本發明涉及一種牛病毒性腹瀉-牛傳染性鼻氣管炎二聯亞單位疫苗的制備方法和應用，屬于動物疫苗與獸用生物制品技術領域。

背景技術：

牛病毒性腹瀉(bovineviraldiarrhea,bvd)又稱牛黏膜病(mucosaldiaease,md)是由病毒性腹瀉病毒(bovineviraldiarrheavirus,bvdv)引起的，臨床表現為腹瀉、高熱、繁殖障礙、免疫抑制、持續性感染和嚴重的黏膜發炎，糜爛、壞死為特征的疾病。bvdv屬于黃病毒科瘟病毒屬。該病最早于1946年發現于美國，后呈爆發式全球流行。在美國、英國、德國、瑞士、澳大利亞、印度、日本等多個養牛大國廣泛流行傳播。1983年我國首次有報道該病發生，目前在全國已有20多個省、市、自治區存在bvd。2008年，中華人民共和國農業部發布第96號公告，將牛病毒性腹瀉定義為三類疫病；世界動物衛生組織也將該病列為法定報告的動物疫病及動物胚胎交流病原名錄三類疫病。該病流行范圍很廣，除牛外，還能感染羊、駱駝、鹿和袋鼠，甚至還有感染人的報道。bvdv主要通過消化道和呼吸道感染動物，既能水平傳播也能垂直傳播，大多數呈持續性感染(pi)，且免疫抑制容易繼發感染黏膜病，死亡率高達100％。這給全世界的養牛業造成了嚴重的經濟損失。

bvdv基因組為單股正鏈rna，全長約12.5kb，僅含有一個能編碼約4,000個氨基酸多聚蛋白的orf，多聚蛋白經翻譯和加工后，可形成11種成熟的蛋白，其中c、erns、e1、e2是病毒的結構蛋白。e2是bvdv的囊膜蛋白，免疫原性最強，能同時誘導機體產生體液免疫和細胞免疫，并產生中和抗體，因此是制備檢測抗原和疫苗的首選基因。

牛傳染性鼻氣管炎(infectiousbovinerhinotracheitis，ibr)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectiousbovinerhinotracheitisvirus，ibrv)引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，它以高熱、呼吸困難、鼻炎、竇炎和上呼吸道炎癥為特征。該病毒還可引起母牛生殖系統損害，出現流產、死胎和發生腸炎和小牛腦炎，有時還發生眼結膜炎和角膜炎。該病對奶牛的產奶量、公牛的繁殖力及使役牛的使役力均有較大的影響，并且急性的ibr呼吸道感染可繼發牛致命性細菌性肺炎。該病于20世紀50年代初最早報道于美國，但目前世界范圍內流行。我國1980年首次從新西蘭進口種牛中發現此病，目前在大部分省份的奶牛、黃牛和水牛均有ibrv感染。流行病學調查顯示，我國14個養牛主要省份ibrv平均感染率為33.3％，造成較大的經濟損失，是目前造成養牛業經濟損失的主要原因之一。

ibrv基因組由一個長獨特區(ul,106kb)和一個短獨特區(us,l0kb)及us區兩側的重復序列irs和trs組成，ibrv基因組為雙股線性dna分子，約138kb。整個基因組編碼33個結構蛋白和15個非結構蛋白，其中四個糖蛋白gb、gc、gd和ge是ibrv的主要抗原，而gd蛋白是病毒粒子表面和病毒感染細胞的主要分子，是ibrv的主要結構蛋白，同時也是ibrv復制的必需基因，是刺激機體產生中和抗體的主要糖蛋白，它不但能誘導體液免疫，也能誘導細胞免疫，因此gd是制備ibrv檢測抗原和疫苗的首選基因。

目前，兩種疾病的商品化疫苗主要是弱毒活疫苗和滅活疫苗，二者各有優缺點。弱毒活疫苗能快速誘導免疫反應、免疫持續期長且可誘導局部粘膜免疫，但是免疫活疫苗后整個牛群始終帶毒，且有可能造成毒力返強；滅活疫苗的優勢在于其安全，不存在排毒、無流產及持續性感染的風險，但是，滅活疫苗誘導產生的免疫反應持續時間較短，需要多次接種，且不能誘導細胞毒t淋巴細胞反應。目前我國商品化的疫苗很少，養牛業面臨著巨大的威脅，而進口苗價格昂貴，發生疫情時無計可施。在臨床病例研究中發現，bvdv和ibrv往往混合感染。因此急需研制一種新型的疫苗，該疫苗的免疫原性強、安全性好、成本低，且該疫苗能夠同時預防上述兩種疫病。

