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種到生物反應(yīng)器中，接種30天后，載體含有超過50倍的細(xì)胞數(shù)量，即約0.5x106個(gè)細(xì)胞/載體或0.5x107個(gè)細(xì)胞/ml。在各種水平生長(zhǎng)柱的載體上的細(xì)胞密度一致，說明氧和營(yíng)養(yǎng)素均一傳遞到細(xì)胞。由此證明3d培養(yǎng)系統(tǒng)為高密度間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和長(zhǎng)期維持提供支持條件，所述細(xì)胞培養(yǎng)物可以有效生長(zhǎng)到足以用于支持移入和成功移植目的的量。3d-粘附細(xì)胞顯示獨(dú)特的膜標(biāo)記特征-為了確定可溶性分子的分泌概況及蛋白質(zhì)產(chǎn)生(通過模擬骨環(huán)境的3d培養(yǎng)操作來實(shí)施)的差異，進(jìn)行了fac分析。如圖3a所示，細(xì)胞標(biāo)記的facs分析描述的是，3d-粘附細(xì)胞表現(xiàn)出與在2d條件中生長(zhǎng)的粘附細(xì)胞不同的標(biāo)記表達(dá)型式。與3d培養(yǎng)的細(xì)胞相比，2d培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)顯著更高水平的陽性膜標(biāo)記cd90、cd105、cd73和cd29膜標(biāo)記。例如，3d培養(yǎng)的細(xì)胞顯示56％的cd105表達(dá)，對(duì)比2d培養(yǎng)的細(xì)胞為87％。2d和3d二者胎盤培養(yǎng)物的粘附細(xì)胞都不表達(dá)任何造血膜標(biāo)記(圖3b)。3d-粘附細(xì)胞顯示獨(dú)特的可溶性因子概況-造血龕(niche)包括產(chǎn)生豐富細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的支持細(xì)胞。為了進(jìn)一步確定2d和3d培養(yǎng)的粘附細(xì)胞之間的差異，通過elisa得到2d和3d粘附細(xì)胞培養(yǎng)物條件培養(yǎng)基中四種主要的造血分泌蛋白的概況。圖4a-c顯示生長(zhǎng)在3d條件的細(xì)胞產(chǎn)生含更高水平的flt-3配體(圖4a)、il-60(圖4b)和scf(圖4c)的條件培養(yǎng)基，而在2d培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基中檢測(cè)到較低水平的il-6和接近零水平的flt-3配體和scf。在兩種培養(yǎng)物中促血小板生成素(tpo)產(chǎn)量都很低并相等。3d-粘附細(xì)胞在質(zhì)譜分析中顯示獨(dú)特的蛋白概況-為了進(jìn)一步確定2d和3d培養(yǎng)的粘附細(xì)胞之間的差異，用質(zhì)譜分析這些細(xì)胞的蛋白概況。圖4d顯示2d和3d培養(yǎng)的粘附細(xì)胞表現(xiàn)出明顯不同的蛋白質(zhì)表達(dá)概況。如下表1所示，3d培養(yǎng)的細(xì)胞顯示出更高的h2af和aldhx表達(dá)水平(分別為超過9和12倍)和更高的eeef2、rcn2和cnn1蛋白水平(分別為約3、2.5和2倍)。另外，3d培養(yǎng)的細(xì)胞顯示約一半的蛋白hnrphl和cd44抗原同種型2前體表達(dá)水平和約三分之一的papss2和rpl7a表達(dá)水平。表13d-粘附細(xì)胞具有分化為成骨細(xì)胞的能力-為了進(jìn)一步表征3d-粘附細(xì)胞，在成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基中將細(xì)胞培養(yǎng)3周。此后實(shí)施鈣沉淀。分化的細(xì)胞顯示產(chǎn)生了鈣(圖5a-b中的紅色所描述)，而對(duì)照細(xì)胞維持成纖維細(xì)胞樣表型并表明沒有礦化(圖5c-d)。這些結(jié)果表明源自胎盤的3d-粘附細(xì)胞具有體外分化為成骨細(xì)胞的能力。實(shí)施例2源自胎盤的3d-粘附細(xì)胞改善hsc移入的能力評(píng)估通過在經(jīng)亞致死輻射或化療預(yù)處理的免疫缺陷nod-scid小鼠中檢測(cè)人造血細(xì)胞(hcd45+)水平，來評(píng)估3d-粘附細(xì)胞的支持hsc移入。材料和實(shí)驗(yàn)方法分離cd34+細(xì)胞-在分娩期間于無菌條件下取臍帶血樣品(bneizionmedicalcenter,haifa,israel)，用lymphoprep(axis-shieldpocas,oslo，norway)密度梯度離心分級(jí)分離單核細(xì)胞并冷凍保存。洗滌解凍的單核細(xì)胞并用抗cd34抗體孵育，用midimacs(miltenylbiotech，bergishgladbach，germany)分離。將來自一個(gè)以上樣品的細(xì)胞合并達(dá)到所需的量(50,000-100,000個(gè)細(xì)胞)。在經(jīng)輻射小鼠中檢測(cè)移植的細(xì)胞-在無菌開放系統(tǒng)籠中飼養(yǎng)7周齡雄性和雌性nod-scid小鼠(nod-cb17-prkdcscid/j；harlan/weizmanninst.，rehovotisrael)，給予無菌飲食和高壓滅菌的酸性水。亞致死(350cgy)輻射小鼠，此后(輻射后48小時(shí))通過靜脈注射至尾靜脈，移植50,000-100,000個(gè)hcd34+細(xì)胞，加上或不加另外的源自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞(0.5x106-1x106)(每組3-7只小鼠)。移植4-6周后，脫臼處死小鼠，用facs緩沖液(50mlpbs，5mlfbs，0.5ml5％疊氮化鈉)從大腿骨和脛骨兩處沖洗收集bm。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠bm中的人細(xì)胞，通過將細(xì)胞與抗人cd45-fitc(iqproducts，groningen，thenetherlands)孵育，得到在處理的nod-scid小鼠中表達(dá)人和鼠cd45造血細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞百分比。明確的人移入最低閥值指定為0.5％。化療處理的小鼠中移植細(xì)胞的檢測(cè)-如上文對(duì)輻射小鼠所述飼養(yǎng)的6.5周齡雄性nod-scid小鼠(nod.cb17/jhkihsd-scid；harlan，rehovotisrael)接受白消安(25mg/kg-連續(xù)2天)腹膜內(nèi)注射。第二次注射白消安兩天后，單用cd34+細(xì)胞或與從胎盤產(chǎn)生的0.5x106個(gè)粘附細(xì)胞一起注射小鼠。移植后3.5周，處死小鼠，如上文對(duì)輻射小鼠所述測(cè)定人造血細(xì)胞的存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果3d-粘附細(xì)胞改善輻射小鼠中hsc移入-在經(jīng)輻射nod-scid小鼠中共同移植人cd34+造血細(xì)胞和源自胎盤或脂肪組織的3d-粘附細(xì)胞。在共同移植后4周評(píng)估移入效率，并與單用hsc移植的小鼠比較。如表2所示，與單用ucbcd34+細(xì)胞處理的小鼠比較，3d-粘附細(xì)胞和ucbcd34+細(xì)胞共同移植導(dǎo)致顯著更高的移入率及更高水平的受者小鼠bm中的人細(xì)胞。表23d-粘附細(xì)胞改善化療小鼠的hsc移入-將人cd34+造血細(xì)胞與源自胎盤的500,000-2d-粘附細(xì)胞或3d-粘附細(xì)胞共同移植到經(jīng)化療預(yù)處理的nod-scid小鼠中。在共同移植之后3.5周評(píng)估移入效率，并與單用hsc移植的小鼠比較。