本發明屬于臨床醫學技術領域，尤其涉及一種高血氨影響大鼠腦內凋亡基因表達的模型及其構建方法。

背景技術：

大量研究表明，凋亡(即程序性死亡)參與多種原因導致的神經系統損害病理過程，如腦缺血、缺氧性損害等。氨中毒學說在肝性腦病的發病機制中占重要地位，氨對中樞神經系統的毒性作用主要是通過干擾腦的能量代謝實現，且課題組前期工作證實其導致一定程度的認知功能的障礙。但目前已有的研究集中在氨對大腦代謝及功能影響方面，而關于氨對大腦內神經元細胞凋亡的影響鮮有報道，Bcl-2和Bax是傳統的凋亡相關因子，在其他腦病方面的研究較多，已有大量實驗證實，Bcl-2和Bax在一些病理狀態下如缺血、缺氧時神經元細胞凋亡過程中起重要作用。由于關于氨中毒時腦組織細胞凋亡的研究較少，因此針對該模型的這兩個凋亡相關因子的研究可以完善氨中毒時腦組織細胞凋亡相關理論，為后續的治療方面提供理論支持。

綜上所述，目前已有的研究集中在氨對大腦代謝及功能影響方面，而關于氨對大腦內神經元細胞凋亡的影響屬于技術空白。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種高血氨影響大鼠腦內凋亡基因表達的模型及其構建方法，旨在解決目前已有的研究集中在氨對大腦代謝及功能影響方面，而關于氨對大腦內神經元細胞凋亡的影響屬于技術空白的問題。

本發明是這樣實現的，一種高血氨影響大鼠腦內凋亡基因表達的模型，所述高血氨影響大鼠腦內凋亡基因表達的模型為：40只雄性SD大鼠，隨機分為兩組，每組20只：正常對照組，高血氨模型組；水迷宮試驗評價大鼠學習記憶功能，大鼠麻醉后，分離血漿檢測血氨，大鼠腦組織一部分4％多聚甲醛固定，一部分-80℃保存；Tunel試劑盒檢測大鼠腦組織凋亡情況；RT-qPCR檢測大鼠腦組織Bcl-2、Bax基因的表達。

本發明的另一目的在于提供一種所述高血氨影響大鼠腦內凋亡基因表達的模型的構建方法，所述高血氨影響大鼠腦內凋亡基因表達的模型的構建方法包括以下步驟：

步驟一，40只實驗動物按照隨機原則分為2組：A組，正常對照組；B組，高血氨模型組，每組20只；B組：每只大鼠腹腔內注射5％氯化銨，劑量為0.5ml/100g，每周前4天每天1次。A組：作為對照，腹腔內注射生理鹽水0.5ml/100g；實驗動物給藥四周建立高血氨模型；

步驟二，第五實驗周開始水迷宮實驗，實驗前后均稱量體重；每天上、下午兩段固定時間進行水迷宮實驗，一共5天；

步驟三，將大鼠面向水池壁，從4個象限固定的入水點按順序分別放入池中，之后立即采用遮光簾和間接光源，攝像頭及視頻圖像采集系統可自動記錄大鼠尋找平臺過程中的游泳軌跡及時間；

步驟四，水迷宮實驗結束后，經腹腔注射10％水合氯醛麻醉大鼠，下腔靜脈采到的血標本放入肝素抗凝試管顛倒幾次，迅速置入冰??；腦組織分離皮層與海馬組織，一部分置入4％多聚甲醛溶液。一部分超低溫冰箱保存；

步驟五，經肝素抗凝的大鼠全血置入加蓋EP管低溫3500rpm離心5min，分離得血漿，強生VITRO S350生化分析儀檢測血氨。

進一步，當大鼠爬上平臺時，水迷宮視頻分析系統能夠立即計算出Time值和distance值；每次大鼠到達平臺后，讓其在平臺上停留30秒；如果在訓練中大鼠超過120s不能找到平臺，引導至平臺，并停留30秒鐘；將水迷宮實驗的最后一次訓練的學習記憶參數作為水迷宮的最終結果。