目前市場上面已有bvdv和ibrv滅活二聯苗，但是，滅活的bvdv和ibrv可能含有沒有滅活徹底的核酸分子，該核酸分子可能會與野生型的bvdv或ibrv重組，導致病毒進一步變異，造成疫苗免疫效果變差的風險；另外，滅活的二聯苗免疫牛，在后續效價跟蹤中，無法區分野毒感染和疫苗免疫產生的效價，不利于整個疾病的防控和凈化。如果使用活疫苗制備二聯苗，則存在很多問題，一是活疫苗之間可能存在基因重組，從而導致病毒變異的風險；二是活疫苗一般只能分開包裝，在使用時臨時混合，從而會造成包裝成本較高且終端用戶使用麻煩的問題；三是病毒之間可能存在免疫干擾的問題；四是免疫活疫苗，也存在無法區分野毒感染和疫苗免疫產生的效價，不能從根本上凈化這兩種疾病。由于亞單位疫苗是病毒的抗原蛋白組成，不存在病毒重組和變異的隱患，也不存在免疫干擾的問題，更不用分開包裝并在使用時混合，同時還能夠區分野毒感染和疫苗免疫產生的效價，因此是研究聯苗的一個非常好的方向。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題：一是提供一種免疫原性強、安全性好、無免疫干擾、能夠區分野毒感染和疫苗免疫且能從根本上凈化bvdv和ibrv的牛病毒性腹瀉-牛傳染性鼻氣管炎的二聯亞單位疫苗，達到同時能夠預防牛病毒性腹瀉和牛傳染性鼻氣管炎的目的；二是克服利用活疫苗研制聯苗時可能導致bvdv或ibrv與其他病毒的基因組或其他疫苗中殘留的核酸重組，引起病毒的變異，從而存在極大的生物安全隱患以及可能存在的免疫干擾的問題；三是克服滅活二聯苗可能存在沒有滅活徹底的核酸分子，該核酸分子可能會與野生型的bvdv或ibrv重組，導致病毒進一步變異，造成疫苗免疫效果變差的風險；四是在于提供一種制備牛病毒性腹瀉-牛傳染性鼻氣管炎的二聯亞單位疫苗的方法及在預防和治療牛病毒性腹瀉和牛傳染性鼻氣管炎中的應用。

本發明提供了一種牛病毒性腹瀉-牛傳染性鼻氣管炎二聯亞單位疫苗，其特征在于，所述疫苗包含牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白和牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白以及藥學上可以接受的佐劑。

本發明的技術方案中，優選的牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白與牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白按照等質量比混合。

本發明的技術方案中，所述疫苗中牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白和牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白濃度均為25μg/頭份～200μg/頭份，優選的疫苗中牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白和牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白濃度均為100μg/頭份。

本發明的技術方案中，所述藥學上可以接受的佐劑可以為水佐劑，如鋁膠佐劑、montanidegel01pr佐劑等，也可以為油佐劑如白油、isa206vg等，優選的佐劑為isa201vg。

本發明的技術方案中，所述免疫增強劑可以為cpgdna或干擾素等，優選的免疫增強劑為quil-a，所述quil-a的濃度為400μg/頭份～800μg/頭份，優選的quil-a的濃度為700μg/頭份。

本發明的技術方案中，所述防腐劑可以為汞類防腐劑，優選的防腐劑為硫柳汞，所述硫柳汞在每頭份疫苗中的含量低于0.01％，優選的硫柳汞的含量為2μg/頭份。

本發明還提供了一種制備牛病毒性腹瀉-牛傳染性鼻氣管炎二聯亞單位疫苗的制備方法，該方法包括以下步驟：1)制備牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白和牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白；2)將1)中制備的牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白和牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白混合制備成抗原液；其中，所述牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白與牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白按照等質量比混合；3)將抗原液與isa201vg按照體積比46:54混合乳化。

本發明的技術方案中，優選的制備疫苗的抗原液中還含有免疫增強劑和防腐劑。

本發明的動物免疫實施例中，發現無論是牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白還是牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白，二免前不同劑量的疫苗產生的抗體效價有差異，免疫高劑量的疫苗比免疫低劑量的疫苗產生的抗體效價要高，但是在二免后效價基本無差異。