如表3和圖6所示，與單用ucbcd34+細(xì)胞相比，粘附細(xì)胞和ucbcd34+細(xì)胞共同移植導(dǎo)致受者小鼠bm中的移入水平更高。此外，如表3所示，用在plurix生物反應(yīng)器系統(tǒng)中生長(zhǎng)的源自胎盤的粘附細(xì)胞(3d-粘附細(xì)胞)共同移植的小鼠，比在常規(guī)靜態(tài)2d培養(yǎng)條件(培養(yǎng)瓶)中生長(zhǎng)的來自同樣供者的細(xì)胞共同移植的小鼠的平均移入水平更高。表3移植的細(xì)胞平均h-cd45stdevcd340.91.1cd34+來自胎盤的常規(guī)2d培養(yǎng)物3.50.2cd34+來自胎盤的3d-粘附細(xì)胞6.07.9圖7a-b中所示的facs分析結(jié)果證明粘附細(xì)胞與hhsc(圖7b)共同移植的優(yōu)勢(shì)，以及在hsc移植后粘附細(xì)胞改善造血系統(tǒng)恢復(fù)的能力。這些結(jié)果綜合起來表明，粘附細(xì)胞可在hsc移植(自體或同種異體)之后作為支持細(xì)胞改善造血恢復(fù)。3d-粘附細(xì)胞在hsc移植之后提高造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞移入的能力可能來自3d-粘附細(xì)胞分泌可改善移植細(xì)胞的歸巢、自我更新和增殖能力的支持hsc的細(xì)胞因子的能力，或來自那些細(xì)胞重建可移植的hsc歸巢和增殖所需的受損造血微環(huán)境的能力。實(shí)施例3通過2d和3d培養(yǎng)的粘附細(xì)胞抑制淋巴細(xì)胞應(yīng)答在mlr分析中發(fā)現(xiàn)粘附細(xì)胞尤其是3d-粘附細(xì)胞抑制人類臍帶血單核細(xì)胞的免疫反應(yīng)。材料和實(shí)驗(yàn)方法混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mlr)測(cè)定法-通過mlr測(cè)定法測(cè)定源自2d和3d培養(yǎng)方法的從胎盤產(chǎn)生的粘附細(xì)胞的免疫抑制和免疫赦免特性，mlr測(cè)定法測(cè)量位于hla基因座的組織相容性，根據(jù)在應(yīng)答細(xì)胞(增殖)和刺激細(xì)胞(非增殖)的混合培養(yǎng)中不相容淋巴細(xì)胞的增殖率來實(shí)現(xiàn)。使用人臍帶血(cb)單核細(xì)胞(2x105)作為應(yīng)答細(xì)胞，其通過與等量(105)經(jīng)輻射(3000rad)的源自人外周血單核細(xì)胞(pbmc)、或者與2d或3d培養(yǎng)的由胎盤產(chǎn)生的粘附細(xì)胞或粘附細(xì)胞和pbmc組合的共同培養(yǎng)來刺激。每一測(cè)定重復(fù)三次。細(xì)胞在96-孔板中的rpmi1640培養(yǎng)基(含20％fbs在增濕的5％co2氣氛下于37℃)中共同培養(yǎng)4天。在培養(yǎng)的最后18小時(shí)用1μc3h-胸苷脈沖該板。然后經(jīng)玻璃纖維濾器收集細(xì)胞，用閃爍計(jì)數(shù)器定量胸苷吸收。實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖8a顯示cb細(xì)胞的免疫應(yīng)答，如當(dāng)用pbmc刺激時(shí)這些細(xì)胞的增殖增加所表現(xiàn)，在不受任何理論的束縛下這很可能與響應(yīng)hla不相容性的t細(xì)胞增殖有關(guān)。然而，當(dāng)與本發(fā)明粘附細(xì)胞孵育時(shí)，這些細(xì)胞顯示出顯著更低的免疫應(yīng)答水平。此外，當(dāng)與這些粘附細(xì)胞共同孵育時(shí)，cb對(duì)pbmc的免疫應(yīng)答基本降低了。因此，以與msc相似的方式，發(fā)現(xiàn)粘附細(xì)胞具有潛在的降低供者細(xì)胞的t細(xì)胞增殖(典型的是gvhd)的能力。盡管2d和3d兩種培養(yǎng)物都降低了淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答，但與上文所述的3d-粘附細(xì)胞的其它優(yōu)點(diǎn)一致，3d粘附細(xì)胞的免疫抑制更強(qiáng)。實(shí)施例4比較plurix生產(chǎn)的3d粘附細(xì)胞和celligen生產(chǎn)的粘附細(xì)胞為了提供大規(guī)模的3d粘附細(xì)胞，應(yīng)用一種在本文中稱作celligen的新生產(chǎn)系統(tǒng)。材料和實(shí)驗(yàn)方法plurixtm活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器-如上文實(shí)施例1中所述。由plurix生產(chǎn)3d-粘附細(xì)胞(plx細(xì)胞)-如上文實(shí)施例1中所述。celligentm活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器-celligentm生產(chǎn)粘附細(xì)胞(plx-c細(xì)胞)由圖8b顯示的若干主要步驟組成。該方法起始于從有計(jì)劃的足月剖腹產(chǎn)收集胎盤。然后從完整胎盤分離粘附細(xì)胞，使生長(zhǎng)在組織培養(yǎng)瓶(2d)中，收獲并作為2d-細(xì)胞原種(2dcs)保存在液氮中，解凍適量的2dcs，洗滌并接種至生物反應(yīng)器中的載體上以進(jìn)一步擴(kuò)增為3d-培養(yǎng)物。在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)1-3周后，收獲細(xì)胞并作為plx-c冷凍保存在液氮的氣相中。人組織的接收所有獲得的胎盤均在該醫(yī)療機(jī)構(gòu)的赫爾辛基委員會(huì)的準(zhǔn)許下獲自產(chǎn)科病房。因此，所有的胎盤供者簽署了知情同意書并進(jìn)行供者篩選和供者檢測(cè)(ipc1)。從供者取得胎盤(在剖腹產(chǎn)操作中)后立即將其置于無菌塑料袋中，然后置于有冰袋的styrofoam盒中。運(yùn)送胎盤并立即置于隔離區(qū)直到質(zhì)量控制(qc)和質(zhì)量保證(qa)放行使用。所有之后的生產(chǎn)步驟均在隔離的潔凈室設(shè)備中進(jìn)行直到支原體檢測(cè)結(jié)果的qc批準(zhǔn)到達(dá)，然后放行細(xì)胞用于2d細(xì)胞生長(zhǎng)。粘附細(xì)胞的回收和加工為了開始該過程，在層流通風(fēng)櫥下于無菌條件下將完整的胎盤切碎，以hank’s緩沖液洗滌并于37℃與0.1％膠原酶(1mg膠原酶/ml組織)孵育3小時(shí)。加入2d細(xì)胞培養(yǎng)基(包含添加了10％fbs、0.25μg/ml兩性霉素b和50μg/ml慶大霉素的dmem的2d-培養(yǎng)基)并將被消化的組織粗略地濾過無菌金屬濾網(wǎng)，收集在無菌燒杯中并離心(10分鐘,1200rpm,4℃)。然后輕輕抽吸，用添加了抗生素的2d-培養(yǎng)基洗滌懸浮的細(xì)胞，接種在80cm2培養(yǎng)瓶中并在組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中于補(bǔ)充了5％co2增濕條件下37℃孵育。2-3天后，細(xì)胞粘附至培養(yǎng)瓶表面，用pbs將它們洗滌并加入2d-培養(yǎng)基。二維(2d)細(xì)胞生長(zhǎng)在第一次傳代前，將隔離中的10％總培養(yǎng)瓶數(shù)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基樣品合并并進(jìn)行支原體檢測(cè)(ipc2)。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的支原體(ez-pcr支原體試劑盒,biologicalindustries,israel)為陰性，將細(xì)胞從隔離區(qū)放行。繼續(xù)傳代1-2次后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2d生產(chǎn)潔凈室(2dp)中。