本發明涉及一種放射性標記物的制備方法，特別涉及一種RGD靶向樹狀納米粒標記物的制備方法。

背景技術：

近年來癌癥（Cancer）已成為一個嚴重的社會問題和公眾關心的健康焦點。《2012中國腫瘤登記年報》顯示，我國近20年來癌癥呈現年輕化及發病率和死亡率“三線”走高的趨勢。全國腫瘤死亡率為180.54/10萬，每年因癌癥死亡病例達270萬例。包括乳腺癌、肺癌、結腸癌、甲狀腺癌等發病年齡均低于此前年齡。目前，新型腫瘤分子探針已成為診斷及治療腫瘤的重要工具。各類腫瘤分子探針介導的靶向診斷與治療，已成為分子影像研究中的熱點。

在以往的研究中，以放射性標記分子探針為代表的放射性分子靶向治療一直是腫瘤治療的研究方向之一。而在目前投放在臨床的放射性藥物中主要以^99mTc-MDP、^99mTc-MIBI、¹⁸F-FDG、 ¹⁸F-Fallypride、 ¹¹C-蛋氨酸、¹¹C-膽堿、¹¹C-乙酸鹽等SPECT/PET顯像藥物為主。各種各樣的腫瘤分子探針也正在研究階段，有待進一步開發完善。但在目前來說，放射性的藥物探針有待解決及提高的主要有以下這三個問題：第一，穩定性難以持續；第二，特異性靶向不高；第三，顯像和治療不能同時兼顧。

迄今，納米粒子作為載體運載和遞送的物質已經涉及核酸、多肽、蛋白質、放射性核素、化療藥物、光敏性分子、熒光探針分子等眾多種類，在疾病的早期檢測與診斷和治療方面展示出巨大的應用前景和經濟價值。目前正在研究的應用于分子診斷的納米探針包括金納米顆粒、量子點、磁性納米顆粒、樹狀納米粒、DNA納米機器、發射近紅外的聚合體和納米生物傳感器等。這些探針主要集中在腫瘤的顯像診斷和放射治療方面。樹狀納米?？捎糜谒幬镙斔?，檢測癌細胞凋亡，靶向用藥和腫瘤成像。這類形狀、大小完全可控的單擴散性的聚合物納米粒子的經典代表是聚酰胺-胺(PAMAM)。PAPAM 分子表面存在大量的氨基，可以很容易的和各種化合物反應連接，如靶向分子、藥物分子等。PAMAM 內部還含有大量的疏水空腔，可以通過非共價作用包裹疏水的藥物分子。PAMAM 的分子量較大，不會像小分子一樣很快通過腎代謝掉，可以在血液中停留較長的時間，增加各器官的吸收。由于PAMAM表面具有大量的活性基團，可以通過雙功能螯合劑連接多個放射性核素和靶向分子，因此在低濃度條件下可形成對比度很高的診斷影像。近來，PAMAM在腫瘤診斷和治療中的應用研究吸引了越來越多的研究者的關注，目前這個方向已經發展成為納米醫藥，是藥物運輸系統以及制藥科學中的一個研究熱點。

在目前的以RGD為靶向的納米分子藥物當中，RGD要與納米分子結合所必須要通過一個“橋梁”，如NHS-PEG-MAL、HYNIC（hydrazinonicotinic acid, 肼基煙酸）等雙功能螯合劑。RGD只是作為一個靶向分子，當它需要與納米粒相連前，大多數需要進行硫醇化才能與所謂的“橋梁”連接，從而連接到納米粒上，不僅增加了反應步驟，還降低藥物合成的穩定性。再者，目前合成的靶向納米粒要不大多只有單一的顯像功能（如¹⁸F、^99mTc、Cy5.5等），要不就只是通過載藥（DOX、PTX等）進行腫瘤靶向治療，同時具有兩種功能的納米粒研究較少。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種RGD靶向樹狀納米粒標記物的制備方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種RGD靶向樹狀納米粒的制備方法，包括如下步驟：