本發明的動物免疫實施例中，發現不同濃度的quil-a在二免前對效價的產生有一定的影響，高濃度的quil-a產生的抗體效價相對要高，但是在二免后效價基本無差異。

本發明的動物免疫實施例中，發現免疫該牛病毒性性腹瀉-牛傳染性鼻氣管炎二聯亞單位疫苗與單獨免疫牛病毒性性腹瀉亞單位疫苗或牛傳染性鼻氣管炎亞單位疫苗相比，在免疫后存在一定的協同刺激作用，即在免疫后，聯苗的效價滴度較單獨免疫牛病毒性性腹瀉亞單位疫苗或牛傳染性鼻氣管炎亞單位疫苗效價滴度高，且基本上能夠達到甚至優于單獨免疫牛病毒性性腹瀉亞亞單位疫苗或牛傳染性鼻氣管炎亞單位疫苗的保護效果。

與現有技術相比，本發明第一次明確提出了牛病毒性腹瀉-牛傳染性鼻氣管炎的二聯亞單位疫苗及其制備方法和應用。本發明的疫苗具有免疫原性強、安全性好、無免疫干擾、能夠區分野毒感染和疫苗免疫且能從根本上凈化bvdv和ibrv的優點；且通過該疫苗進行免疫接種，不僅可有效預防和保護牛免受牛病毒性腹瀉病毒和牛傳染性鼻氣管炎病毒的感染，能夠達到“一針兩防”的效果，省時、省力、節約成本，而且不存在病毒重組和變異的隱患，更避免了分開包裝并在使用時混合的麻煩。

附圖說明

圖1表示idexx試劑盒檢測免疫后牛病毒性腹瀉抗體效價結果。

圖2表示elisa檢測免疫后牛傳染性鼻氣管炎抗體效價結果。

具體實施方式

以下將結合附圖和實施例對本發明做進一步說明，本發明的實施例僅用于說明本發明的技術方案，并非限定本發明。

本發明試劑及藥品的來源列單如下：

quil-a購自brenntagbiosector；

防腐劑硫柳汞購自lifesciences；

isa201vg購自法國賽比克公司。

實施例1：牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白和牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白的制備

1.1參照中國發明專利申請公布號為cn105924506a的專利申請文件或者本公司的申請號為201611208261.8的發明專利申請文件或者其他蛋白表達方式(如原核表達系統表達)或其他專利或文獻中的牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白的制備方法制備牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白。

1.2參照申請號為201610225968.3發明專利申請文件或者其他蛋白表達方式(如原核表達系統表達、昆蟲桿狀病毒表達、cho細胞表達系統等)或其他專利或文獻中的牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白的制備方法制備牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白。

實施例2：牛病毒性腹瀉-牛傳染性鼻氣管炎二聯亞單位疫苗的制備(以制備2ml/頭份，共200ml為例說明)

所用制備疫苗的耗材和材料都需預先經過無菌處理，制備過程是在生物安全柜或其他可以保證整個制備過程都無菌的儀器或環境中完成。

1.isa201vg準備：根據抗原液和佐劑體積比為46:54，量取佐劑體積為108ml置于預先準備好的試劑瓶中，封口，置于33℃水浴鍋中預熱約30min。

2.根據抗原液和佐劑體積比為46:54，水相總體積為92ml。根據牛病毒性腹瀉病毒e2(bvdv-e2)蛋白濃度和牛傳染性鼻氣管炎病毒gd(ibrv-gd)蛋白濃度以及疫苗中蛋白總含量，計算牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白和牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白取用的體積；若抗原液中還加入免疫增強劑quil-a或防腐劑硫柳汞，則根據quil-a和硫柳汞的原始濃度以及疫苗中quil-a和硫柳汞的含量計算quil-a和硫柳汞取用的體積；用pbs緩沖液或其他緩沖液將抗原液總體積補充至92ml，混勻后置于33℃水浴鍋中預熱約30min。例如牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白和牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白的濃度均為0.5mg/ml，quil-a的原始濃度為10mg/ml，硫柳汞的原始濃度為30mg/ml，疫苗中牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白和牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白含量均為100μg/頭份(2ml/頭份)，疫苗中quil-a含量為700μg/頭份(2ml/頭份)，疫苗中硫柳汞含量為2μg/ml。具體配置如下表1所示：

表1

3.攪拌：將預熱好的佐劑加到預先準備好的燒杯中，調整好攪拌機的高度和速度，再將預熱好的抗原液迅速加到油相中，繼續攪拌10～20min。一般根據制備體積選擇攪拌速度和攪拌時間，如制備200ml疫苗組合物，一般選擇350rpm/min攪拌10min即可。