一旦進(jìn)入2dp室，細(xì)胞繼續(xù)傳代3-5代。第四次傳代后取ipc-3樣品用于免疫表型檢測(cè)。在整個(gè)過程中，培養(yǎng)物在組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中于5％co2增濕條件下37℃生長(zhǎng)于不含抗生素的2d培養(yǎng)基中。總共傳代6-8代(9-16次細(xì)胞倍增)后，收集細(xì)胞并作為2d-細(xì)胞原種(2dcs)冷凍保存。通常在10-15天后進(jìn)行第一次傳代。從第2代開始持續(xù)至6-8代，通常在3-5天后(1.5-2次倍增)當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到70-80％匯合時(shí)將細(xì)胞傳代。用0.25％胰蛋白酶-edta(37℃，4分鐘)從培養(yǎng)瓶分離細(xì)胞并以3±0.2x103個(gè)細(xì)胞/cm2的培養(yǎng)物密度接種。組織培養(yǎng)瓶的大小隨著傳代進(jìn)行而增大。培養(yǎng)過程起始于80cm2的組織培養(yǎng)瓶，接著在175cm2的培養(yǎng)瓶中，然后在500cm2的培養(yǎng)瓶中(triple瓶)，最后將細(xì)胞接種至cellfactory10盤(6320cm2)中。在冷凍保存之前，在2dcs生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)，收集生長(zhǎng)培養(yǎng)基并制備樣品送至用于支原體檢測(cè)(ipc4)經(jīng)認(rèn)證的glp實(shí)驗(yàn)室。2d-細(xì)胞-原種產(chǎn)品的冷凍保存操作對(duì)于2dcs冷凍保存，在無菌條件下用0.25％胰蛋白酶-edta收集2d-培養(yǎng)的細(xì)胞。將細(xì)胞離心(1200rpm,10’,4℃)、計(jì)數(shù)并重懸于2d培養(yǎng)基中。對(duì)于冷凍，用2d-冷凍混合物(終濃度為10％dmso、40％fbs和50％2d-培養(yǎng)基)1:1稀釋細(xì)胞懸液。從一只胎盤生產(chǎn)約1.5-2.5x109個(gè)細(xì)胞。將4ml細(xì)胞以終濃度10x106/ml保存在5ml冷凍保存聚丙烯管形瓶中。將管形瓶標(biāo)記并轉(zhuǎn)移至具有可控速率的冰箱中進(jìn)行逐漸溫度降低過程(1℃/min)，之后將它們轉(zhuǎn)移以保存在位于冷凍保存室的液氮冰箱的氣相中。將這一材料稱作2d-細(xì)胞原種(2dcs)批次。開始三維(3d)培養(yǎng)操作為了開始3d培養(yǎng)，在2dp室中從2dcs解凍適量(150±30x106)的細(xì)胞并用3d培養(yǎng)基(含10％fbs和20mmhepes的dmem)洗滌以在接種到預(yù)先準(zhǔn)備的生物反應(yīng)器系統(tǒng)之前去除dmso。吸出各2dcs管形瓶的內(nèi)容物并用預(yù)溫的(37℃)3d培養(yǎng)基1：9稀釋。將細(xì)胞離心(1200rpm,10’,4℃)并再次重懸于250ml無菌瓶中的50-100ml預(yù)溫的(37℃)3d培養(yǎng)基中。取樣并用trypanblue染液計(jì)數(shù)細(xì)胞以測(cè)定細(xì)胞數(shù)量和生存力。在層流通風(fēng)櫥中將將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至0.5l的接種瓶中。通過重力作用經(jīng)無菌管道將細(xì)胞懸液從接種瓶轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)物器中。celligen生物反應(yīng)器(plx-c)中3d粘附細(xì)胞的生產(chǎn)生物反應(yīng)器描述使用圖8c描繪的自動(dòng)celligen或bioflo310生物反應(yīng)器系統(tǒng)[(newbrunswickscientific(nbs)]進(jìn)行3d生長(zhǎng)期。該生物反應(yīng)器系統(tǒng)用于培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物，其中的條件適于高細(xì)胞濃度。使用灌注模式的生物反應(yīng)器實(shí)施培養(yǎng)過程。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生物反應(yīng)器由兩個(gè)主要的系統(tǒng)構(gòu)成-控制系統(tǒng)和生物反應(yīng)器自身(罐和附件)。該過程的參數(shù)由控制臺(tái)監(jiān)測(cè)和控制，該控制臺(tái)包括探針、發(fā)動(dòng)機(jī)和泵的接插件，用于溶氧(do)、ph、灌注和振蕩(有發(fā)動(dòng)機(jī))的控制回路，氣體控制系統(tǒng)、水循環(huán)和用于溫度控制的加熱系統(tǒng)以及操作界面。受控的過程參數(shù)(例如溫度、ph、do等)可顯示在操作界面上并由指定的控制器監(jiān)測(cè)。生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)操作如上文部分提到的，從冷凍保存的2dcs解凍150±30x106個(gè)細(xì)胞，洗滌并接種至無菌生物反應(yīng)器中。該生物反應(yīng)器包含30-50gr由聚酯和聚丙烯制成的載體(disks,nbs)和1.5±0.1l3d培養(yǎng)基。將生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基保持在以下條件：37℃、70％溶氧(do)和ph7.3。根據(jù)控制系統(tǒng)所測(cè)定供給經(jīng)過濾的氣體(空氣、co2、n2和o2)以保持do值為70％且ph值為7.3。對(duì)于起始的24小時(shí)，以50轉(zhuǎn)每分(rpm)振蕩培養(yǎng)基并在第2天增加到200rpm。在開始的2-3天，使細(xì)胞以批模式生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基的葡萄糖濃度減少至低于550mg/升時(shí)開始灌注。使用無菌硅酮管道將培養(yǎng)基從給料容器泵到生物反應(yīng)器中。在層流下使用無菌接頭進(jìn)行所有的管道連接。每天調(diào)節(jié)灌注以保持葡萄糖濃度恒定為約550±50mg\升。每1-2天取樣生長(zhǎng)培養(yǎng)基用于葡萄糖、乳酸鹽、谷氨酰胺、谷氨酸和銨濃度測(cè)定(bioprofile400分析儀,novabiomedical)。細(xì)胞培養(yǎng)物的葡萄糖消耗速率和乳酸鹽形成速率使得可以測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)速率。這些參數(shù)用于根據(jù)累積的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定收獲時(shí)間。從生物反應(yīng)器收獲3d生長(zhǎng)的plx-x細(xì)胞在生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)(4-10天)開始細(xì)胞收獲過程。收集兩個(gè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的樣品。制備一個(gè)樣品并送至經(jīng)認(rèn)證的glp實(shí)驗(yàn)室根據(jù)usp和eu標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行支原體檢測(cè)，將另一個(gè)樣品轉(zhuǎn)移到可控速度的冰箱中進(jìn)行逐漸溫度降低過程(1℃/分鐘)，之后將它們轉(zhuǎn)移以保存在位于冷凍保存室的液氮冰箱的氣相中，以備需要重復(fù)支原體檢測(cè)。這些培養(yǎng)基樣品被認(rèn)為是終產(chǎn)品支原體檢測(cè)的一部分且結(jié)果被認(rèn)為是產(chǎn)品放行標(biāo)準(zhǔn)的一部分。