本發明涉及化妝品技術領域，具體是一種從鱟試劑廢料中提取抑菌組合物制備化妝品的方法。
背景技術：
鱟，又稱馬蹄蟹，是一種生活在海洋中的大型底棲節肢動物,從早古生代的奧陶紀出現至今已有4億多年的歷史,是動物界具有獨特進化地位的“活化石”之一。鱟是無脊椎動物血液學研究的絕好材料,也是目前鱟資源開發利用和鱟試劑研制的主要原材料,一直受到日、美等國學者的高度重視。隨著對鱟血淋巴的免疫功能研究以及和其他無脊椎動物血淋巴的免疫學比較研究,尤其是從鱟血淋巴中分離出許多具有抗菌、抗病毒的活性物質。總體而言，鱟作為一種具有巨大醫藥開發潛力的重要資源，為世界各國高技術產業所矚目。
目前鱟的主要用途是制備鱟試劑。鱟血細胞中的顆粒細胞中含有能與內毒素起凝集作用的酶系統。根據此原理，世界各國研究人員經不懈努力，開發出了用于藥品細菌內毒素檢測的鱟試劑。同時，鱟試劑還能被β-葡聚糖激活，而1-3-β-D葡聚糖是真菌細胞壁的特有成分，從而鱟試劑亦被開發應用于檢測深度真菌感染。但鱟試劑的提取過程中僅利用到了鱟血細胞，剩余的其他成分并未得到有效開發利用。鱟試劑的提取過程包括：
a鱟細胞裂解液的配制：裂解液為Tris-HCl,NaCl緩沖液。其中，所述緩沖液為pH 7-8，NaCl，Tris-HCl可根據實際情況調節，一般為50mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl；
b鱟細胞的裂解乳化：取全血離心后的鱟細胞，按1:5-1:8.5的比例加入鱟細胞裂解液，使用高速勻漿機勻漿5-20分鐘，既得鱟細胞裂解乳化物。
c鱟細胞裂解液分離提純：將上述乳化物低溫離心25-30分鐘，取上清液，分裝備用，即為鱟細胞裂解液。向裂解液中以1:1-1:2的比例加入氯仿溶液，低溫攪拌離心后，仔細取出上清液備用。
d制劑：取c步驟中最終上清液，各生產廠家根據自身情況，向其中添加多肽顯色基質，低溫攪拌分裝后，真空冷凍干燥后即得鱟試劑。
另外，在鱟試劑的提取過程中作為鱟全血的另一組成部分，鱟血漿也被廢棄。
化妝品在存儲和使用過程中，極易受微生物的污染而導致腐敗。由于微生物的作用可引起化妝品變質、腐敗，在感官上其色澤和氣味發生變化，從而失去商品價值。更重要的是致病微生物的污染會導致人體健康的危害。防止化妝品由于微生物污染而產生對人體皮膚的危害及產品的變質、發霉，當前最有效的辦法就是添加防腐劑，防腐劑是能夠抑制微生物的生長、繁殖的一類化學藥劑。隨著科研水平的進步，業界對防腐劑的安全性研究也越來越深入，許多傳統有被使用的防腐劑，都被證實具有一定的負面作用。所以，開發安全的純天然或是生物抗菌、防腐技術成為業界的研發方向之一。此外，在化妝品中由于其成分如主原料、防腐劑、乳化劑、香料等絕大多數都是化學合成品，使用時發生過敏反應己屢見不鮮。
技術實現要素：
本發明的目的在于豐富目前化妝品的種類，提供一種從鱟試劑廢料中提取抑菌組合物制備化妝品的方法，以實現化妝品天然綠色，且具有抗菌、防腐、滋養、修復、保濕等多重功效。
本發明實現目的的技術方案如下：
1、一種從鱟試劑廢料中提取抑菌組合物制備化妝品的方法，該方法包括步驟如下：
第一步，在鱟試劑廢料中提取抑菌組合物
(1)原料處理
收集鱟血細胞及血漿，作為原料備用；其中，所述鱟血細胞是鱟試劑生產工藝中丟棄的乳化物沉淀，所述血漿是鱟試劑生產過程中丟棄的血漿；
(2)鱟素肽粗提液的制備
a.酸解：將鱟細胞乳化物離心后的下層沉淀以固液比例1:6.5-8的比例加入酸液(20m mol/L)，低溫超聲破碎，破碎條件為：100ml超聲波輸出功率為700W，超聲波總作用時間為10min,每次超聲作用時間為10S，反復超聲3次，收集上清液即為細胞酸抽提液；
b.調pH去沉淀：將抽提液用NaOH調節pH至6.5，離心除沉淀，得上清液；
c.熱變性處理：上清液沸水浴處理5-10min,4℃下離心棄沉淀收集上清液，上清液用0.22uM膜過濾得鱟素肽粗提液；
