本發(fā)明屬藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及水溶性的促凝血藥維生素K₂固態(tài)復(fù)合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

維生素K₂(英文名menaquinone)的結(jié)構(gòu)如下：

指的是一族2-甲基-1,4-萘醌的同系物，其第3位為含有4～13個(gè)異戊二烯單位的異戊烯側(cè)鏈所取代，這些稱為甲萘醌；后綴(-4)表示側(cè)鏈上異二烯單位的數(shù)目。1934年，丹麥科學(xué)家首先發(fā)現(xiàn)維生素K，并證實(shí)其為脂溶性維生素。天然存在的有維生素K₁、K₂，維生素K₁廣泛存在于綠色植物中，是食物中維生素K的重要來源；維生素K₂主要由腸道細(xì)菌合成。在動(dòng)物體內(nèi)具有生物活性的是維生素K₂，而維生素K₁和維生素K₃都要轉(zhuǎn)化為維生素K₂才能起作用。三種維生素K的形式都在肝中轉(zhuǎn)化成維生素K₂，并和胃腸微生物合成的維生素K₂一起被吸收利用。維生素K缺乏可引起這些凝血因子合成障礙或異常，臨床可見出血傾向和凝血酶原時(shí)間延長(zhǎng)。維生素K與血液凝固密切相關(guān)，缺乏時(shí)，可引起肝臟對(duì)多種凝血因子的合成障礙，引起機(jī)體凝血時(shí)間延長(zhǎng)和出血傾向，及時(shí)補(bǔ)充維生素K可使凝血功能恢復(fù)。

維生素K₂具有多種功能，如：(1)治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。維生素K₂生成骨蛋白質(zhì)，再與鈣共同生成骨質(zhì)，增加骨密度，防止骨折。(2)預(yù)防肝硬化進(jìn)展為肝癌。(3)治療維生素K₂缺乏性出血癥，如新生兒出血。維生素K₂促進(jìn)凝血酶原的形成，加速凝血，維持正常的凝血時(shí)間。(4)具有利尿、強(qiáng)化肝臟的解毒功能，并能降低血壓。此外，維生素K₂還能選擇性地誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，對(duì)志愿者正常骨髓細(xì)胞只有微弱的抑制作用。(J.J.Dink,S.M.Planchon,C.Tagliarino.J.Biol.Chem.2000,275,5416.；M.Ynguchi,K.Miyazawa,M.Otawa.Leukemia.1998,12,1392.)

由此可見，維生素K₂具有較大的醫(yī)用價(jià)值，因此自上市以來對(duì)其的研究方興未艾，但其應(yīng)用存在著明顯的制肘：維生素K₂為油狀物，幾乎不溶于水(溶解度為0.054mg/mL)；維生素K₂注射液收載于《中國(guó)藥典2000年版二部》中，所用增溶劑為吐溫一80，由于吐溫一80是聚氧乙烯失水山梨醇單油酸醋，該物質(zhì)具有溶血作用，并且容易發(fā)生氧化，氧化產(chǎn)物會(huì)造成過敏；所制成的注射液在低溫放置易發(fā)生渾濁，常溫下難以恢復(fù)，需要加熱，才能重新溶解；由于吐溫一80中的聚氧乙烯以醚鍵方式與失水山梨醇結(jié)合，體內(nèi)降解緩慢，抗凝血作用也緩慢，不利于應(yīng)急治療。這些特點(diǎn)限制了維生素K₂在臨床上的使用。環(huán)糊精(Cyclodextrins,Cycloamyloses,通常簡(jiǎn)稱為CD),是一類由D型吡喃葡萄糖單元以1,4苷鍵首尾相連的截錐狀大環(huán)分子，具有疏水的空腔和親水性的表面。因此，環(huán)糊精可選擇性鍵合各種有機(jī)、無機(jī)以及生物分子形成超分子固態(tài)復(fù)合物。環(huán)糊精習(xí)慣上用一個(gè)希臘字母表示其葡萄糖單元數(shù)目，其中最常見的是α-、β-、γ-環(huán)糊精，分別擁有6、7和8個(gè)葡萄糖單元。含7個(gè)葡萄糖單元的β-環(huán)糊精可通過淀粉的酶促降解大量制備，價(jià)格低廉，而且性質(zhì)穩(wěn)定，無毒害。這些特性使其廣泛應(yīng)用于脂溶性藥物載體、食品添加劑、化妝品填料等各個(gè)領(lǐng)域(劉育，尤長(zhǎng)城，張衡益，《超分子化學(xué)-合成受體的分子識(shí)別與組裝》，南開大學(xué)出版社，2001年)。使用環(huán)糊精作為母體構(gòu)筑功能分子，可對(duì)藥物分子的包結(jié)作用創(chuàng)造良好的條件(K.Uekama,F.Hirayama,T.Irie,Chem.Rev.1998,98,2045.)。很多研究表明，天然環(huán)糊精對(duì)藥物分子的包結(jié)配位作用一般比較微弱，修飾環(huán)糊精在大部分情況下可以提高環(huán)糊精主體對(duì)客體分子的鍵合穩(wěn)定常數(shù)。如Koizumi教授報(bào)道了維生素K₂與Glucosy1-β-環(huán)糊精在水溶液中通過1:1～1:3復(fù)合。加入Glucosy1-β-環(huán)糊精后，維生素K₂在水溶液中對(duì)光和熱的穩(wěn)定性都顯著增強(qiáng)(Y.Okada,M.Tachibana,K.Koizumi,Chem.Pharm.Bull.1990,38,2047.)。遺憾的是，目前用修飾β-環(huán)糊精包結(jié)維生素K₂分子的固態(tài)復(fù)合物研究未見報(bào)道，盡管固態(tài)復(fù)合物具有便于攜帶、運(yùn)輸和貯存，穩(wěn)定性好，制劑時(shí)不需要加入防腐劑的優(yōu)點(diǎn)。

