本發明涉及龍膽苦苷在防治胃潰瘍疾病中的應用。

技術背景

胃潰瘍是一種胃部潰瘍性疾病，發病率在世界各個國家非常常見。當該疾病發作時，胃粘膜可出現明顯的充血、糜爛，嚴重時可導致胃穿孔，威脅生命。雖然目前胃潰瘍的具體發病機制尚未清楚，但被大家認可的是胃潰瘍的發生發展及嚴重程度，與胃粘膜組織中如MDA、MPO、TNF-α、IL-6等異常的升高，同時抗氧化應激水平相對較低密切相關。在胃潰瘍防治藥物評價中，高濃度乙醇誘導的胃潰瘍小鼠模型，是一種常見的用于研究受試藥物在胃潰瘍疾病中的作用效果的基本模型，當給予小鼠灌胃高濃度乙醇后，可迅速引起小鼠胃部粘膜點狀或條形糜爛，以及充血。

秦艽是我國傳統的一味中藥，其藥用部位為根，其80%乙醇提取物經大孔吸附樹脂D-101處理后，獲得的龍膽總苷，現已成為市售藥品，主要用于功能性消化不良屬肝胃郁熱證者，癥見胃脘飽脹，脘部燒灼，該藥中龍膽苦苷含量達50%以上（中國專利ZL97108434.3）。而將龍膽總苷經過重結晶獲得龍膽苦苷，作為肌肉和靜脈注射的龍膽苦苷粉針劑（中國專利ZL 03114558.2），及在抑制肝炎病毒藥物中的應用（中國專利 ZL 200410073488.7）已獲得國家專利授權。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供龍膽苦苷的新用途，具體涉及在防治胃潰瘍疾病中的應用。

解決上述問題的技術方案：從秦艽藥材中制備出龍膽苦苷（含量大于98%），此制備的龍膽苦苷制成片劑、膠囊劑、糖漿劑、顆粒劑等口服制劑，用于防治胃潰瘍疾病。

龍膽苦苷的制備工藝：

（1）秦艽藥材粉碎后，過100目篩，取藥材粉末，以藥材比水1：10煎煮3次，每次15分鐘，合并煎煮液，離心取上清液；

（2）取上清液上D101大孔吸附樹脂柱，每克樹脂上50 mL藥液，大孔樹脂柱用2 ~ 4倍量的水洗液洗脫，棄掉此水洗液，再用3 ~ 10倍的30%乙醇洗脫樹脂柱，收集30%乙醇洗脫液，減壓抽干，得含龍膽苦苷約70%殘留物；

（3）將此殘留物用水溶解再上大孔吸附樹脂柱D101，用30%乙醇洗脫，回收洗脫液，所得殘留物溶于2 ~ 5倍的95%乙醇中，過濾，回收乙醇并抽干，再用95%乙醇溶解，放置，析出結晶，過濾，得含量大于98%龍膽苦苷。

龍膽苦苷防治胃潰瘍，以常用制劑的形式來使用：所述的常規藥物用制劑含作為活性成分在制劑中與藥學上可接受的載體賦形劑混合，該藥用制劑可以是固體形式如片劑，膠囊劑，顆粒劑，也可以是液體形式如糖漿劑等口服制劑。

上述制劑中可含有輔助物質、穩定劑、潤濕劑和其它常用的添加劑：乳糖、檸檬酸、酒石酸、硬脂酸、硬脂酸鎂、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、可可脂、乙二醇、抗壞血酸、甘露醇等。

上述的制劑可按照各種制劑常規的制備工藝制成。

本發明通過實驗證明了：龍膽苦苷能抑制胃粘膜組織中MDA, MPO, TNF-α, IL-6的分泌，同時升高胃粘膜組織SOD，GSH的水平，提高抗氧化應激能力，減少小鼠胃粘膜糜爛性損傷的程度，達到了防治胃潰瘍的目的，龍膽苦苷具有良好的開發和應用于胃潰瘍疾病防治的價值。

說明書附圖

圖1. (A) 小鼠胃粘膜損傷的情況；(B) 潰瘍指數評估。 ^###P ≤ 0.01 與正常對照組比較, ^**P ≤ 0.01 和^***P ≤ 0.001 模型組比較，⁺P ≤ 0.05與西咪替丁組比較；

圖2. (A) 在70%誘導的小鼠胃潰瘍中，龍膽苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)對TNF-α的作用；(B) 在70%誘導的小鼠胃潰瘍中，龍膽苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)對IL-6的作用. ^###P ≤ 0.01 與正常對照組比較, ^**P ≤ 0.01 和^***P ≤ 0.001 模型組比較；