進一步，高血氨模型大鼠腦組織神經元凋亡增加，由于腦組織內多因子作用的結果，Bcl-2、Bax凋亡基因表達平衡失調所致為重要機制。

本發明提供的高血氨影響大鼠腦內凋亡基因表達的模型及其構建方法，探討高血氨大鼠腦內神經元凋亡的的分子機制；方法：40只雄性SD大鼠，隨機分為兩組，每組20只：正常對照組(A組)，高血氨模型組(B組)。水迷宮試驗評價大鼠學習記憶功能，大鼠麻醉后，分離血漿檢測血氨，大鼠腦組織一部分4％多聚甲醛固定，一部分超低溫(-80℃)保存；Tunel試劑盒檢測大鼠腦組織凋亡情況；RT-qPCR檢測大鼠腦組織Bcl-2、Bax基因的表達。結果：與正常對照組比較，高血氨模型組大鼠血氨水平明顯升高，行為學試驗表現為平均逃避潛伏期延長(P<0.05)和游泳總路程增加(P<0.05)，提示學習記憶能力下降。高血氨模型組大鼠腦組織凋亡指數升高(P<0.05)，并且該組大腦皮層、海馬Bcl-2基因表達均下降(P<0.05)，而Bax基因表達亦均升高(P<0.05)。結論：高血氨模型大鼠腦組織神經元凋亡增加，可能是由于腦組織Bcl-2、Bax等凋亡基因表達平衡失調所致。

附圖說明

圖1是本發明實施例提供的高血氨影響大鼠腦內凋亡基因表達的模型的構建方法流程圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細的描述。

如圖1所示，本發明實施例提供的高血氨影響大鼠腦內凋亡基因表達的模型的構建方法包括以下步驟：

S101：40只實驗動物按照隨機原則(統計學隨機數字表法)分為2組：A組(正常對照組)、B組(高血氨模型組)，每組20只。B組：每只大鼠腹腔內注射5％氯化銨，劑量為0.5ml/100g，每周前4天每天1次。A組：作為對照，腹腔內注射生理鹽水0.5ml/100g。實驗動物給藥四周建立高血氨模型；

S102：第五實驗周開始水迷宮實驗，實驗前后均稱量體重。每天上、下午兩段固定時間進行水迷宮實驗，一共5天；

S103：將大鼠面向水池壁(水池含墨色顏料)，從4個象限固定的入水點按順序分別放入池中，之后立即采用遮光簾和間接光源(避免光對圖像采集時的干擾)，攝像頭及視頻圖像采集系統可自動記錄大鼠尋找平臺過程中的游泳軌跡及時間，當大鼠爬上平臺時，水迷宮視頻分析系統能夠立即計算出Time值(平均逃避潛伏期)和distance值(游泳總距離)，此兩種指標反映學習記憶功能用兩個參數。每次大鼠到達平臺后，讓其在平臺上停留30秒；如果在訓練中大鼠超過120s不能找到平臺，就引導其至平臺，并停留30秒鐘。將水迷宮實驗的最后一次訓練的學習記憶參數作為水迷宮的最終結果。注意要操作輕柔，避免不必要的應激刺激。每天水迷宮結束后盡量將大鼠的毛發干燥；

S104：水迷宮實驗結束后，經腹腔注射10％水合氯醛麻醉大鼠，下腔靜脈采到的血標本放入肝素抗凝試管輕輕顛倒幾次(避免劇烈搖晃，防止溶血)，迅速置入冰浴(盡快送檢)。腦組織分離皮層與海馬組織，一部分置入4％多聚甲醛溶液。一部分超低溫冰箱保存；

S105：經肝素抗凝的大鼠全血置入加蓋EP管低溫3500rpm離心5min，分離得血漿，強生VITRO S350生化分析儀檢測血氨。

下面結合實驗對本發明的應用原理作進一步的描述。

本實驗擬觀察高血氨大鼠腦內凋亡因子的的表達變化，并進一步探討腦內神經元凋亡與學習記憶能力下降的聯系，具體步驟如下：

1 材料和方法

1.1 主要材料

40只大鼠(雄性，清潔級，體重180～200克，Sprague-Dawley系)，由溫州醫學院動物中心提供(實驗動物許可證SCXK浙2010-0150)；氯化銨粉劑(分析純級，無錫市民豐試劑廠)。Tunel試劑盒購自羅氏公司；RNA提取試劑(Trizo)購自Sigma公司；bcl-2和bax引物對(PAGE純化方式)由北京擎科新業生物技術有限公司合成，cDNA逆轉錄試劑盒購自fermantas公司，熒光PCR試劑(產品型號SYBR GreenⅠMaster)購自羅氏公司。