(3)血漿中血藍蛋白粗提液的制備
將上述步驟(1)中的血漿經300000g超離心3.5h，即得到初步提純的血藍蛋白沉淀，將沉淀再溶于pH7.0，0.2mol/L磷酸緩沖液中，即為血藍蛋白粗提液；
(4)血漿中SOD粗提液的制備
按質量份數計，取100份上述步驟(1)中的鱟血漿，加入34份0.05mol/L磷酸鹽緩沖液和100份0.9％NaCl溶液，輕輕攪拌混勻，將混合液置于65℃水浴鍋中，恒溫20min后，急冷至10℃，離心去除沉淀，取上清液，即為SOD粗提液；
(5)粗提液的混合
將上述三種粗提液按60-80份的鱟素肽粗提液，10-20份的血藍蛋白提取液，10-20份的SOD提取液混合，使用pH調節劑調節pH值4-5后過濾，得到最終形式的抑菌組合物。
第二步，由上述抑菌組合物制備化妝品
(1)按如下質量百分比配置化妝品包括的組份：
(2)得到化妝品成品
A.將上述化妝品組份中包括的部分油相與去離子水進行初步乳化；
b.調整上述乳化體系溫度至35℃～40℃，加入橄欖油、抑菌組合物，體系經攪拌均勻降溫后得成品。
而且，所述第一步的步驟(5)中的pH調節劑為檸檬酸、檸檬酸鈉、乳酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、硼酸、硼砂中的一種或多種的組合。
而且，所述第一步的步驟(5)中抑菌組合物的鱟素肽粗提液﹕血藍蛋白粗提液﹕SOD粗提液的最佳配比為：8﹕1﹕1或6﹕2﹕2。
而且，所述第二步的(2)步中進行初步乳化的油相組份包括維生素E醋酸酯、二乙二醇脂肪酸酯及賦形增稠劑。
本發明的優點和效果是：
1、本專利原料抑菌組合物對鱟試劑生產廢料進行了充分提取。主要提取了鱟血細胞提取廢料中的鱟素肽及血漿中的血藍蛋白及超氧化物歧化酶(SOD)等成分，將其混合后用于化妝品的制備。
2、本專利方法獲得的化妝品能有效的抑制各類細菌及真菌的生長。較傳統化學抑菌產品而言，更為安全溫和有效，無毒副作用，能避免常規抑菌產品耐藥性和過敏現象的發生。
3、由于本發明的抑菌組合物應用化妝品領域，因此，鱟素肽的提取采用的是快速，便捷的低成本提取方式，提取出的鱟素肽粗提液完全能夠滿足日常性抗菌，消炎，防腐性用品的需要。
4、本專利方法獲得的化妝品具有較強的抗紫外輻射能力。作為護膚品使用，可以抵御輻射對人體的肌膚損傷，減緩皮膚老化。
附圖說明
圖1是本發明化妝品在波長280-400nm范圍內的紫外吸收光譜
具體實施方式
下面結合具體實施方案對本發明進一步說明，其具體實施方案應該理解為僅為舉例說明，不是限定性的，不能以下述舉例說明來限定本發明的保護范圍。
一種從鱟試劑廢料中提取抑菌組合物制備化妝品的方法，該方法包括步驟如下：
第一步，在鱟試劑廢料中提取抑菌組合物
(1)原料處理
收集鱟血細胞及血漿，作為原料備用；其中，所述鱟血細胞是鱟試劑生產工藝中丟棄的乳化物沉淀，所述血漿是鱟試劑生產過程中丟棄的血漿；
(2)鱟素肽粗提液的制備
a.酸解：將鱟細胞乳化物離心后的下層沉淀以固液比例1:6.5-8的比例加入酸液(20m mol/L)，低溫超聲破碎，破碎條件為：100ml超聲波輸出功率為700W，超聲波總作用時間為10min,每次超聲作用時間為10S，反復超聲3次，收集上清液即為細胞酸抽提液；
b.調pH去沉淀：將抽提液用NaOH調節pH至6.5，離心除沉淀，得上清液；
c.熱變性處理：上清液沸水浴處理5-10min,4℃下離心棄沉淀收集上清液，上清液用0.22uM膜過濾得鱟素肽粗提液；
(3)血漿中血藍蛋白粗提液的制備
將上述步驟(1)中的血漿經300000g超離心3.5h，即得到初步提純的血藍蛋白沉淀，將沉淀再溶于pH7.0，0.2mol/L磷酸緩沖液中，即為血藍蛋白粗提液；
(4)血漿中SOD粗提液的制備
按質量份數計，取100份上述步驟(1)中的鱟血漿，加入34份0.05mol/L磷酸鹽緩沖液和100份0.9％NaCl溶液，輕輕攪拌混勻，將混合液置于65℃水浴鍋中，恒溫20min后，急冷至10℃，離心去除沉淀，取上清液，即為SOD粗提液；
