本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及阿魏菇多糖作為制備樹突狀細(xì)胞疫苗佐劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell；DC）是機(jī)體專職的抗原遞呈細(xì)胞，可以識(shí)別、捕獲和加工抗原，并將抗原遞呈給na?ve T細(xì)胞，激活抗原特異性的免疫反應(yīng)，從而連接固有免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)。在抗原遞呈過程中，不同的信號(hào)參與了抗原特異性T細(xì)胞的激活，包括MHC-多肽復(fù)合物、DC和T細(xì)胞表面共刺激分子之間的相互作用、DC分泌的細(xì)胞因子等。DC分泌的白細(xì)胞介素-12（IL-12）可促進(jìn)CD4⁺ Th1型免疫反應(yīng)及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，這兩種免疫反應(yīng)在腫瘤治療中起著重要作用。DC疫苗（DC-based vaccine）是一種具有前景的腫瘤治療性疫苗形式，在臨床上可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的免疫反應(yīng)，安全性高。然而，由于DC未達(dá)到最佳成熟狀態(tài)，并且分泌的IL-12水平較低，導(dǎo)致DC疫苗的臨床效果有限。因此，需要通過佐劑提高DC成熟狀態(tài)及IL-12分泌水平，從而提高DC疫苗的臨床效果。

佐劑（如鐘樣受體激動(dòng)劑：toll-like receptor (TLR) agonists）被廣泛應(yīng)用于新型疫苗（如多肽/蛋白疫苗、DNA疫苗及DC疫苗等），以提高疫苗的免疫原性。但是大部分佐劑具有毒副作用，不適合臨床應(yīng)用。目前美國(guó)FDA及歐洲批準(zhǔn)用于臨床應(yīng)用的佐劑種類非常少，僅包括鋁化合物佐劑、MF59、AS03、AF03及AS04。因此，急需開發(fā)新型、安全、高效的免疫佐劑增強(qiáng)疫苗的免疫原性，提高抗原特異性免疫反應(yīng)，發(fā)揮疫苗良好的預(yù)防和治療效果。

中草藥已經(jīng)有幾千年的臨床應(yīng)用歷史，臨床效果與其有效成分對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用，尤其是對(duì)抗原遞呈細(xì)胞的成熟狀態(tài)及功能的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，其安全性得到了充分的驗(yàn)證，并具有多效性，無依賴性等特征，是篩選安全、高效佐劑的理想來源。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是將從中藥阿魏菇（Pleurotus ferulae）中提取純化得到的阿魏菇多糖（PFPS）作為樹突狀細(xì)胞疫苗佐劑，刺激樹突狀細(xì)胞成熟，從而促進(jìn)樹突狀細(xì)胞疫苗免疫反應(yīng)，提高抗腫瘤效果。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

阿魏菇多糖作為制備樹突狀細(xì)胞疫苗佐劑的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述阿魏菇多糖為均一多糖，分子量為1500～1600kDa。

阿魏菇多糖的提取純化方法，包括：

（1）采用水提醇沉法得到阿魏菇粗多糖；

（2）將阿魏菇粗多糖溶解于水中，然后過二乙氨基乙基纖維素柱，流動(dòng)相為水和/或鹽水。

優(yōu)選地，所述鹽水為濃度為0.05～0.3mol/L的氯化鈉溶液。

優(yōu)選地，所述鹽水為濃度為0.05mol/L的氯化鈉溶液。

附圖說明

附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1 （A）阿魏菇粗多糖的洗脫曲線及洗脫液多糖含量，（B）不同流動(dòng)相所得的洗脫液體外刺激DC成熟的活性。

圖2 （A）為PFPS-0.05的純化及分子量檢測(cè)過丙烯葡聚糖凝膠S-300HR的洗脫曲線，（B）PFPS-0.05的高效凝膠滲透色譜圖。

圖3 為PFPS-0.05對(duì)DC成熟及細(xì)胞因子表達(dá)的影響。收集體外培養(yǎng)的不成熟DC，用10、50、100 μg/ml的PFPS-0.05 或者 20 ng/ml的LPS刺激12小時(shí)。（A）通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面CD40、CD80、 CD86和MHC II的表達(dá)。圖中顯示了這些蛋白的平均熒光強(qiáng)度（MFI）。（B）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定DC培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素-12（IL-12）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)量。數(shù)據(jù)來自4個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行單因素方差分析，*P<0.05、**P<0.01、***P <0.001，處理組與未處理組比較得出。