1.2 動物分組和高血氨模型制造

40只實驗動物按照隨機原則(統計學隨機數字表法)分為2組：A組(正常對照組)、B組(高血氨模型組)，每組20只。B組：每只大鼠腹腔內注射5％氯化銨，劑量為0.5ml/100g，每周前4天每天1次。A組：作為對照，腹腔內注射生理鹽水0.5ml/100g。實驗動物給藥四周建立高血氨模型。

1.3 Morris水迷宮實驗

第五實驗周開始水迷宮實驗，實驗前后均稱量體重。每天上、下午兩段固定時間進行水迷宮實驗，一共5天。操作方法：將大鼠面向水池壁(水池含墨色顏料)，從4個象限固定的入水點按順序分別放入池中，之后立即采用遮光簾和間接光源(避免光對圖像采集時的干擾)，攝像頭及視頻圖像采集系統可自動記錄大鼠尋找平臺過程中的游泳軌跡及時間，當大鼠爬上平臺時，水迷宮視頻分析系統能夠立即計算出Time值(平均逃避潛伏期)和distance值(游泳總距離)，此兩種指標反映學習記憶功能用兩個參數。每次大鼠到達平臺后，讓其在平臺上停留30秒；如果在訓練中大鼠超過120s不能找到平臺，就引導其至平臺，并停留30秒鐘。將水迷宮實驗的最后一次訓練的學習記憶參數作為水迷宮的最終結果。注意要操作輕柔，避免不必要的應激刺激。每天水迷宮結束后盡量將大鼠的毛發干燥。

1.4.動物標本收集及血氨的檢測

水迷宮實驗結束后，經腹腔注射10％水合氯醛麻醉大鼠，下腔靜脈采到的血標本放入肝素抗凝試管輕輕顛倒幾次(避免劇烈搖晃，防止溶血)，迅速置入冰浴(盡快送檢)。腦組織分離皮層與海馬組織，一部分置入4％多聚甲醛溶液。一部分超低溫冰箱保存。

經肝素抗凝的大鼠全血置入加蓋EP管低溫3500rpm離心5min，分離得血漿，強生VITRO S350生化分析儀檢測血氨。

1.5 神經細胞凋亡檢測

腦組織用4％的多聚甲醛固定24小時，常規梯度酒精慢脫水后石蠟包埋。蠟塊連續冠狀切片，厚4μm，載玻片預先用多聚-L-賴氨酸處理。

腦組織凋亡檢測按照TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)細胞凋亡檢測試劑盒說明操作。

光學顯微鏡觀察凋亡細胞：凋亡細胞核中有棕黃色顆粒。高倍視野(×400)下觀察凋亡細胞數，隨機計算5個視野，每個視野數100個細胞，凋亡細胞所占的百分率為凋亡指數(apoptosis index，AI)。

1.6 RT-qPCR

1.6.1 取低溫保存的大鼠腦組織20-30mg。Trizol法提取總RNA(超凈工作臺內操作，臺面用DEPC水處理過)。根據總RNA濃度的公式計算RNA樣品濃度。

1.6.2 RT(逆轉錄反應)

按照cDNA逆轉錄試劑盒說明方法將mRNA逆轉成cDNA。

1.6.3 引物合成

登錄Ensemble網站，分別找到bcl-2基因的cDNA序列(編號ENSRNOT00000016561)、bax基因cDNA序列(編號ENSRNOT00000028328)的，genetool軟件設計引物，bcl-2和bax引物對(PAGE純化方式)合成自北京擎科新業生物技術有限公司。

bcl-2引物對：正鏈5-ccggcatctgcacacctgga-3，負鏈5-ccagagtgatgcaggccccc-3，產物為152bp。

bax引物對：正鏈5-ggacccccacatggcagacagt-3，負鏈5-gcctttccccgttccccattcat-3，產物為164bp。

1.6.4 qPCR(Real time quantative PCR)

按兩步法在ABI 7900實時定量PCR儀上進行，以β-actin為內參照。20ul反應體系，加入384孔板中冰上操作，每個樣品重復3次。PCR反應條件：95℃預變性10min；95℃變性15s，60℃復性及延伸30s，45個cycle。ABI 7900HT型熒光定量PCR儀自帶SDS2.4分析軟件，得到域值循環數Ct值(threshold cyCle number，)，計算目的基因相對內參表達量。