(5)粗提液的混合
將上述三種粗提液按60-80份的鱟素肽粗提液，10-20份的血藍蛋白提取液，10-20份的SOD提取液混合，使用pH調節劑調節pH值4-5后過濾，得到最終形式的抑菌組合物。
其中，所述pH調節劑為檸檬酸、檸檬酸鈉、乳酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、硼酸、硼砂中的一種或多種的組合。
第二步，由上述抑菌組合物制備化妝品
(1)按如下質量百分比配置化妝品包括的組份：
(2)得到化妝品成品
a.上述化妝品組份中包括油相的維生素E醋酸酯、二乙二醇脂肪酸酯、賦形增稠劑及橄欖油、去離子水和本發明所述的抑菌組合物，先使化妝品原料的油相中維生素E醋酸酯、二乙二醇脂肪酸酯及賦形增稠劑和去離子水進行初步乳化；
b.調整上述乳化體系的溫度，降溫至35～40℃，加入橄欖油、抑菌組合物，體系經攪拌均勻，進一步降溫后完成操作，然后灌裝得成品。
抑菌組合物的抑菌效果實驗
(1)組成
抑菌組合物由鱟素肽粗提液，血藍蛋白提取液，SOD提取液按一定配比組合而成。
2抑菌試驗
A實驗材料
由鱟素肽粗提液、血藍蛋白提取液、SOD提取液組合的抑菌組合物。
B受試菌種
細菌：金黃色葡萄球菌：(Staphylococcus aureus)ATCC 6538
大腸埃希氏菌：(Escherichia coli)ATCC 8739
銅綠假單胞菌：(Pseudomonas.aeruginosa)ATCC 9027
注：上述菌株均由中科院典型培養物保藏委員會微生物菌種庫提供。
C培養基
細菌培養基：卵磷脂吐溫80-營養瓊脂培養基，121℃高壓滅菌20min后制成斜面備用。
D菌懸液的制備
實驗前將各個菌株分別接種到相應的培養基斜面，細菌(金黃色葡萄球菌，大腸埃希氏菌，銅綠假單胞菌)均于36±1℃恒溫培養箱中培養36～48小時。分別挑取適量菌落于無菌生理鹽水中混勻，制成一定濃度的混合菌懸液。混合細菌懸液總濃度約為1.0×108cfu/ml。置于4℃貯存備用。
E抑菌組合物抑菌液的的制備
按照正交設計法確定各提取液組合的配比，將四種提取液按表1的方案分別進行配制后，用純凈水以2:3比例進一步稀釋至化妝品中添加濃度，備用。
表1復合提取液抑菌作用考察因素及水平
F提取液的抑菌試驗
采用濾紙片擴散法，無菌條件下進行，將濾紙用打孔器打成直徑6mm的圓形濾紙片，置于潔凈干凈的小燒杯，121℃干熱滅菌20min后，分別放入4種不同比例提取液復配液中充分浸泡，每只試管放入8片備用。將已配制好的固體培養基融化，分別倒入培養皿中，121℃滅菌20min，待冷卻凝固后，吸取0.1ml菌懸液于平板上涂布均勻。用無菌鑷子分別夾取已在提取物原液中浸泡過的直徑為6mm圓形濾紙片，貼在含菌平板上，每個平板內貼5片，以無菌水浸泡的濾紙片作為空白對照，將各培養皿置于37℃恒溫培養箱中平板倒置培養24h，測定抑菌圈直徑的大小，設3個重復，取其平均值。混合細菌懸液的抑菌圈直徑見表2
表2
由抑菌圈大小可以看出，提取液配比為8：1：1或6：2：2時，抑菌作用明顯。
化妝品抗紫外實驗
將上述化妝品1.0g，分別置于25mL比色管中，用60％乙醇定容至刻度，用紫外可見分光光度計在波長280～400nm范圍內掃描，確定其紫外吸收光譜，計算本化妝品在UVB區(280～320nm)和UVA區(320～400nm)的平均吸光度值，評價其抗紫外線輻射能力。
結果與分析
按上述方法，測得本化妝品在波長280～400nm范圍內的紫外吸收光譜如圖1所示。計算得該化妝品在UVB區(280～320nm)和UVA區(320～400nm)的平均吸光度值分別為0.348和0.266。可見，本化妝品在紫外線UVB區和UVA區均具有較強的抗紫外線輻射能力，即具有廣譜抗紫外線能力。同時也表明，本化妝品抗UVB區紫外線的能力強于抗UVA區紫外線的能力。