圖4 為TLR4抑制劑對(duì)DC成熟及細(xì)胞因子表達(dá)的影響。收集體外培養(yǎng)的不成熟DC，用TLR4抑制劑（TAK-242）進(jìn)行預(yù)處理，然后用10、50 、100 μg/ml的PFPS-0.05 或者 20 ng/ml的LPS刺激12小時(shí)。（A）通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面CD40的表達(dá)。上邊重疊峰圖為CD40表達(dá)水平，下邊為CD40的平均熒光強(qiáng)度（MFI）。（B）ELISA測(cè)定DC培養(yǎng)上清中IL-12及TNF-α的表達(dá)量。數(shù)據(jù)來自3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行成對(duì)t檢驗(yàn)。

圖5 為TLR4信號(hào)通路分子磷酸化水平檢測(cè)。收集體外培養(yǎng)的不成熟DC，用50 μg/ml的PFPS-0.05進(jìn)行刺激，在不同時(shí)間點(diǎn)收集DC，提取細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核蛋白，通過Western blot檢測(cè)TLR4信號(hào)通路分子的磷酸化水平。

圖6 為PFPS-0.05刺激的DC與人乳頭瘤病毒（HPV）多肽孵育后（HPV+PFPS+DC）對(duì)腫瘤的治療效果。腫瘤模型建立后，治療分為早期治療及晚期治療，早期治療組在第5天及第12天注射HPV+PFPS+DC，晚期治療組在第12天及第19天注射HPV+PFPS+DC。對(duì)照組分別為在第5天及第12天注射PFPS+DC，或不治療組。（A）左邊為腫瘤體積生長(zhǎng)曲線，右邊為計(jì)算的曲線下面積（AUC）。（B）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分離腫瘤并稱重。數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，*P<0.05、**P<0.01，治療組與不治療組比較得出。

圖7 為腫瘤小鼠脾臟中CD4⁺和CD8⁺ T細(xì)胞比例及亞群比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分離脾臟細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4⁺（A）和CD8⁺（B）T細(xì)胞比例及亞群比例。*P<0.05、**P<0.01，治療組與不治療組比較得出。（C）CD4⁺和CD8⁺ Tem細(xì)胞比例與腫瘤體積相關(guān)性。

圖8 為HPV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)及骨髓來源的抑制性細(xì)胞（MDSCs）和巨噬細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分離脾臟細(xì)胞。（A）脾臟細(xì)胞用HPV多肽刺激過夜，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HPV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。（B）CD8⁺ IFN-γ⁺ 細(xì)胞比例與腫瘤體積相關(guān)性。（C）MDSCs（CD11b⁺Gr-1⁺）及巨噬細(xì)胞（CD11b⁺Gr-1^-）在腫瘤小鼠脾臟中的比例。（D）MDSCs比例與腫瘤體積相關(guān)性。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，治療組與不治療組比較得出。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

阿魏菇多糖的提取純化

稱取100g阿魏菇凍干粉，用1 L 95%乙醇浸提2小時(shí)去脂，5000 rpm/min離心10 min收集沉淀，沉淀用1 L去離子水重懸，60℃水浴2小時(shí)，超聲20min助溶，6000 rpm/min離心15 min，收集上清，濾渣反復(fù)浸提4次后，合并上清液，在60℃水浴溫度下真空旋轉(zhuǎn)濃縮至1/10體積后，用Sevage試劑法：按濃縮液：Sevage試劑（氯仿：正丁醇=4:1）=3:1比例混合，磁力攪拌30min后，6000rpm/min 離心10 min，保留上清，反復(fù)脫蛋白6次，所得上清加無水乙醇至終濃度為80%， 4℃過夜，6000rpm/min離心10 min，沉淀用無水乙醇，丙酮各洗滌一次，自然干燥3小時(shí)后得粗多糖。