在3dp室中如下將3d生長(zhǎng)的培養(yǎng)物收獲到class-100層流區(qū)中：利用重力作用經(jīng)管道將生物反應(yīng)器罐排空至廢物容器中。通過移除頂板打開罐，使用無菌鑷子將載體從籃無菌轉(zhuǎn)移到上部籃網(wǎng)(見圖8c)。然后關(guān)閉生物反應(yīng)器罐并再填入1.5l預(yù)溫的pbs(37℃)。將振蕩速度增加至150rpm并持續(xù)2分鐘。通過壓力或重力經(jīng)管道排出pbs至廢物瓶中。洗滌操作重復(fù)兩次。為了將細(xì)胞從載體釋放，向生物反應(yīng)器罐中加入1.5l預(yù)溫至37℃的胰蛋白酶edta(0.25％胰蛋白酶,edta1mm)并將載體于37℃、150rpm振蕩5分鐘。將細(xì)胞懸液收集至包含250mlfbs的5l無菌容器中。將細(xì)胞懸液分至4個(gè)500ml的無菌離心管中并取出支原體檢測(cè)樣品。將蓋住的離心管經(jīng)3dpactivepass-through轉(zhuǎn)移至10,000級(jí)灌裝間(fr1)，在那里將細(xì)胞無菌灌裝并冷凍保存為plx-c。細(xì)胞周期分析-用70％etoho.n將通過celligen獲得的plx-c細(xì)胞和通過plurix獲得的plx細(xì)胞固定，離心并重懸于包含2μg/mlpi(sigma)、0.2mg/mlrnasea(sigma)和0.1％(v/v)triton(sigma)的碘化丙錠(pi)溶液中并持續(xù)30分鐘。通過facs分析細(xì)胞周期。基因表達(dá)陣列(微陣列)-粘附細(xì)胞獲自人足月胎盤并通過plurix或celligen擴(kuò)增。從各擴(kuò)增方法獲得三個(gè)不同批次的細(xì)胞用于進(jìn)一步檢驗(yàn)。從細(xì)胞提取rna(qiagen-rneasy微量試劑盒)并應(yīng)用至affymetrix完整基因組表達(dá)陣列。芯片使用humanexon1.0st陣列(affymetrix,santaclara,california,usa)。膜標(biāo)記的facs分析-用如之前描述的單克隆抗體染色細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將400,000-600,000個(gè)細(xì)胞懸浮于5ml試管中的0.1ml流式細(xì)胞測(cè)定儀緩沖液中并于室溫(rt)下于暗處與以下各單克隆抗體(mab)溫育15分鐘：fitc-綴合的抗人cd29mab(ebioscience)、pe綴合的抗人cd73mab(bectondickinson)、pe綴合的抗人cd105mab(ebioscience)、pe綴合的抗人cd90mab(bectondickinson)、fitc-綴合的抗人cd45mab(iqproducts)、pe-綴合的抗人cd19mab(iqproducts)、pe綴合的抗人cd14mab(iqproducts)、fitc綴合的抗人hla-drmab(iqproduct)、pe綴合的抗人cd34mab(iqproducts)、fitc綴合的抗人cd31mab(ebioscience)、fitc綴合的抗人kdrmab(r&dsystems)、抗人成纖維細(xì)胞標(biāo)記(d7-fib)mab(acris)、fitc-綴合的抗人cd80mab(bd)、fitc-綴合的抗人cd86mab(bd)、fitc-綴合的抗人cd40mab(bd)、fitc-綴合的抗人hla-abcmab(bd)、fitc綴合的同種型igg1(iqproducts)、pe綴合的同種型igg1(iqproducts)。用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀緩沖液將細(xì)胞洗滌兩遍，重懸于500μl流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀緩沖液中并采用fc-500流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(beckmancoulter)分析。用相關(guān)的同種型熒光分子制備陰性對(duì)照。混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mlr)用等量的經(jīng)輻射(3000rad)的源自pb的mncs(來自供者b)刺激2x105個(gè)源自外周血(pb)的mncs(來自供者a)。向培養(yǎng)物中加入逐漸增加量的plx-c。將各組的三個(gè)重復(fù)接種于96孔板中。將細(xì)胞培養(yǎng)在包含20％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基中。在5天培養(yǎng)的最后18小時(shí)用1μc3h-胸苷脈沖該板。然后經(jīng)玻璃纖維濾器收集細(xì)胞，用閃爍計(jì)數(shù)器定量胸苷吸收。對(duì)于cfse染色，將pb-mnc細(xì)胞染色用于cfse(分子探針)用于培養(yǎng)前的增殖測(cè)量。5天后收集細(xì)胞并通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)cfse染色的密度。elisa如之前所述進(jìn)行elisa。簡(jiǎn)言之，用5μg/mlcona(sigma)、0.5μg/mllps(sigma)或10μg/mlpha(sigma)在plx-c存在下在增濕的5％co2氣氛下于37℃刺激mnc(分離自外周血)。收集上清并用elisa試劑盒進(jìn)行ifnγ(diaclone)、tnfα(diaclone)和il-10(diaclone)的細(xì)胞因子分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與plurix相比，用celligen生產(chǎn)中的變化引起若干主要的差異(總結(jié)于下表4)。表4:plurix系統(tǒng)和celligen系統(tǒng)的比較生產(chǎn)方法的變化導(dǎo)致所得3d粘附細(xì)胞的特性改變。這些差異總結(jié)于下文。與celligen生產(chǎn)的plx-c相比分析plurix生產(chǎn)的plx的細(xì)胞周期-比較通過celligen獲得的plx-c細(xì)胞與通過plurix獲得的plx細(xì)胞以檢測(cè)細(xì)胞在細(xì)胞周期不同期之間的分布。如圖9a-b明確顯示，由celligen擴(kuò)增的plx-c細(xì)胞顯示出典型的增殖概況(細(xì)胞周期不同期的細(xì)胞分布)。具體而言，28％的細(xì)胞在s和g2/m期(圖9a)。這些結(jié)果表明在增殖過程中將細(xì)胞收獲且celligen生物反應(yīng)器條件支持細(xì)胞生長(zhǎng)。plurix和celligen所獲細(xì)胞之間的微陣列比較-基因表達(dá)陣列使得可以同時(shí)監(jiān)測(cè)由plurix(plx)或由celligen(plx-c)擴(kuò)增的衍生自人足月胎盤的粘附細(xì)胞的全基因組表達(dá)概況。這些結(jié)果使可以評(píng)估這些不同的生長(zhǎng)方法獲得細(xì)胞之間表型差異的分子機(jī)制(見下表5)。表5：比較plurix和celligen細(xì)胞中的基因表達(dá)plx-c細(xì)胞上細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)-用單克隆抗體檢測(cè)plx-c表達(dá)的表面抗原。結(jié)果表明plx-c以陽性標(biāo)記：cd73、cd29和cd105以及陰性標(biāo)記：cd34、cd45、cd19、cd14和hla-dr(數(shù)據(jù)未顯示)為特征。免疫表型測(cè)定規(guī)格設(shè)定為所有陽性標(biāo)記≥90％且所有陰性標(biāo)記≤3％。