單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精是一種低毒性且水溶性極高的藥物載體，其合成方法為已有技術(shù)(例如可見：I.Tabushi,N.Shimizu,T.Sugimoto,M.Shiozuka,K.Yamamura,J.Am.Chem.Soc.1977,99,7100；I.Tabushi,N.Shimizu,Jpn.Kodai Tokkyo Koho 78 102 985,1978[Chem.Abstr.,1979,90,39196b])。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種水溶性的促凝血藥維生素K₂固態(tài)復(fù)合物及其制備方法。

本發(fā)明水溶性的促凝血藥維生素K₂固態(tài)復(fù)合物是單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精與維生素K₂的固態(tài)復(fù)合物，單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精與維生素K₂的復(fù)合比為2:1。

本發(fā)明單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精與維生素K₂的固態(tài)復(fù)合物的制備方法如下：

1)將維生素K₂溶入丙酮中，再將維生素K₂丙酮溶液加入單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精水溶液中，攪拌，將溶液密封，35-40℃下攪拌4～6天；

2)蒸發(fā)除去溶劑丙酮，抽濾除去未參與包結(jié)的維生素K₂，將所得的濾液蒸干，即得棕紅色的晶體，真空干燥，可得單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精和維生素K₂(20)固態(tài)復(fù)合物。

優(yōu)化的制備方法如下：

1)室溫下將2.9～3.1份重量的單-(6-氧-6-對(duì)甲苯磺酰基)-β-環(huán)糊精加入到28～32份重量的的蒸餾提純后的二乙烯三胺中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌至溶解后升溫到74～76℃反應(yīng)7.8～8.2小時(shí)，然后減壓蒸餾掉不少于50％的二乙烯三胺，把剩余的液體加入到4.8～5.2倍體積的丙酮中，抽濾收集沉淀，重復(fù)次操作3～4次，再把丙酮換成無水乙醇進(jìn)行此操作一次，得粗產(chǎn)物。

2)將上面所得的粗產(chǎn)物溶于水，使用Sephadex G-25凝膠柱分離，以二次蒸餾水為洗脫劑，得到單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精。

3)將1份重量的維生素K₂放入153～166份重量的丙酮中使其溶解，再將該維生素K₂丙酮溶液加入單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精370～380份重量的水溶液中，攪拌，將溶液密封，35-40℃下攪拌4.5～5.5天，維生素K₂與單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精的重量比為1:5.4～5.6，最佳為1:5.5。

4)蒸發(fā)除去溶劑丙酮，抽濾除去未參與包結(jié)的維生素K₂，將所得的濾液蒸干，即得棕紅色的晶體，真空干燥，可得單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精和維生素K₂固態(tài)復(fù)合物。

本發(fā)明方法所得固體產(chǎn)物經(jīng)過氫譜(¹H NMR)、掃描電子顯微鏡(SEM)、X射線粉末衍射(XRD)、熱重-差熱分析(TG-TDA)、紅外光譜(IR)等手段證明。

本發(fā)明的有益效果：?jiǎn)?[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精作為一種低毒性且易溶于水的藥物載體，在對(duì)促凝血藥物維生素K₂包結(jié)后，大大提高了該藥物在水中的溶解度。本發(fā)明采用超分子方法制備并分離得到單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精與維生素K₂的固態(tài)復(fù)合物，溶解度從原有0.054mg/mL提高到5.8mg/mL，增溶110倍。所得固態(tài)復(fù)合物可以作為維生素K₂的替代品應(yīng)用于臨床，為維生素K₂的臨床試用提供了新的水溶性緩釋固態(tài)復(fù)合物。