將RGDyC和雙功能PEG與溶劑中混合，通過點擊反應生成NHS-PEG-RGDyC，其中雙功能PEG中乙二醇單元數n為40～120之間的整數；

將NHS-PEG-RGDyC、PAMAM納米?；旌希筃HS-PEG-RGDyC與PAMAM納米粒上的胺基反應共價連接，得到PAMAM-PEG-RGDyC。

作為上述制備方法的進一步改進，RGDyC與雙功能PEG反應的pH為5～7。更佳的，RGDyC與雙功能PEG反應的pH為6。

作為上述制備方法的進一步改進，RGDyC與雙功能PEG反應的溶液為NaAc-HAc溶液。

作為上述制備方法的進一步改進，NHS-PEG-RGDyC和PAMAM納米粒反應的pH為8～10。

作為上述制備方法的進一步改進，NHS-PEG-RGDyC和PAMAM納米粒反應的溶液為硼砂-NaOH溶液。

作為上述制備方法的進一步改進，NHS-PEG-RGDyC和PAMAM納米粒反應的時間為8～14 h。

一種RGD靶向樹狀納米粒標記物，由上述制備方法制備得到的PAMAM-PEG-RGDyC與放射性核素鹽反應得到。

作為上述RGD靶向樹狀納米粒標記物的進一步改進，放射性核素鹽為NaI或KI，PAMAM-PEG-RGDyC與NaI或KI通過氯胺-T法將放射性核素共價連接在PAMAM-PEG-RGDyC上。特別的，I為¹³¹I。

本發明的有益效果是：

本發明方法反應過程更加高效，反應時間更短，操作簡便，標記率、產物純度更高。

本發明方法制備得到的RGD靶向樹狀納米粒標記物，可作為SPECT分子探針，該方法為臨床SPECT分子探針的合成提供了新的思路。

本發明方法制備得到的RGD靶向樹狀納米粒標記物還可以攜帶有效量的藥物分子，可達到對腫瘤的特異顯像以及靶向治療的目的，使惡性腫瘤的治療過程有可能處于一種“可視化”狀態。

發明人根據所需要的功能，進而有目的性地設計RGD的序列——RGDyC，其中的半胱氨酸（C）帶有巰基（-SH）基團——能與PEG進行快速點擊反應；另外當中的酪氨酸是¹³¹I標記的重要條件。總的來說，本發明中的RGDyC具有3個重要的作用，充分利用了RGDyC的功能。合成的RGD靶向納米粒通過一步¹³¹I放射性核素標記，達到了雙重效果——不僅具有靶向顯像的作用，也可進行放射性的治療。

附圖說明

圖1是標記前體PAMAM-PEG-RGDyC的¹H NMR結果圖；

圖2是合成產物PAMAM-RGDyC-¹³¹I的Radio-TLC圖，其中在比移值Rf為0的位置的峰為合成的產物峰，在Rf為0.9～1的位置的峰為游離¹³¹I^-的峰；

圖3是PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I的體外穩定性測定結果；

圖4是PAMAM-PEG-RGDyC-131I在正常小鼠體內的生物學分布；

圖5是荷A549人肺腺癌裸鼠注射PAMAM-RGDyC-131I后SPECT顯像情況；

圖6是PAMAM-RGDyC-131I的對A549細胞的毒性作用；

圖7是PAMAM-RGDyC-131I的細胞攝取情況；

圖8 是PAMAM-RGDyC-131I的細胞洗脫情況；

圖9是PAMAM-RGDyC-131I的對荷A549人肺腺癌裸鼠腫瘤體積的影響。

具體實施方式

一種RGD靶向樹狀納米粒的制備方法，包括如下步驟：

將RGDyC和雙功能PEG與溶劑中混合，通過點擊反應生成NHS-PEG-RGDyC，其中雙功能PEG中乙二醇單元數n為40～120之間的整數；

將NHS-PEG-RGDyC、PAMAM納米?；旌?，使NHS-PEG-RGDyC與PAMAM納米粒上的胺基反應共價連接，得到PAMAM-PEG-RGDyC。

制備得到的PAMAM-PEG-RGDyC可進一步負載藥物分子或標識物。

作為上述制備方法的進一步改進，RGDyC與雙功能PEG反應的pH為5～7。更佳的，RGDyC與雙功能PEG反應的pH為6。

作為上述制備方法的進一步改進，RGDyC與雙功能PEG反應的溶液為NaAc-HAc溶液。

作為上述制備方法的進一步改進，NHS-PEG-RGDyC和PAMAM納米粒反應的pH為8～10。

作為上述制備方法的進一步改進，NHS-PEG-RGDyC和PAMAM納米粒反應的溶液為硼砂-NaOH溶液。

作為上述制備方法的進一步改進，NHS-PEG-RGDyC和PAMAM納米粒反應的時間為8～14 h。

一種RGD靶向樹狀納米粒標記物，由上述制備方法制備得到的PAMAM-PEG-RGDyC與放射性核素鹽反應得到。

作為上述RGD靶向樹狀納米粒標記物的進一步改進，放射性核素鹽為NaI或KI，PAMAM-PEG-RGDyC與NaI或KI通過氯胺-T法將放射性核素共價連接在PAMAM-PEG-RGDyC上。特別的，I為¹³¹I。