而且，如圖10a-b所示，plx-c培養(yǎng)物不表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)記，如兩個(gè)內(nèi)皮標(biāo)記cd31和kdr的陰性染色所示。然而，成纖維細(xì)胞典型標(biāo)記的plxc表達(dá)是明顯的(d7-fib的表達(dá)，圖10c)。plx-c細(xì)胞的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)-由于plx-c由源自胎盤的粘附細(xì)胞組成，其預(yù)期表達(dá)hlai類分子，這些分子表達(dá)于所有的身體細(xì)胞并且已知誘導(dǎo)同種異體反應(yīng)性免疫應(yīng)答。hlaii類分子和其他共刺激分子典型地僅表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞(apcs)表面。為了檢測(cè)所得plx-c細(xì)胞的免疫原性，在這些細(xì)胞膜的表面進(jìn)行共刺激因子的表達(dá)。facs分析證明plx-c細(xì)胞膜上不存在cd80、cd86和cd40(圖11a-c)。此外，如通過hlaa/b/c染色所示(圖11d)，plx-c表達(dá)低水平的hlai類分子。刺激分子和共刺激分子的表達(dá)類似于源自骨髓的msc(如圖11a-d所示)。為了進(jìn)一步研究plx-c細(xì)胞的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)，進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mlr)檢測(cè)。如圖12a-b所示，如通過胸腺嘧啶摻入測(cè)量，plx-c細(xì)胞逃避同種異體識(shí)別并降低t細(xì)胞應(yīng)答。而且，隨著plx-c細(xì)胞數(shù)量的增加(以劑量依賴方式)淋巴細(xì)胞增殖的減少(通過cpm測(cè)量評(píng)估)更高。plx-c在絲裂原刺激例如concavalina(cona,圖12b)和植物凝集素(pha)以及抗-cd3和抗-cd28(數(shù)據(jù)未顯示)的非特異刺激后也降低淋巴細(xì)胞增殖。為了研究plx-c免疫調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖的作用機(jī)制以及判斷該作用是否由細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用或細(xì)胞因子分泌介導(dǎo)，采用transwell法(其防止細(xì)胞與細(xì)胞的接觸但是允許兩個(gè)區(qū)室之間細(xì)胞因子的擴(kuò)散)用pha刺激源自pb的單核細(xì)胞。結(jié)果顯示甚至當(dāng)抑制了細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸時(shí)仍維持增殖抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。細(xì)胞因子分泌-如上文所述，plx-c很可能通過可溶性因子降低淋巴細(xì)胞的增殖速率。進(jìn)一步研究淋巴細(xì)胞響應(yīng)plx-c分泌的細(xì)胞因子以闡明plx-c的作用機(jī)制。如圖13a-b所述，與plx-c一起培養(yǎng)單核細(xì)胞稍稍減少促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子infγ的分泌并顯著減少tnfα的分泌(甚至在少量plx-c的存在下)。此外，在脂多糖(lps)刺激后，源自pb的mnc的il-10分泌在plx-c存在下增加，而tnfα的分泌水平以劑量依賴方式降低(圖13c)。實(shí)施例5plx-c的生物分布材料和實(shí)驗(yàn)方法用螢光素酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)染plx-c細(xì)胞用表達(dá)在cmv啟動(dòng)子控制下的螢光素酶基因的慢病毒構(gòu)建體(圖14)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染plx-c細(xì)胞。感染病毒的產(chǎn)生轉(zhuǎn)染前使293tn生產(chǎn)細(xì)胞在添加了血清和抗生素的dmem培養(yǎng)基(gibco)中生長(zhǎng)2-3天(50-70％匯合)。將10μg包裝質(zhì)粒和2μg表達(dá)構(gòu)建體以及μlplustm試劑(invitrogen)的混合物加入μl無添加物的dmem中。將混合物與lipofectaminetm(加入μldmem中的30μl稀釋物)在室溫(rt)下孵育15分鐘。將混合物在rt孵育15分鐘。洗滌293tn細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至2％血清培養(yǎng)基并加入轉(zhuǎn)染混合物。將細(xì)胞在co2培養(yǎng)箱中37℃孵育過夜并在感染后24-60小時(shí)收集培養(yǎng)基。48小時(shí)后達(dá)到峰病毒產(chǎn)生。收集培養(yǎng)基，于室溫3000rpm離心5分鐘沉淀細(xì)胞碎片。離心后，將上清濾過millex-hv0.45μmpvdf濾器(millipore,cat.#slhvr25ls)。plx-c的感染病毒感染前24小時(shí)以0.6-1x105個(gè)細(xì)胞每孔的密度將plx-c細(xì)胞接種于24孔板中的完全培養(yǎng)基中。24小時(shí)后，加入0.5ml病毒懸液(以終濃度5-8μg/ml稀釋于含polybrene的完全培養(yǎng)基中)。將細(xì)胞孵育24小時(shí)，然后用完全deme培養(yǎng)基置換培養(yǎng)基并將細(xì)胞于37℃、5％co2孵育過夜。第4天，培養(yǎng)物達(dá)到匯合并1:3至1:5分裂，使細(xì)胞在完全deme中生長(zhǎng)48小時(shí)，然后分析細(xì)胞的螢光素酶表達(dá)。感染的有效率接近100％。用ivislumina成像系統(tǒng)進(jìn)行活細(xì)胞和活體小鼠中的發(fā)光評(píng)估，該系統(tǒng)包括捕獲螢光素酶發(fā)光信號(hào)的高靈敏ccd相機(jī)。感染后兩周，將2x106個(gè)細(xì)胞im或iv注射到scid/beige、nod/scid、scid和balb/c小鼠。用所述ivis系統(tǒng)監(jiān)測(cè)注射的細(xì)胞。試驗(yàn)結(jié)果如從結(jié)果所見，感染后cxl細(xì)胞繼續(xù)分化且生長(zhǎng)細(xì)胞中螢光素酶的表達(dá)水平保持強(qiáng)烈并穩(wěn)定(圖15)。一旦將plx-c細(xì)胞注入balb/c小鼠，檢測(cè)生物分布模式。如從結(jié)果所見，im注射后72小時(shí)細(xì)胞消失(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，plx-c細(xì)胞體外保持多于三周的恒定高水平螢光素酶表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。如圖16a-d所示，im注射到scid/beige免疫缺陷小鼠的細(xì)胞在注射部位保留了多達(dá)5天且之后未觀察到。iv注射到scid/beige小鼠的cxl細(xì)胞24小時(shí)后遷移至肺，然后至注射位點(diǎn)(推測(cè)歸巢至損傷部位)。之后細(xì)胞逐漸消失且3-4周后未觀察到。實(shí)施例6粘附細(xì)胞可體內(nèi)治療肢體缺血為了測(cè)定移植源自胎盤的粘附細(xì)胞是否可以減少缺血損傷并改善臨床和運(yùn)動(dòng)功能，如下采用后肢缺血模型。材料和實(shí)驗(yàn)方法后肢缺血模型-在非免疫缺陷的8-10周齡體重約25g±20％的20只雄性balb/c小鼠中誘導(dǎo)后肢缺血。根據(jù)國立衛(wèi)生研究院(nih)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理評(píng)估及認(rèn)證協(xié)會(huì)(aaalac)進(jìn)行動(dòng)物處理。