4.穩定：將3中攪拌好的疫苗置于20℃水浴鍋中靜置1h，然后置于4℃冰箱中過夜。

5.分裝：穩定好的疫苗根據需要分裝并寫上標簽。

實施例3：牛病毒性腹瀉-牛傳染性鼻氣管炎二聯亞單位疫苗的免疫實驗

3.1疫苗制備

按照實施例1和2的方法制備蛋白和疫苗，具體疫苗信息見下表2所示：

表2

3.2免疫實驗

篩選4-5月齡小牛40頭(bvdv和ibrv抗原抗體陰性)，隨機分成8組，每組5頭，一組作為空白對照組，其他7組作為免疫組，分別免疫疫苗1至疫苗7。空白對照組每次肌肉注射2ml生理鹽水，另外6組免疫組每次肌肉注射2ml相應的疫苗，，初免三周后加強免疫一次，免疫前、二免前和二免后21天采集血清，檢測抗體效價。

實驗結果如圖1所示，idexx牛病毒性腹瀉病毒抗體檢測試劑盒檢測結果顯示：免疫牛病毒性腹瀉-牛傳染性鼻氣管炎二聯亞單位疫苗(疫苗2)的牛病毒性腹瀉病毒抗體效價在二免前較單獨免疫牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白亞單位疫苗(疫苗6)的牛病毒性腹瀉病毒抗體s/p值高，約高0.1-0.2，但在二免后兩組免疫組s/p值基本保持一致，平均s/p值均高于1.5；不同劑量的牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白制備的疫苗(疫苗1、疫苗2、疫苗3)，在二免前s/p值有差異，疫苗中牛病毒性腹瀉病毒e2蛋白含量越高，s/p值相對要高，但在二免后s/p值基本一致，均高于1.5。

實驗結果如圖2所示，elisa抗體檢測結果顯示：免疫牛病毒性腹瀉-牛傳染性鼻氣管炎二聯亞單位疫苗(疫苗2)的牛傳染性鼻氣管炎病毒相對抗體效價在二免前較單獨免疫牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白亞單位疫苗(疫苗7)的牛傳染性鼻氣管炎病毒相對抗體效價較高，約高半個稀釋度，但在二免后兩組免疫組相對抗體效價基本保持一致，平均相對效價能夠達到38,000以上；不同劑量的牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白制備的疫苗(疫苗1、疫苗2、疫苗3)，在二免前相對抗體效價有差異，疫苗中牛傳染性鼻氣管炎病毒gd蛋白含量越高，相對抗體效價相對要高，但在二免后相對抗體效價基本一致，均能達到38,000以上。

從圖1和圖2中可以看出，不同濃度的quil-a(疫苗2、疫苗4、疫苗5)在二免前對效價的產生有一定的影響，高濃度的quil-a產生的抗體效價相對要高，但是在二免后效價基本無差異。

3.3elisa檢測抗體效價

(1)包被：用包被液(50mm碳酸鹽緩沖液，ph9.5)稀釋純化的gd蛋白至0.5μg/ml，在酶標板上每孔加入100μl，封口膜封好后4℃冰箱放置過夜；

(2)洗滌：從冰箱取出酶標板后，放入洗板機中洗滌，洗滌液用pbst；

(3)封閉：每孔加入200μl封閉液(5％脫脂奶)，封口膜封好后37℃孵育2h；

(4)樣品準備：按已知的信息和需要用量，用封閉液將血清進行適度稀釋；

(5)洗滌：同(2)；

(6)加樣：加入稀釋血清，同時用封閉液做陰性對照，37℃孵育1h；

(7)洗滌：同(2)；

(8)加二抗：每孔加入適度稀釋的hrp標記的二抗100μl，37℃孵育0.5h；

(9)洗滌：同(2)；

(10)顯色：避光條件下每孔加入100μl的tmb顯色液，37℃孵育10min；

(11)終止：每孔加入50μl終止液(2mh2so4)，終止反應；

(12)檢測：于450nm波長測定樣品od值，分析數據；

(13)結果分析：判斷抗體陽性的標準：p/n≥2.1，od450≥0.1。

本發明通過上面的實施例進行舉例說明，但是，應當理解，本發明并不限于這里所描述的特殊實例和實施方案。在這里包含這些特殊實例和實施方案的目的在于幫助本領域中的技術人員實踐本發明。任何本領域中的技術人員很容易在不脫離本發明精神和范圍的情況下進行進一步的改進和完善，因此本發明只受到本發明權利要求的內容和范圍的限制，其意圖涵蓋所有包括在由附錄權利要求所限定的本發明精神和范圍內的備選方案和等同方案。