稱取360 mg粗多糖重新溶解于去離子水中（濃度約5 mg/ml），經(jīng)0.22 μm超濾杯過濾后，真空旋轉(zhuǎn)濃縮至終濃度約為20 mg/ml，過DEAE-52纖維素柱層析（2.6×66 cm），依次用去離子水、0.05 M、0.1 M和0.3 M NaCl溶液階段洗脫柱子，流速為1.0 ml/min，5 ml/tube收集洗脫液，采用苯酚硫酸法在490 nm處測(cè)定多糖含量，繪制洗脫曲線（圖1A）。按照洗脫峰收集合并組分，透析冷凍干燥，分別命名為PFPS-W、PFPS-0.05、PFPS-0.1及PFPS-0.3，多糖純度分別為59%、96%、70%及35%。

阿魏菇多糖刺激DC成熟活性檢測(cè)

以不同濃度的純化的PFPS處理體外培養(yǎng)的不成熟DC，12小時(shí)后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面CD40的表達(dá)（圖1B）。可以看出，PFPS-W、PFPS-0.05、PFPS-0.1均具有刺激DC成熟的活性，其中鹽洗脫的多糖刺激DC成熟的活性顯著高于水洗脫的多糖。

PFPS-0.05的分子量測(cè)定

基于多糖純度及刺激DC成熟活性，我們選取0.05 M NaCl洗脫的PFPS-0.05進(jìn)行進(jìn)一步的分析。PFPS-0.05經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，過丙烯葡聚糖凝膠S-300HR，以去離子水進(jìn)行洗脫，3 ml/tube收集洗脫液，流速為0.5 ml/min, 苯酚硫酸法測(cè)定吸光值，繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線，得到一個(gè)純洗脫峰（圖2A）。我們采用高效凝膠滲透色譜法（high performance gel-permeation chromatography）檢測(cè)了PFPS-0.05的均一度及分子量檢測(cè)（圖2B）。移動(dòng)相為0.71%的硫酸鈉，流動(dòng)速率為0.5 ml/min。結(jié)果顯示，PFPS-0.05為成分均一的多糖。以分子量為9.75, 36.8, 135.35, 300.6 and 2000 kDa的右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算PFPS-0.05的分子量大約為1500～1600 kDa。

PFPS-0.05促進(jìn)DC成熟及細(xì)胞因子表達(dá)

以不同濃度（10、50和100 mg/ml）的PFPS-0.05刺激體外培養(yǎng)的不成熟DC，12小時(shí)后收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面CD40、CD80、CD86和MHC II分子的表達(dá)。如圖3A所示，PFPS-0.05顯著提高了CD40及CD86的表達(dá)水平，并呈劑量依賴性。CD80及MHC II的表達(dá)水平也有一定的提高。收集上述細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定白細(xì)胞介素-12（IL-12）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)量。如圖3B所示，PFPS-0.05顯著增加了IL-12及TNF-α的分泌水平，水平與陽性對(duì)照細(xì)菌脂多糖（LPS）相當(dāng)。結(jié)果顯示，PFPS-0.05促進(jìn)了DC的成熟及細(xì)胞因子表達(dá)。

PFPS-0.05通過TLR4信號(hào)通路刺激DC成熟

為了驗(yàn)證PFPS-0.05是否通過TLR4信號(hào)通路刺激DC成熟，我們用TLR4抑制劑（TAK-242）對(duì)DC進(jìn)行預(yù)處理，然后用不同濃度的PFPS-0.05或LPS刺激。12小時(shí)后檢測(cè)CD40表達(dá)及細(xì)胞因子分泌。如圖4A&B所示，TAK-242預(yù)處理顯著抑制了PFPS-0.05及LPS誘導(dǎo)的CD40的表達(dá)及IL-12和TNF-α的分泌水平，結(jié)果暗示PFPS-0.05通過TLR4信號(hào)通路刺激了DC成熟。