圖3. 在70%誘導的小鼠胃潰瘍中，龍膽苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)對MPO的作用. ^#P ≤ 0.05 和^###P ≤ 0.01 正常對照組比較, ^**P ≤ 0.01 和 ^***P ≤ 0.001 模型組比較, 以及 ⁺⁺⁺P ≤ 0.01 與西咪替丁組比較；

圖4. 在70%誘導的小鼠胃潰瘍中，龍膽苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100 mg/kg)對MPO的作用. ^#P ≤ 0.05 和 ^##P ≤ 0.01 正常對照組, ^*P ≤ 0.05, ^***P ≤ 0.01 和 ^***P ≤ 0.001 與模型組比較, and ⁺⁺⁺P ≤ 0.01 西咪替丁組比較；

圖5. (A) 在70%誘導的小鼠胃潰瘍中，龍膽苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)對SOD的作用；(B) 在70%誘導的小鼠胃潰瘍中，龍膽苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)對GSH的作用. ^#P ≤ 0.05, ^###P ≤ 0.01 和 ^###P ≤ 0.001 正常對照組比較, ^***P ≤ 0.001 與模型組比較, 以及 ⁺⁺⁺P ≤ 0.01西咪替丁組比較。

具體實施方式

下面發明人給出了用龍膽苦苷防治胃潰瘍疾病的實施實例。

實施例1

藥用龍膽苦苷制備成片劑，以生產片劑產品1000片為例，所用原料和輔料及其重量配比如下：

龍膽苦苷 200 g

淀粉 100 g

其制備工藝按制劑學片劑的常規工藝進行，每片重0.3 g，每片含龍膽苦苷200 mg。

用法用量：口服，每次1片，一日1次，小兒酌減，15天一個療程。

實施例2

藥用龍膽苦苷制備成膠囊劑，以生產膠囊劑產品1000例為例，所用原料和輔料及其重量配比如下：

龍膽苦苷 200 g

淀粉 100 g

其制備工藝按制劑學膠囊劑的常規工藝進行，每片重0.3 g，每片含龍膽苦苷200 mg。

用法用量：口服，每次1粒，一日1次，小兒酌減，15天一個療程。

實施例3

藥用龍膽苦苷制備成顆粒劑，以生產顆粒劑產品1000例為例，所用原料和輔料及其重量配比如下：

龍膽苦苷 200 g

蔗糖 400 g

糊精 400 g

其制備工藝按制劑學顆粒劑的常規工藝進行，每袋重1 g，1 g含龍膽苦苷200 mg。

用法用量：口服，每次1袋，一日1次，小兒酌減，15天一個療程。

實施例4

藥用龍膽苦苷制備成糖漿劑，以生產糖漿劑產品1000 mL例為例，所用原料和輔料及其重量配比如下：

龍膽苦苷 200 g

蔗糖 600 g

蒸餾水 1000 mL

其制備工藝按制劑學糖漿劑的常規工藝進行，每瓶重10 mL，1 mL含龍膽苦苷20 mg。

用法用量：口服，每次1瓶，一日1次，小兒酌減，15天一個療程。

實施例 5 藥效評價試驗

為更好的理解本發明的實質，下面將用龍膽苦苷在70%乙醇誘導的小鼠胃潰瘍模型中的實驗結果來說明它在制藥領域中的新用途。

受試藥物

龍膽苦苷（含量大于98%），味苦，無色至微黃色固體粉末。

受試動物

SPF級昆明種小鼠，雄鼠，健康適齡，體重22 ~ 28g，購自西安交通大學實驗動物中心，生產許可證號：SYXK(陜）2007-001，動物使用許可證號SYXK(陜）2010-001.