在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)動(dòng)物。將動(dòng)物飼養(yǎng)在氣候可控的環(huán)境中。溫度范圍在20-24℃之間且相對(duì)濕度(rh)為30-70％之間，12小時(shí)光照和12小時(shí)黑暗循環(huán)。用計(jì)算機(jī)生成的隨機(jī)化程序"researchrandomizer"將動(dòng)物隨機(jī)化并分成2組，每組10只動(dòng)物。一組接受肌肉內(nèi)(im)注射1x106個(gè)源自胎盤的粘附細(xì)胞(plx-c)，另一組作為對(duì)照并注射pbs。手術(shù)操作-在腹股溝區(qū)域的皮膚上行1-1.5cm切口。用6-0絲線將股動(dòng)脈結(jié)扎兩次并切斷結(jié)扎線遠(yuǎn)端。用3-0絲線縫合傷口并使小鼠恢復(fù)。手術(shù)切除一端股動(dòng)脈5小時(shí)后在兩個(gè)給藥位點(diǎn)給小鼠im注射總體積為50μl的1x106個(gè)源自胎盤的粘附細(xì)胞(plx-c)。對(duì)照組動(dòng)物同樣用pbs(gibco)注射，見下表6。表6：在小鼠后肢缺血模型中plx-c的初步研究追蹤觀察-手術(shù)后隨即和手術(shù)后第6、9、14和21天用非接觸激光多普勒儀連續(xù)3次測(cè)量腿兩邊的血流，且表述為缺血肢與正常肢血流的比[tokai.j.等]。缺血嚴(yán)重性的肉眼評(píng)估-用壞死區(qū)域的分級(jí)形態(tài)學(xué)量表在第1、6、9、14、21天肉眼評(píng)估缺血肢直至研究終結(jié)；0級(jí)：無壞死，i級(jí)：僅限于腳趾的壞死(腳趾?jiǎn)适?，ii級(jí)：延伸至足背的壞死(足喪失)；iii級(jí)：延伸至腳的壞死(膝喪失)，iv級(jí)：延伸至大腿的壞死(完全后肢喪失)[tokai.j.等]。體內(nèi)評(píng)估肢體功能和缺血損傷-如下系列進(jìn)行缺血肢受損用途的半定量評(píng)價(jià)：3＝拖足,2＝無拖足但無跖屈,1＝跖屈,以及0＝彎曲腳趾以抵抗對(duì)尾巴的輕微牽引(rutherford等,1997)。分子和生物化學(xué)分析-除了臨床評(píng)估，在第21天獲取分子和生物化學(xué)樣品并進(jìn)行分析以更好地了解引起注射源自胎盤的粘附細(xì)胞(plx-c)組愈合改善的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果移植源自胎盤的粘附細(xì)胞顯著誘導(dǎo)缺血后肢模型的髖和足的血流-為了檢測(cè)粘附細(xì)胞的體內(nèi)功效，將小鼠動(dòng)脈結(jié)扎后肌肉注射源自胎盤的粘附細(xì)胞并在治療后在預(yù)定時(shí)間段使用非接觸激光多普勒儀測(cè)量測(cè)量髖和足(身體兩側(cè))的血流。如圖17所示，注射plx-c顯著改善至受損肢的血流(bf)(如通過血流評(píng)估所測(cè)定)、增強(qiáng)肢體功能、增加毛細(xì)血管密度、減少氧化應(yīng)激和內(nèi)皮損傷。就血流而言，注射后9天驗(yàn)證了該作用并可在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中觀察到。在plx-c處理組中，bf從24±2.3增加至80±4.7％，而在對(duì)照中，載體處理組的bf在35±2至54±4.5％的范圍內(nèi)-在髖/移植區(qū)(分別為第0天對(duì)比第21天)。與髖區(qū)域相似，但是程度更小，plx-c處理小鼠的爪區(qū)域也顯示了bf的增加。因此，在載體處理組中bf從12±0.6增加至46±4.9％，而在plx-c組中bf從10±0.7增加至52±5.5％(分別為第0天對(duì)比第21天)，如圖17所示。粘附細(xì)胞可體內(nèi)改善肢體功能-為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)源自胎盤的粘附細(xì)胞的體內(nèi)作用，用上文材料和實(shí)驗(yàn)方法中描述的評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估被處理小鼠中的肢體功能。如圖18所示，用粘附細(xì)胞處理的小鼠顯示肢體功能的顯著改善(分別為2.5±0.2對(duì)比2.1±0.2對(duì)照對(duì)比plx-c組,注意到處理后第21天的顯著作用)。然而，在21天觀察中的肢體功能的改善程度是可比的，表明在本實(shí)驗(yàn)條件下plx-c未顯示功能恢復(fù)的主要變化。缺血嚴(yán)重性的肉眼評(píng)估揭示了在對(duì)照即載體處理組中，在第6天在兩只動(dòng)物中觀察到限于腳趾的壞死。在plx-c處理組中，僅在14天后僅在一只動(dòng)物中顯示出限于腳趾的壞死。用plx-c處理的肢體的死后免疫組織化學(xué)分析表明供給肢體的新毛細(xì)血管(血管)的數(shù)量顯著增加，表明plx-c具有促進(jìn)血管生成的能力(圖19)。最后，在plx-c處理小鼠中觀察到處理動(dòng)物中氧化應(yīng)激降低和內(nèi)皮炎癥減少(其為內(nèi)皮功能改善的替代參數(shù))(圖20a-b)。這很可能是由于用plx-c細(xì)胞處理的小鼠中而不是用pbs處理的對(duì)照小鼠中氧氣供給增加。總之，與對(duì)照即pbs-注射小鼠相比，沒有一只plx-c注射小鼠顯示響應(yīng)肌肉內(nèi)(i.m.)細(xì)胞施用的任何不良臨床體征或癥狀。因此，plx-c誘導(dǎo)血流增加，很可能由如受損肢體的組織學(xué)評(píng)估支持的血管生成引起。此外，壞死發(fā)展的延遲和受累動(dòng)物數(shù)量的差異均表明臨床反應(yīng)。源自胎盤的粘附細(xì)胞的移植在balb/c小鼠中實(shí)施另一有效性實(shí)驗(yàn)，其包括如上文材料和方法部分中所述的安全終點(diǎn)(即所選器官的總體壞死和組織病理學(xué)分析)。在這一實(shí)驗(yàn)中，使用各由10只雄性balb/c小鼠(缺血后肢)組成的七組小鼠，如下文表7詳述。10只小鼠的一個(gè)單組未誘導(dǎo)缺血(以檢測(cè)plx-c細(xì)胞在正常、健康動(dòng)物中的總體安全性和耐受性)。誘導(dǎo)缺血后，將對(duì)照緩沖液或plx-c細(xì)胞i.m.給予受累肢，給藥后觀察小鼠至1個(gè)月。一個(gè)單組的小鼠接受受累肢的兩次單獨(dú)注射，之間相隔1周(第1和第8天)。通過激光多普勒儀分析監(jiān)測(cè)血流，通過肉眼和行為評(píng)估缺血嚴(yán)重性至給藥后30天，此時(shí)將小鼠處死并保留組織用于組織學(xué)分析。表7:小鼠后肢缺血模型中plx-c的功效實(shí)驗(yàn)在這一實(shí)驗(yàn)中，使用三個(gè)濃度的不同plx-c批次。結(jié)果顯示0.1x106和0.5x106plx-c具有很小的治療益處。在用1x106處理的動(dòng)物中在第29天(實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí))觀察到血流的顯著的改善。與對(duì)照即載體注射小鼠相比，2m組(批次g.c25)中這一血流的改善是顯著的(p<0.05)。此外，與單次注射相比，第二次注射相同批次的細(xì)胞在第15天顯著改善bf(分別為55±24對(duì)比31±12.9和27±12.5％)。缺血嚴(yán)重性的肉眼評(píng)估表明與對(duì)照載體處理組(6m)相比在接受1x106(1m&2m)的組中有改善的趨勢(shì)。這些結(jié)果綜合起來表明粘附細(xì)胞在誘導(dǎo)血管化作用(例如血流)和改善后肢缺血小鼠模型肢體功能中的功效并表明了這些細(xì)胞(例如源自胎盤的粘附細(xì)胞)在治療缺血肢體疾病中的用途。