下面結合實施例，進一步說明本發明的技術方案。

的合成：

取雙功能PEG（NHS-PEG-MAL）（40mg，17.22μmol）加入到含有環狀 RGDyC（2mg，6.72μmol）的乙酸鈉緩沖液（NaAc-HAc 1ml 0.1M pH6.0）中，室溫下在磁力攪拌器中攪拌反應30s；再把上一步反應中混合產物迅速轉移至含有 PAMAM（G5 108μl 4.32mg，0.15μmol）的硼酸(硼砂-NaOH)緩沖液（borate buffer：1ml 0.05M pH9.0）中，用硼酸緩沖液調節pH至9.0，繼續在室溫中反應12h。12h后，用冰乙酸將反應混合物的pH值調至7.0，加入β-巰基乙醇（1μL，14μmol）結合未反應的馬來酰亞胺基團；反應1h后，通過超濾 （Amicon Ultra-4, MWCO 30000; 3500 rpm , 6min, 8 times）去除游離 PEG 和 RGDyC，把水溶液凍干得淺黃色固體。¹H NMR分析產物成分（Ascend，400MHz），見圖1，該圖譜具有的峰型分別代表PAMAM、PEG、RGDyC的特征峰，說明標記前體合成成功。

PAMAM-RGDyC-¹³¹I的合成：

稱取PAMAM-PEG-RGDyC 3mg溶于磷酸鹽緩沖液（PBS：100μL pH 7.4）中，置于1.5ml的ep管里；取新鮮的 Na¹³¹I 溶液（5 mCi，50μl），加入管內，緊接著加入氯胺-T 1.5mg（5mg/ml, pH 7.4）；3min后，加入1.5mg的Na₂S₂O₅（5mg/ml, pH 7.4）停止碘化反應。用紙層析法（Radio-TLC）測定標記產物的放化產率，見圖2?？芍狿AMAM-RGDyC-¹³¹I的Rf值為0，而游離¹³¹I^-的Rf值為0.9~1。所以產物PAMAM-RGDyC-¹³¹I的放化產率為94.68%~98.87%，純度可進行下一步的實驗。

放射性納米探針PAMAM-RGDyC-¹³¹I的體外穩定性研究

取10 μl經純化后的PAMAM-RGDyC-¹³¹I，分別加入到250 μl小牛血清和250 μl PBS中。置于37 ℃水浴箱中孵育0、2、12、24、48、72 h， 分別于不同時間點取少量樣品紙層析法測定其放化純度，以鑒定其體外穩定性（圖3），實驗結果表明說明產物在血清與PBS中的穩定性較好。

放射性納米探針PAMAM-RGDyC-¹³¹I的的水溶性測定

在Ep管內同時加入500μl正辛醇和400μl PBS，并取100μl PAMAM-RGDyC-¹³¹I加入該管，用膠封膜密封，搖晃均勻；高速離心3 min（10000 rpm/min），至正辛醇與PBS形成明顯的分隔界面；另取6支塑料試管， 其中3支試管加入上層液體（即正辛醇），每管100 μl，另外3支試管取下層液體（即PBS），亦每管100 μl。分別測量每管的放射性計數。按下式計算脂水分配系數（log P）∶log P= log（cts正辛醇/cts PBS），cts正辛醇和cts PBS分別為100 μl正辛醇中和100 μl PBS中的平均放射性計數。

實驗測得Log P =-1.29，具有較強的親水性，符合一般納米粒的結構——外殼親水，內核親脂，可為包裹藥物及體內的長時間循環提供必要的前提。

放射性納米探針PAMAM-RGDyC-¹³¹I在正常小鼠體內的生物學分布研究

取實施例1制備的¹³¹I標記的納米探針3.7MBq/0.1mL（100μCi/100μl），將其注射到正常小鼠體內，分別在在2h、12h、24h、72h時間點將裸鼠處死，取不同臟器，稱量臟器體重和各器官或臟器中的放射性計數，計算臟器的每克組織劑量百分數（%ID/g）。如圖4所示，肝臟與腎臟的%ID/g較高，可知藥物主要被肝腎攝取。圖6的結果說明藥物主要通過肝、腎排泄。