附圖說明

圖1為實(shí)施例中單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精與維生素K₂固態(tài)復(fù)合物的¹H NMR譜圖。

圖2為實(shí)施例單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精的掃描電子顯微鏡照片。

圖3為實(shí)施例維生素K₂的掃描電子顯微鏡照片。

圖4為實(shí)施例固態(tài)復(fù)合物的掃描電子顯微鏡照片。

圖5為實(shí)施例維生素K₂的X射線粉末衍射圖。

圖6為實(shí)施例單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精的X射線粉末衍射圖。

圖7為實(shí)施例固態(tài)復(fù)合物的X射線粉末衍射圖。

圖8為實(shí)施例維生素K₂的熱重-差熱分析聯(lián)用圖。

圖9為實(shí)施例單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精的熱重-差熱分析聯(lián)用圖。

圖10為實(shí)施例固態(tài)復(fù)合物的熱重-差熱分析聯(lián)用圖。

圖11為實(shí)施例維生素K₂的紅外光譜圖。

圖12為實(shí)施例單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精的紅外光譜圖。

圖13為實(shí)施例固態(tài)復(fù)合物的紅外光譜圖。

圖14為實(shí)施例單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精的合成路線圖。

圖15為實(shí)施例通過Job實(shí)驗(yàn)確定VK₂與單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精的復(fù)合比。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例

所涉及的單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精和維生素K₂固態(tài)復(fù)合物按下述方法合成：

1)單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精2的合成單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精的合成路線見圖14(按照文獻(xiàn)合成，I.Tabushi,N.Shimizu,T.Sugimoto,M.Shiozuka,K.Yamamura,J.Am.Chem.Soc.1977,99,7100；I.Tabushi,N.Shimizu,Jpn.Kodai Tokkyo Koho78 102 985,1978[Chem.Abstr.,1979,90,39196b])。

在100mL干燥圓底燒瓶中先加入蒸餾提純過的二乙烯三胺40mL，攪拌中加入單-(6-氧-6-對(duì)甲苯磺酰基)-β-環(huán)糊精5.0g，氮?dú)獗Ｗo(hù)，溶解后升溫至76℃左右反應(yīng)7小時(shí)，然后減壓蒸餾掉大部分二乙烯三胺，把剩余的液體加入到丙酮中，抽濾收集沉淀，重復(fù)次操作一次，在把丙酮換成無水乙醇進(jìn)行次操作一次，得粗產(chǎn)物。將上面所得的產(chǎn)品溶于水，使用Sephadex G-25凝膠柱分離，以二次蒸餾水為洗脫劑，得到單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精(2)。最后產(chǎn)率為31％。化合物2的¹H NMR表征數(shù)據(jù)為：¹H NMR(D₂O，TMS，ppm)δ2.70-2.9 0(m，8H)，δ3.50-4.00(m，42H)，δ3.05-3.10(m，4H)，5.10(s，7H)。

2)將34.0mg(約0.03mmol)單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精溶于9mL二次蒸餾水中，將40.0mg(約0.09mmol)維生素K₂溶于少量丙酮中，35-40℃下攪拌5天，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去反應(yīng)液中的丙酮，過濾除去沒反應(yīng)的維生素K₂，再減壓蒸干濾液，得粉紅色固體粉，真空干燥后可得單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精與維生素K₂的固態(tài)復(fù)合物，產(chǎn)率51.7％。¹H NMR(500MHz,D₂O,TMS):δ0.98-3.20(s和m,>35H,VK₂(20)側(cè)鏈上的部分H及3邊臂上的H)，3.30-4.00(m，>80H,3的H-2～6以及VK₂(20)側(cè)鏈上亞甲基氫)，4.48-5.10，(t,18H,3的H-1和VK₂(20)側(cè)鏈上的四個(gè)雙鍵H)，7.10-7.80(m,4H,苯環(huán)上的H)。

單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精與維生素K₂固態(tài)復(fù)合物的復(fù)合比通過JOB曲線確定。

采用UV-Vis，通過Job實(shí)驗(yàn)確定單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精與VK₂的包結(jié)配位的計(jì)量比。從圖15可看出，曲線在摩爾分?jǐn)?shù)在0.33處有最大值，說明單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精與客體VK₂形成的固態(tài)復(fù)合物的復(fù)合比為2:1。

3)單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精與維生素K₂的固態(tài)復(fù)合物的表征該固態(tài)復(fù)合物可通過以下方法表征：