我們進(jìn)一步檢測(cè)了TLR4信號(hào)通路下游分子的活性狀態(tài)。50 mg/ml的PFPS-0.05處理后，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，提取細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核蛋白，通過Western blot檢測(cè)TLR4信號(hào)通路分子的磷酸化水平。如圖5所示，JNK和ERK在10 min時(shí)被磷酸化，30 min時(shí)磷酸化水平開始降低。p38也在10 min時(shí)被磷酸化，并持續(xù)到了240 min。我們也觀察到，在30 min時(shí)被磷酸化并且持續(xù)到了240 min。結(jié)果顯示，PFPS-0.05激活了TLR4下游MAPK及信號(hào)通路。

PFPS-0.05刺激的DCs與人乳頭瘤病毒（HPV）多肽孵育后（HPV+PFPS+DCs）抑制了腫瘤的生長(zhǎng)

為了檢測(cè)PFPS-0.05刺激DC的抗腫瘤效果，我們用TC-1細(xì)胞建立了小鼠腫瘤模型。腫瘤模型建立后，治療分為早期治療及晚期治療，早期治療組在第5天及第12天注射HPV+PFPS+DCs（HPV+PFPS+DCs early），晚期治療組在第12天及第19天注射HPV+PFPS+DCs（HPV+PFPS+DCs late）。對(duì)照組分別為在第5天及第12天注射PFPS+DCs，或不治療組。每組8只小鼠，每隔一天測(cè)量一次腫瘤大小。對(duì)照組在27天時(shí)死了一只小鼠，腫瘤體積為3097 mm³，PFPS+DCs組在17天時(shí)死了一只小鼠，腫瘤體積為242 mm³，HPV+PFPS+DCs late組在31天時(shí)死了一只小鼠，腫瘤體積為1742 mm³，而HPV+PFPS+DCs early組所有小鼠均存活到了實(shí)驗(yàn)結(jié)束。如圖6A所示，與對(duì)照組相比，早期治療組和晚期治療組均顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，抑制率分別為93%和62%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死腫瘤小鼠，分離腫瘤，拍照并稱重。如圖6B所示，早期治療組和晚期治療組的腫瘤顯著小于對(duì)照組，腫瘤重量也顯著低于對(duì)照組。

HPV+PFPS+DCs改變了T細(xì)胞的數(shù)量及活性狀態(tài)，誘導(dǎo)產(chǎn)生了HPV特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且降低了骨髓來源的抑制性細(xì)胞（MDSCs）的比例

采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)了腫瘤小鼠脾臟中T細(xì)胞的數(shù)量及活性狀態(tài)，HPV特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)及MDSCs的比例。如圖7A&B所示，與對(duì)照組相比，早期治療組和晚期治療組小鼠脾臟中CD4⁺和CD8⁺ T細(xì)胞的比例顯著上升。以CD44和CD62L為標(biāo)志物，檢測(cè)T細(xì)胞活性狀態(tài)。與對(duì)照組相比，HPV+PFPS+DCs early組CD4⁺ Tem（效應(yīng)記憶細(xì)胞），CD8⁺ Tem和Tcm（中央記憶細(xì)胞）細(xì)胞的比例顯著上升。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，CD4⁺和CD8⁺ Tem細(xì)胞的比例與腫瘤體積呈顯著負(fù)相關(guān)性（圖7C）。

我們接下來檢測(cè)了HPV特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)，HPV+PFPS+DCs early及l(fā)ate在一定程度上增加了CD4⁺ T細(xì)胞反應(yīng)，但顯著增加了CD8⁺ T細(xì)胞反應(yīng)（圖8A），并與腫瘤體積呈顯著負(fù)相關(guān)性（圖8B）。與對(duì)照組相比，HPV+PFPS+DCs early顯著降低了MDSCs的比例，但沒有改變巨噬細(xì)胞的比例（圖8C）。我們也觀察到MDSCs的比例與腫瘤體積呈顯著正相關(guān)性（圖8D）。結(jié)果顯示，HPV+PFPS+DCs增強(qiáng)了T細(xì)胞的活性狀態(tài)，誘導(dǎo)產(chǎn)生了HPV特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)，降低了MDSCs的比例，從而抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。