實(shí)施例7用于治療中風(fēng)的plx-c本研究的目的在于評(píng)估全身(靜脈內(nèi))移植人plx-c(源自胎盤的粘附細(xì)胞)在治療中風(fēng)中的治療功效。材料和實(shí)驗(yàn)方法受試者、手術(shù)和移植使用患高血壓、血膽固醇過多、糖尿病和微血管病的雄性自發(fā)性高血壓大鼠。將動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度、空氣濕度和光照/黑暗循環(huán)恒定的條件下。將受試者隨機(jī)分配到實(shí)驗(yàn)組(見下表8)。表8：中風(fēng)治療中的大鼠處理組組編號(hào)處理動(dòng)物數(shù)1plx-c,批次1單次施用n＝82plx-c,批次1兩次施用n＝73plx-c,批次2單次施用n＝84plx-c,批次2兩次施用n＝75對(duì)照-載體溶液n＝12動(dòng)物接受單次或兩次不同批次的1x106plx-c劑量。所有移植操作均靜脈內(nèi)實(shí)施。兩次注射組在腦缺血10和24小時(shí)后移植，而單次移植在中風(fēng)后24小時(shí)進(jìn)行。所有被移植的細(xì)胞用熒光染料pkh26預(yù)標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)性腦缺血通過永久性閉塞右大腦動(dòng)脈實(shí)施。應(yīng)注意一只動(dòng)物在麻醉后死亡。磁共振研究(mri)損傷發(fā)展的mri在第1、8、29和60天用1.5t掃描儀(philips)進(jìn)行。測(cè)量梗死體積和腦萎縮并使用冠狀t2-序列計(jì)算為三個(gè)盲研究者所得數(shù)值的平均值。行為檢測(cè)通過使用兩個(gè)獨(dú)立的行為檢測(cè)陣列測(cè)量功能變化。走橫梁實(shí)驗(yàn)為用于定量感覺-運(yùn)動(dòng)缺陷的常用檢測(cè)。使大鼠跑過水平放置的棒，大鼠的籠子在棒末端。測(cè)量五次穿越時(shí)間并記錄為日間平均值。懸停在橫梁上評(píng)定為20秒，摔落為30秒。第一周內(nèi)每日以及每七天進(jìn)行測(cè)量直到觀察期結(jié)束。第二個(gè)檢測(cè)即經(jīng)修改的神經(jīng)學(xué)嚴(yán)重度評(píng)分(mnss)包含附加的感覺、運(yùn)動(dòng)和反射項(xiàng)目。mnss的結(jié)果表示為1到18之間的評(píng)分，其中1到6之間的分?jǐn)?shù)表示輕度，7到12為中度且13到18為嚴(yán)重?fù)p傷。在腦缺血后第1、4、7、14、21、28、35、42、49和56天進(jìn)行mnss評(píng)分評(píng)估。組織學(xué)實(shí)驗(yàn)期結(jié)束之后，處死所有大鼠并經(jīng)心臟灌注4％的福爾馬林溶液。將提取的腦組織冷凍保存并切成30μm厚的切片。對(duì)于神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)的評(píng)估，用抗gfap的一抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。檢驗(yàn)(半定量)靠近梗死邊界的750μm寬的區(qū)域的gfap+細(xì)胞密度。對(duì)于星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性的檢測(cè)，包括平均間隔0.6mm的15個(gè)區(qū)域。統(tǒng)計(jì)學(xué)研究所有關(guān)于體重、mri分析和組織學(xué)檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)的高斯分布并用anova以及相應(yīng)的等級(jí)anova分析統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。將走橫梁和mnss實(shí)驗(yàn)中收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)考慮受試者的重復(fù)測(cè)量以及各受試者的短暫進(jìn)展(分層分析)。為了平衡關(guān)于腦損傷程度的個(gè)體間差異，使用隨機(jī)截距模型。因此走橫梁實(shí)驗(yàn)中收集的數(shù)據(jù)需轉(zhuǎn)化至分類系統(tǒng)。在此，小于5秒的時(shí)間值認(rèn)為是類別(0)，5至10秒為類別(1)，10至15秒為類別(2)、15至20秒為類別(3)，懸停為類別(4)以及摔落為類別(5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果體重周期性稱重使得可以很好的估算受試者的整體健康狀態(tài)。在所有組中觀察到初期體重減少，歸因于麻醉和手術(shù)介入(數(shù)據(jù)未顯示)。接著，觀察到體重迅速正常化和穩(wěn)定病程直到第60天實(shí)驗(yàn)結(jié)束(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)驗(yàn)組顯示對(duì)應(yīng)的體重增加。走橫梁實(shí)驗(yàn)在試驗(yàn)過程中所有的實(shí)驗(yàn)組均顯示走橫梁類別的顯著降低(數(shù)據(jù)未顯示)。與對(duì)照組(分別為-0.01247對(duì)比-0.02931)相比，在試驗(yàn)組1(plx-c批次1單次施用)中觀察到走橫梁類別的顯著較低降低。實(shí)驗(yàn)組3(plx-c批次2單次施用)和對(duì)照組(數(shù)據(jù)未顯示)之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的證據(jù)。修飾的神經(jīng)學(xué)嚴(yán)重度評(píng)分(mnss)所有實(shí)驗(yàn)組顯示了神經(jīng)學(xué)評(píng)分點(diǎn)的顯著降低(數(shù)據(jù)未顯示)。比較用plx-2(plx-c二次給藥)治療的受試者的mnss結(jié)果揭示出與對(duì)照組相比的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的優(yōu)越性。批次2(組3)的兩次重復(fù)移植顯示與相同批次的簡(jiǎn)單注射相比在mnss試驗(yàn)中顯著的改善。梗死體積測(cè)量磁共振成像是一種用于估算體內(nèi)腦損傷和組織喪失的高度精細(xì)的方法。考慮個(gè)體間的波動(dòng)，將梗死體積的進(jìn)展各自表示為第1天梗死體積的百分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)組之間第1天的梗死體積沒有顯著差異。第1天和第8天之間梗死體積的整體發(fā)展顯示約50％的減少。這主要?dú)w因于初期腦水腫退行。用mri檢測(cè)損傷體內(nèi)進(jìn)展表明組4(plx-c批次2兩次施用)受試者在第60天顯示顯著降低的梗死系數(shù)(分別為0.48±0.02對(duì)比0.60±0.03,結(jié)果未顯示)。這些結(jié)果綜合起來表明血管內(nèi)給予plx-c引起中風(fēng)治療中兩個(gè)行為檢測(cè)中功能恢復(fù)的顯著改善。而且，相對(duì)于類似的單次注射觀察到plx-c兩次移植的相當(dāng)大且統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的優(yōu)勢(shì)。用plx-c治療兩次的受試者中經(jīng)mri測(cè)量的行為改善的確證是明顯的。此外，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)觀察到梗死體積和腦萎縮的顯著降低。而且，在兩個(gè)功能檢測(cè)中與對(duì)照和單次注射后未驗(yàn)證的作用相比，觀察到兩次劑量移植plx-c后對(duì)功能恢復(fù)的穩(wěn)定改善。