¹H NMR(瑞士Bruker DRX-500核磁共振氫譜儀)

此固態(tài)復(fù)合物的¹H NMR譜圖如圖1所示，由圖可知，化學(xué)位移為7-8ppm處質(zhì)子峰可歸屬于維生素K₂苯環(huán)上的4個(gè)氫原子；且由于維生素K₂極低的溶解度，它自身并不能在D₂O溶劑中得到¹H NMR譜圖。

掃描電子顯微鏡(荷蘭Philips XL30ESEM-TPM掃描電子顯微鏡)

由圖2和圖3可知：?jiǎn)?[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精(圖2)和維生素K₂(圖3)的表面形態(tài)信息。形成固態(tài)復(fù)合物后，維生素K₂由原來的片層結(jié)晶狀變?yōu)楸砻婷軐?shí)的大塊狀結(jié)構(gòu)(圖4)，且表面有年輪狀裂紋；單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精的表面形貌也發(fā)生了明顯改變。由圖2-4可見，三種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)形態(tài)完全不同，表明所得的固態(tài)復(fù)合物固體粉末并非1和2的簡(jiǎn)單混合，而是環(huán)糊精2對(duì)維生素K₂鍵合生成的固態(tài)復(fù)合物。

X-射線粉末衍射(德國(guó)D8ADVANCE X-射線粉末衍射儀)

圖5、圖6和圖7分別為維生素K₂、單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精和本發(fā)明所得的固態(tài)復(fù)合物的X-射線粉末衍射圖。眾所周知，兩種物質(zhì)的簡(jiǎn)單物理混合物的X-射線粉末衍射僅是兩物質(zhì)衍射峰的簡(jiǎn)單疊加。而固態(tài)復(fù)合物并非如此：可觀察到維生素K₂存在14-19^O(2θ)區(qū)域的峰，固態(tài)復(fù)合物的基本消失，而在11-12^O(2θ)區(qū)域出現(xiàn)了一個(gè)強(qiáng)度較大的尖峰，這可歸因于維生素K₂被包結(jié)后形態(tài)的改變。這些也說明環(huán)糊精空腔對(duì)維生素K₂的包結(jié)作用。

熱重-差熱(TG-DTA)分析聯(lián)用(高溫差熱分析儀CRY-2P)

為了比較維生素K₂(稱為化合物1)、單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精(稱為化合物2)和本發(fā)明所得的固態(tài)復(fù)合物的熱穩(wěn)定性，我們對(duì)它們進(jìn)行了熱重和差熱分析研究：化合物1(圖8)的分解溫度在250℃附近，化合物2(圖9)和固態(tài)復(fù)合物(圖10)的分解溫度分別在260℃左右；而化合物1、2和固態(tài)復(fù)合物在250℃到500℃之間的失重率分別是92％、65％和66％說明了包合物的形成，同時(shí)維生素K₂被包合后熱穩(wěn)定性有所提高。

紅外光譜(德國(guó)Bruker FL-IR紅外光譜儀)

圖11為實(shí)施例維生素K₂的紅外光譜圖。圖12為實(shí)施例單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精的紅外光譜圖。圖13為實(shí)施例固態(tài)復(fù)合物的紅外光譜圖。

化合物1、2和固態(tài)復(fù)合物的紅外光譜圖分別如圖11-13所示。單-[6-(二乙烯三胺基)-6-脫氧]-β-環(huán)糊精2的紅外光譜(圖12)在3300-3500cm^-1以及2800-3000cm^-1區(qū)域內(nèi)的特征吸收可分別歸屬于參與形成氫鍵的羥基以及-CH和-CH₂基團(tuán)的振動(dòng)。維生素K₂的譜圖(圖11)在2800-3020，1650-1700和1280-1300cm^-1三個(gè)區(qū)域表現(xiàn)出很強(qiáng)的吸收帶。從對(duì)應(yīng)的三張譜圖的比較可以看出，包合物的譜圖不是主-客體的譜圖的簡(jiǎn)單加和。維生素K₂的譜圖中的特征峰在固態(tài)復(fù)合物(圖13)中部分消失，部分強(qiáng)度減弱并伴隨微小位移，說明包合物已形成。

溶解度

制備維生素K₂固態(tài)復(fù)合物的目的之一就是提高其在水中的溶解度。將一定量的維生素K₂和固態(tài)復(fù)合物分別溶于5mL水中，超聲振蕩一段時(shí)間至不再有固體溶解，過濾，將所得固體干燥稱重，可大約得知維生素K₂和本固態(tài)復(fù)合物的溶解度值。結(jié)果是維生素K₂固態(tài)復(fù)合物將維生素K₂幾乎為零的水溶性，提高到5.8mg/mL。