荷A549人肺腺癌裸鼠注射PAMAM-RGDyC-¹³¹I結合物后SPECT顯像研究

實驗前 1 周，用 1％的碘化鉀封閉小鼠對放射性碘的攝取，取直徑為 0.8cm 左右的荷A549人肺腺癌裸鼠，分成兩組，從分別從注射放射性藥物PAMAM-RGDyC-¹³¹I 3.7MBq/50μl（100μCi/50μl）以及游離¹³¹I^- 3.7MBq/50μl（100μCi/50μl），在 4h、24h、72h、144h后進行常規 SPECT 儀平面顯像，觀察PAMAM-RGDyC-¹³¹I 及游離¹³¹I^-在荷瘤裸鼠腫瘤部位及體內的濃聚情況。圖5為SPECT顯像結果。可見腫瘤上有放射性聚集，證明藥物的能與腫瘤進行特異性結合的能力，且隨著時間的延長，藥物在腫瘤上的聚集沒有明顯的變化，藥物的作用時間較長，具有SPECT臨床腫瘤靶向成像及放射性治療的潛力；而另一方面，由于游離¹³¹I^-并不具有靶向結合的能力，因此注射后4h，藥物主要通過腎排泄到膀胱的位置，且到了第二天就已經基本排泄干凈。

放射性納米探針PAMAM-RGDyC-¹³¹I的細胞毒性實驗

以A549人肺腺癌細胞為模型，每孔細胞數為5000個，分別與不同的藥物孵育24、48、72h，然后加入MTT試劑（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽），再孵育4h，去除培養液，加入100μl二甲亞砜（DMSO），37℃振蕩15min，于570nm測定各個孔吸光度。結果如圖6顯示。結果顯示藥物對細胞的殺傷作用PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I＞PAMAM-PEG-RGDyC＞¹³¹I，在給藥后24h后，可看到藥物組PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I的細胞存活率相比其他兩組都比較低，到達72h后，細胞存活率低達29.71%，可說明藥物對細胞具有明顯的殺傷抑制作用。

放射性納米探針PAMAM-RGDyC-¹³¹I的細胞攝取實驗

將培養的A549細胞消化，離心并用培養液重懸成1×10⁵ cell/ml，在24孔板中每孔加入500μl細胞懸液，于37℃，5% CO₂培養箱培養，隔夜培養使之貼壁。實驗分兩組，分別加入PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I（10μCi/50μl/孔）與¹³¹I^-（10μCi/50μl/孔），兩組細胞分別在孵育1、2、4、6h后結束孵育，吸去培養液，再用PBS洗三遍，用胰酶消化細胞，收集細胞懸浮液測量γ計數。計算每個時間點PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I組與¹³¹I^-組的結合率=（每孔平均γ計數/陽性對照孔計數）×100%。

實驗結果如圖7所示，由圖7可見，藥物PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I組隨著時間的延長細胞出現穩步上升的攝取趨勢，說明藥物對于細胞具有靶向結合的特性，并且隨著時間的延長，攝取率逐漸上升；而游離131I-組因為沒有具有靶向結合的性質，所以細胞對于它是沒有結合作用的，因此游離131I-與細胞的結合率不隨時間的增長而出現明顯變化。

放射性納米探針PAMAM-RGDyC-¹³¹I的細胞洗脫實驗

將培養的A549細胞消化，離心并用培養液重懸成1×10⁵ cell/ml，在24孔板中每孔加入500μl細胞懸液，于37℃，5% CO₂培養箱培養，隔夜培養使之貼壁。實驗分兩組，分別加入PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I（10μCi/50μl/孔）與¹³¹I^-（10μCi/50μl/孔），孵育2h后撤掉培養基，用的PBS緩沖液清洗3次，用0.5mL不含血清的RPMI 1640培養液再次孵育，孵育1、2、4、6h后，每孔用1ml PBS緩沖液沖洗3次，用胰酶消化細胞，收集細胞懸浮液測量γ計數。計算經過洗脫后每個時間點PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I組與¹³¹I^-組所剩藥物的結合率，從而得知藥物在細胞中的洗脫情況。

實驗結果如圖8所示，由圖8可見，經過了1、2、4、6h的洗脫后，藥物PAMAM-PEG-RGDyC-¹³¹I組隨著時間的延長細胞中的藥物出現少量洗脫出來的現象，但變化不太明顯；另外，游離 ¹³¹I^-組中，由于游離 ¹³¹I^-對于藥物對于細胞來說沒有結合作用，即A549細胞沒有主動攝取碘的能力，因此游離 ¹³¹I^-在細胞中的含量一直處于低水平，隨時間延長，變化也不明顯。

放射性納米探針PAMAM-RGDyC-¹³¹I的藥效學實驗

取含有1×10⁷個A549細胞的懸液注射到4周左右的雄性裸鼠右側腋下，當腫瘤直徑大概為1cm³時，每周經尾靜脈注射給予400μCi的放射性藥物，持續1個月，期間沒3天天觀察記錄腫瘤體積，如圖9。由圖可知，PAMAM-RGDyC-¹³¹I可以很好地抑制腫瘤的生長。