實(shí)施例8治療需要結(jié)締組織再生和/或修復(fù)的病理使用本發(fā)明粘附細(xì)胞治療需要骨再生和/或修復(fù)的病理用動(dòng)物模型(例如，成熟新西蘭白兔)檢測(cè)本發(fā)明粘附細(xì)胞(其源自胎盤或脂肪組織并獲自3d培養(yǎng)，例如plx-c細(xì)胞)在股骨臨界大小節(jié)段缺損愈合中的作用。將動(dòng)物隨機(jī)分配到三組中的一組。向a組動(dòng)物缺損部位注射1-10x106個(gè)粘附細(xì)胞(plx-c細(xì)胞)。b組動(dòng)物注射pbs。在c組動(dòng)物中，不處理缺損。手術(shù)后立即和間隔一周制得放射照片。在第12周，處死動(dòng)物，去除所涉及的股骨，制備來自缺損和鄰近骨的未脫鈣組織切片。進(jìn)行機(jī)械的、組織學(xué)的和組織形態(tài)測(cè)定實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)缺損的愈合以及缺損部位中和周圍的骨形成。此外，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-pcr)檢測(cè)i型和ii型膠原的mrna。用本發(fā)明粘附細(xì)胞治療需要腱再生和/或修復(fù)的病理用動(dòng)物模型(例如，骨骼成熟的新西蘭白兔)檢測(cè)本發(fā)明粘附細(xì)胞(例如plx-c細(xì)胞)對(duì)腱愈合的作用。將拇趾長(zhǎng)肌腱轉(zhuǎn)移至2.5-mm直徑的跟骨隧道中。使用或不使用plx-c治療骨隧道。將動(dòng)物隨機(jī)分配到三組中的一組。向a組動(dòng)物缺損部位注射或iv注射1-10x106個(gè)plx-c細(xì)胞。b組動(dòng)物注射pbs。在c組動(dòng)物中，不處理缺損。在手術(shù)后第2、4和6周收獲來自各組的三個(gè)樣品并通過使用常規(guī)的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)定位i、ii和iii型膠原進(jìn)行愈合的腱到骨界面的形態(tài)學(xué)特性的評(píng)估。用本發(fā)明粘附細(xì)胞治療需要軟骨再生和/或修復(fù)的病理用動(dòng)物模型(例如，骨骼成熟的新西蘭白兔)檢測(cè)本發(fā)明粘附細(xì)胞(例如plx-c細(xì)胞)對(duì)軟骨愈合的作用。施行左股骨遠(yuǎn)端髕骨溝關(guān)節(jié)軟骨的全層缺損。從覆蓋四頭肌的筋膜移除約6mm的皮瓣并用6-0腸線縫合至人為缺損的邊緣。將動(dòng)物隨機(jī)分配到三組中的一組。向a組動(dòng)物缺損部位注射或iv注射1-10x106個(gè)plx-c細(xì)胞。b組動(dòng)物注射pbs。在c組動(dòng)物中，不處理缺損。處死動(dòng)物。移植plx-c細(xì)胞至骨軟骨缺損上十四周之后，切除股骨遠(yuǎn)端并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估，基于修復(fù)組織的優(yōu)勢(shì)性質(zhì)、基質(zhì)染色、表面的規(guī)則性、結(jié)構(gòu)完整性、修復(fù)厚度、修復(fù)軟骨和周圍正常軟骨之間的對(duì)合、修復(fù)組織中無退化征兆以及周圍正常軟骨無退化性變化對(duì)樣品半定量分級(jí)。用本發(fā)明粘附細(xì)胞治療需要韌帶再生和/或修復(fù)的病理用動(dòng)物模型(例如，骨骼成熟的新西蘭白兔)檢測(cè)本發(fā)明粘附細(xì)胞(例如plx-c細(xì)胞)對(duì)韌帶愈合的作用。施行直徑8mm的單皮質(zhì)圓形缺損。將動(dòng)物隨機(jī)分配到三組中的一組。向a組動(dòng)物缺損部位注射或iv注射1-10x106個(gè)plx-c細(xì)胞。b組動(dòng)物注射pbs。在c組動(dòng)物中，不處理缺損。移植plx-c細(xì)胞至韌帶缺損上十四周后處死動(dòng)物。進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估并根據(jù)修復(fù)組織的優(yōu)勢(shì)性質(zhì)對(duì)樣本半定量分級(jí)。應(yīng)該了解，為清楚起見，在單獨(dú)實(shí)施方案的上下文中所闡述的本發(fā)明的某些特征也可在單個(gè)實(shí)施方案中組合提供。反之，為簡(jiǎn)短起見，在單個(gè)實(shí)施方案上下文中所闡述的本發(fā)明的各種特征，也可分開或以任何合適的亞組合提供。盡管本發(fā)明聯(lián)合其具體實(shí)施方案已得到闡述，但顯然很多備選、修改和變更對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將顯而易見。因此，意欲包括落在附加權(quán)利要求的精神和廣泛范圍內(nèi)的所有這樣的備選、修改和變化。本說明書所提到的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)和genbank登錄號(hào)以其整體通過引入本說明書在此并入，其程度如同明確并單獨(dú)地指出將每一單獨(dú)出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)或genebank登錄號(hào)在此通過引用并入一樣。另外，本申請(qǐng)中的任何參考的引用或鑒定不應(yīng)該被理解為承認(rèn)這樣的參考可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。references(additionalreferencesarecitedintext)bauer，thomasw.，muschler，georgef.，bonegraftmaterials：anoverviewofthebasicscience.clinicalorthopaedics&relatedresearch.371：10-27，february2000.carstanjenb，desboisc.，hekmatim，andbehrl.successfulengraftmentofculturedautologousmesenchymalstemcellsinasurgicallyrepairedsoftpalatedefectinanadulthorse.canjvetres.2006april；70(2)：143-147.brudersp，etal.1998theeffectofimplantsloadedwithautologousmesenchymalstemcellsonthehealingofcaninesegmentalbonedefects.jbonejointsurgam.80(7)：985-96chaowan，qilinghe，gangli，2006.allogenicperipheralbloodderivedmesenchymalstemcells(mscs)enhanceboneregenerationinrabbitulnacritical-sizedbonedefectmodel.journaloforthopaedicresearch24(4)610-618.hertheld.j.2001，enhancedsuspensoryligamenthealingin100horsesbystemcellsandotherbonemarrowcomponents.aaepproceedings/vol.47.gordonetal，tendonregenerationusingmesenchymalstemcells.p313-320intendoninjuries.springerlondon.2005.horwitzetal.，1999.transplantabilityandtherapeuticeffectsofbonemarrowderivedmesenchymalcellsinchildrenwithosteogenesisimperfecta.nat.med.5：309-313.horwitzetal.，2002.isolatedallo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