3.實驗試劑

無水乙醇，蒸餾水，70%乙醇由無水乙醇用蒸餾水稀釋而成。

試驗方法

4.1供試藥品的配制

龍膽苦苷用蒸餾水分別配制成濃度為20 mg/kg，40 mg/kg，80 mg/kg的水溶液，4℃密閉保存備用。

龍膽苦苷對70%乙醇所致的急性胃潰瘍的防治作用

昆明種小鼠60只，在SPF條件下適應性飼養7天，然后隨機將小鼠分成6組，每組10只，即空白對照組，70%乙醇控制組（模型組），70%乙醇+西咪替丁100 mg/kg控制組（西咪替丁組），70%乙醇+龍膽苦苷20 mg/kg控制組（龍膽苦苷20 mg/kg劑量組），70%乙醇+龍膽苦苷40 mg/kg控制組（龍膽苦苷40 mg/kg劑量組），70%乙醇+龍膽苦苷80 mg/kg控制組（龍膽苦苷80 mg/kg劑量組）。從第1天到第14天，空白組和70%乙醇控制組灌胃給予生理鹽水（0.01 mL/kg)，其余各組按劑量灌胃給予相應的藥物，每天一次。第15天時，空白對照組和70%乙醇控制組灌胃給予生理鹽水，其余各組按劑量灌胃給予相應的藥物，1小時后，空白組仍然給予生理鹽水，其余各組給予70%乙醇（0.01 mL/kg)，再過1小時后，所有動物用麻醉后，眥取血液后，移除胃組織，沿胃大彎剪開，用生理鹽水（4℃）洗去殘留物，于冰上展開，然后觀察并記錄數據，計算潰瘍指數。最后將所有小鼠胃組織儲藏于-80℃，用于胃粘膜組織中MDA, MPO, TNF-α, IL-6，SOD，GSH水平的測定。

小鼠胃粘膜潰瘍指數的評價得分方法如下：

0：沒有損傷；

1：粘膜充血；

2：針點狀糜爛(X < 1 mm)；

3：小的糜爛(1 mm < X)；

4：中等糜爛(1 mm ≤ X < 2 mm)；

5：大的糜爛( 2 mm≤ X <3 mm)；

6：大面積的糜爛(3 mm < X)。

胃潰瘍指數= 每組中總的得分/動物個數

4.3. TNF-α、IL-6的測定

TNF-α, IL-6通過酶聯免疫吸附測定試劑盒進行測定，操作過程嚴格按照試劑盒操作說明進行操作，吸收波長在450 um處進行測定。

的測定

小鼠胃組織于磷酸二氫鉀緩沖液（pH= 6.5）中進行勻漿，取部分組織勻漿液加入0.5%的十六烷基三甲基溴化胺溶液，渦旋10分鐘，然后在4 °C及20,000 × g下離心10分鐘，取上清液加入含有0.1 mM H₂O₂ 和 1.6 mM四甲基聯苯氨的溶液中，在37 °C進行孵化。MPO的活性通過MPO測定試劑盒在450 nm下進行測定。

的測定

小鼠胃組織于磷酸二氫鉀緩沖液（pH= 6.5）中進行勻漿. 然后在4 °C及20,000 × g下離心10分鐘，取上清液. 于上清液中加入硫代巴比土酸進行反應后，在532 nm下測定MDA的濃度。

、GSH的測定

小鼠胃黏膜中SOD、GSH的測定用SOD 測定試劑盒和GSH 測定試劑盒來進行測定，操作步驟嚴格按照測定試劑盒操作說明進行。

數據分析

所有數據通過SPSS 19.0統計軟件進行分析，以means ± S.E.M (standard error of mean)表示。其中模型組與空白對照組，以及龍膽苦苷三個不同的劑量組與西咪替丁組之間的顯著性分析通過Mann-Whitney U 進行檢驗。西咪替組和龍膽苦苷給藥組，與模型組之間的顯著性分析通過單因素方差分析中LSD-t 進行檢驗。P ≤ 0.05被認為具有顯著性。

實驗結果

6.1 胃粘膜潰瘍指數的評價

如圖1A, 正?？刂平M沒有出現明顯的胃粘膜糜爛性損傷，與模型組小鼠胃粘膜出現的嚴重性糜爛損傷相比，西咪替丁和龍膽苦苷預防性給藥減輕了胃粘膜損傷的程度。如圖1B, 從潰瘍指數評價得分結果來看，與模型組18.8 ± 3.809，龍膽苦苷(20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg)預防性給藥使潰瘍指數評價得分分別降低到8.9 ± 1.709 (P ≤ 0.01), 2.6 ± 0.763 (P ≤ 0.001), 和 1.8 ± 0.853 (P ≤ 0.001)，并且預防性給以西咪替丁也是潰瘍指數評價得分降低到8.1 ± 1.929 (P ≤ 0.001)。同時龍膽苦苷大劑量組(80 mg/kg)，潰瘍指數評價得分低于西咪替丁給藥組。