1.7 統計學處理和分析

實驗數據均以(±S)表示，使用SPSS 17.0統計軟件進行分析，采用t檢驗分析數據，P<0.05時組間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血氨檢測結果

與A組(正常對照組)比較，B組(高血氨模型組)大鼠血氨水平明顯升高(P<0.05)(見表1)。

表1血氨水平和學習記憶參數(±S)

2.2 各組大鼠學習記憶參數

Morris水迷宮試驗中，B組大鼠較A組平均逃避潛伏期延長(P<0.05)和游泳總路程增加(P<0.05)(見表1)，可見高血氨模型組大鼠學習記憶能力下降。

2.3 大鼠腦內神經元凋亡檢測結果(見表2)

光鏡下TUNEL陽性細胞表現為細胞核內見到棕黃色顆粒，各組大鼠腦組織未見明顯壞死病灶。

與A組(正常對照組)比較，B組(高血氨模型組)大鼠腦海馬組織、皮層組織細胞凋亡明顯增多(P<0.05)；

表2兩組大鼠腦內凋亡情況比較(±S)

2.4 RT-qPCR檢測大鼠腦組織bcl-2基因mRNA結果(見表3)

B組(高血氨模型組)海馬組織、皮層組織bcl-2基因mRNA表達較A組(正常對照組)均明顯下降(P<0.05)。

表3兩組大鼠腦組織bcl-2基因表達情況(±S)

2.5 RT-qPCR檢測bax基因mRNA結果(見表4)

B組(高血氨模型組)海馬組織、皮層組織bax基因mRNA表達較A組(正常對照組)均明顯升高(P<0.05)。

表4兩組大鼠腦組織bax基因表達情況(±S)

氨對中樞神經系統具有毒性作用，既往研究表明氨主要是通過干擾腦的能量代謝發揮作用。在本發明Morris水迷宮試驗中，高血氨模型組大鼠平均逃避潛伏期延長(P<0.05)和游泳總距離增加(P<0.05)。證實了高血氨可導致大鼠空間學習記憶能力的下降。凋亡是神經元死亡的另一種重要形式，神經元凋亡對其功能的變化的影響也備受關注。腦組織在缺血缺氧等病理情況下，學習記憶功能受影響，而且其腦組織神經元凋亡增加。在本發明中，采用末端轉移標記技術(TUNEL法)檢測大鼠腦組織的凋亡情況。研究結果顯示，高血氨模型組大鼠腦海馬組織、皮層組織細胞凋亡都較正常對照組明顯增多(P<0.05)。由此可見，已被明確干擾腦組織能量代謝的氨，也影響著腦組織中的神經元的凋亡發生。因此明確其機制有重要意義。Bcl-2基因目前被認為是一種重要的內源性抗凋亡因子，通過多種途徑抑制細胞凋亡：包括維持細胞鈣穩態、抗氧化作用、抑制凋亡蛋白酶的激活、保持線粒體膜的穩定性等^[9]。有學者建立低O₂高CO₂模型探討Bcl-2基因表達與細胞凋亡的關系，結果發現Bcl-2表達下降，未能有效的抑制凋亡，則細胞繼而發生凋亡，說明Bcl-2基因表達對阻止低氧引起的神經元凋亡起重要作用。本發明發現在凋亡發生增加的高血氨模型組，腦組織中無論是海馬組織，還是皮層組織，bcl-2基因表達較正常對照組均明顯下降。可見在的氨影響下，凋亡發生的機制與抗凋亡因子bcl-2表達下降有關。Bax是Bcl-2家族中最重要的死亡促進基因，其可能促凋亡機制為：不僅使抗凋亡蛋白喪失對細胞凋亡的抑制作用，而且引起各種促凋亡因子的釋放，此外，還能夠增加靶細胞對凋亡信號的敏感性，從而導致引起細胞器功能的喪失和細胞凋亡。本發明對腦組織中的bax基因mRNA表達做了檢測，結果顯示在凋亡發生增加的高血氨模型組，腦組織中無論是海馬組織，還是皮層組織，bax基因表達較正常對照組均明顯增加，也證實，在凋亡增加的組織內，促凋亡因子bax的表達起了重要作用。

因此，綜上所述，高血氨模型大鼠腦組織神經元凋亡增加，是由于腦組織內多因子作用的結果，Bcl-2、Bax等凋亡基因表達平衡失調所致為其重要機制。

以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。