胃粘膜中TNF-α, IL-6的評價

如圖2A，與模型組(683.07 ± 17.071)比較，龍膽苦苷(20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 預防性給藥分別將TNF-α 的水平降低到544.48 ± 15.546 pg/ml tissue (P ≤ 0.001), 478.74 ± 13.436 pg/ml tissue (P ≤ 0.001), 和 415.40 ± 10.475 pg/ml tissue (P ≤ 0.001)，而且 TNF-α 的水平在西咪替丁控制組也被降低到370.9 ± 11.501, P ≤ 0.001。如圖2B，與正?？刂平M(82.431 ± 3.429 pg/ml tissue)比較，IL-6水平在模型組升高到156.42 ± 2.905 pg/ml tissue (P ≤ 0.001)。而與7模型組比較，預防性給以龍膽苦苷 (20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg)，使IL-6的水平降低到 142.52 ± 2.905 pg/ml tissue (P ≤ 0.01), 122.25 ± 2.229 pg/ml tissue (P ≤ 0.001), and 113.04 ± 2.467 pg/ml tissue (P ≤ 0.001)，而且預防性給以西咪替丁使IL-6水平也降低到93.37 ± 2.432 pg/ml tissue (P ≤ 0.001)。

胃粘膜中MPO的評價

如圖3, 與模型組MPO水平(3.9 ± 0.044)比較, 預防性給以龍膽苦苷(20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)使MPO水平降低到3.49 ± 0.083 U/g tissue (P ≤ 0.01), 3.23 ± 0.043 U/g tissue (P ≤ 0.001), 2.74 ± 0.0519 U/g tissue (P ≤ 0.001), 和3.45 ± 0.064 (P ≤ 0.01)，并且龍膽苦苷80 mg/kg劑量組對MPO的降低程度優于西咪替丁組(P ≤ 0.001)。

胃粘膜中MDA的評價

如圖4, 與模型組MDA水平(0.51 ± 0.028)比較, 預防性給以龍膽苦苷(20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg) 和西咪替丁(100mg/kg)使MDA水平降低到0.41 ± 0.026 (P ≤ 0.05), 0.20 ± 0.013 (P ≤ 0.001), 0.33 ± 0.019 (P ≤ 0.001), and 0.37 ± 0.047 (P ≤ 0.01). 而且, 40 mg/kg 和 80 mg/kg 劑量組中MDA的水平明顯比西咪替丁組低(P ≤ 0.001)。

胃粘膜中SOD、GSH的評價

如圖5A和圖5B, 預防性給以龍膽苦苷和西咪替丁明顯升高了小鼠胃黏膜中SOD和GSH的水平。在給以龍膽苦苷20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg，SOD的水平分別達到7.65 ± 0.074 (P ≤ 0.001)、9.16 ± 0.134(P ≤ 0.001)、9.16 ± 0.1134(P ≤ 0.001)，GSH的水平分別達到7.65 ± 0.074 (P ≤ 0.001), 8.09 ± 0.134 (P ≤ 0.001), 9.16 ± 0.1134 (P ≤ 0.001)。而模型組的SOD、GSH水平為6.54 ± 0.120、6.54 ± 0.120. 與模型組SOD、GSH水平相比，給以西咪替丁(100mg/kg)也使SOD、GSH水平升高到8.16 ± 0.122(P ≤ 0.001)、8.16 ± 0.122 (P ≤ 0.001). 并且SOD和 GSH水平在龍膽苦苷大劑量組(80 mg/kg)都比西咪替丁組(100mg/kg)高(P ≤ 0.001).

7.結論

實驗結果表明：在70%乙醇誘導的小鼠胃潰瘍模型中，龍膽苦苷能抑制胃粘膜組織中MDA, MPO, TNF-α, IL-6的分泌，同時升高胃粘膜組織SOD，GSH的水平，提高抗氧化應激能力，減少小鼠胃粘膜糜爛性損傷的程度，達到了防治胃潰瘍的目的。并且龍膽苦苷80 mg/kg劑量對MDA, MPO降低的程度以及對SOD，GSH升高的程度優于西咪替丁100 mg/kg的劑量，結合龍膽苦苷80 mg/kg劑量組和西咪替丁100 mg/kg劑量組的潰瘍指數評價得分結果，表明龍膽苦苷在80 mg/kg的劑量下，對胃潰瘍的防治效果優于西咪替丁100 mg/kg的劑量，因此，說明龍膽苦苷在胃潰瘍防治藥物中，具有良好的開發和應用于胃潰瘍疾病防治的價值。