本發明屬于生物技術領域，涉及一種葡萄果實黃酮醇的綠色高效提取方法。
背景技術：
葡萄(拉丁學名vitisviniferal.)是世界上種植面積最大、產量最高的水果之一，同時也是世界范圍內最受消費者歡迎的水果之一。其是多種營養物質及生物活性物質的重要來源。黃酮醇是葡萄果實中重要的生物活性物質，因其具有抗氧化、抗炎、抗癌、抑菌、對心腦血管疾病及多種衰老相關疾病具有重要的預防和治療作用而受到食品科學界的廣泛關注，同時也成為食品加工業及功能食品領域重要的功能因子。其提取物可作為重要的抗氧化劑及輔色物質添加到食品中。但目前葡萄果實黃酮醇的提取方法多為有機溶劑提取法，在提取過程中引入了大量甲醇、乙醇或丙酮等有機溶劑。有機溶劑殘留問題一方面帶來了環境污染，同時也造成了極大的食品安全隱患。因此開發一種兼具高效、安全同時又綠色無污染的提取方法對于葡萄果實黃酮醇提取物在食品加工業及功能食品領域的廣泛應用具有重要意義。
技術實現要素：
本發明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優點。
本發明還有一個目的是提供一種葡萄果實黃酮醇的綠色高效提取方法。
本發明提供的技術方案為：
一種葡萄果實黃酮醇的綠色高效提取方法，包括：
取葡萄果實凍干樣品粉末，采用亞臨界水提取法于進行黃酮醇提取，提取時葡萄果實凍干樣品粉末與水的料液比為1:20～25g/ml，于提取溫度為100～110℃和一定壓力下提取時間為20～30min。
優選的是，所述的葡萄果實黃酮醇的綠色高效提取方法中，所述一定壓力為0.9～1.1mpa。
優選的是，所述的葡萄果實黃酮醇的綠色高效提取方法中，所述提取時所述葡萄果實凍干樣品粉末與水的料液比為1:25g/ml，提取溫度為110℃，所述一定壓力為0.9mpa，提取時間為30min。
優選的是，所述的葡萄果實黃酮醇的綠色高效提取方法中，提取時所述葡萄果實凍干樣品粉末與水的料液比為1:20g/ml，提取溫度為100℃，所述一定壓力為1.1mpa，提取時間為30min。
優選的是，所述的葡萄果實黃酮醇的綠色高效提取方法，還包括：在采用所述亞臨界提取法于葡萄果實中提取黃酮醇后，還包括采取超臨界co2方法提取葡萄果實殘余物中的黃酮醇，具體方法包括：在超臨界狀態下通入二氧化碳，提取時間為5～15min，提取溫度為50～60℃，提取時壓力為0.3～0.5mpa。
優選的是，所述的葡萄果實黃酮醇的綠色高效提取方法中，在超臨界狀態下，通入的二氧化碳與葡萄果實凍干樣品粉末與水的料液混合物的體積比為1：8～10。
優選的是，所述的葡萄果實黃酮醇的綠色高效提取方法中，所述超臨界co2方法中，提取時間為10min。
優選的是，所述的葡萄果實黃酮醇的綠色高效提取方法中，所述超臨界co2方法中，提取溫度為55℃。
優選的是，所述的葡萄果實黃酮醇的綠色高效提取方法中，所述超臨界co2方法中，提取壓力為0.4mpa。
本發明至少包括以下有益效果：
本發明的方法，亞臨界水提取法可作為提取葡萄果實黃酮醇的有效方法，總黃酮醇的得率可達2.6％，較之傳統有機溶劑提取法提高23.3％。同時，在亞臨界水提取方法之后，采用超臨界co2方法繼續提取殘余物質，可進一步提高總黃酮醇的得率，使其得率高達2.8％，較之傳統有機溶劑提取法提高33.3％。本發明的方法不僅可有效提高葡萄果實黃酮醇得率，同時可有效避免傳統有機溶劑提取方法造成的環境污染及食品安全問題，對于促進葡萄果實黃酮醇提取物在食品工業及功能食品領域的應用具有重要意義。
本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
具體實施方式
下面對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
應當理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術語并不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。
亞臨界水提取法是近年來頗受關注的一種新興提取方法。其通過控制亞臨界水的溫度和壓力來改變水的黏度、極性和表面張力，從而提高其對提取物質的溶解能力。與現有其它提取方法相比，亞臨界水提取法具有提取時間短、提取效率高、提取成本低、安全無污染等特點，不失為一種環境友好型提取方法。但目前亞臨界水提取法在葡萄果實黃酮醇提取中未見報道。
本發明提供一種葡萄果實黃酮醇的綠色高效提取方法，包括：
取葡萄果實凍干樣品粉末，采用亞臨界水提取法于進行黃酮醇提取，提取時葡萄果實凍干樣品粉末與水的料液比為1:20～25g/ml，于提取溫度為100～110℃和一定壓力下提取時間為20～30min。
在本發明的其中一個實施例中，作為優選，所述一定壓力為0.9～1.1mpa。
在本發明的其中一個實施例中，作為優選，所述提取時所述葡萄果實凍干樣品粉末與水的料液比為1:25g/ml，提取溫度為110℃，所述一定壓力為0.9mpa，提取時間為30min。
在本發明的其中一個實施例中，作為優選，提取時所述葡萄果實凍干樣品粉末與水的料液比為1:20g/ml，提取溫度為100℃，所述一定壓力為1.1mpa，提取時間為30min。
在本發明的其中一個實施例中，作為優選，還包括：在采用所述亞臨界提取法于葡萄果實中提取黃酮醇后，還包括采取超臨界co2方法提取葡萄果實殘余物中的黃酮醇，具體方法包括：在超臨界狀態下通入二氧化碳，提取時間為5～15min，提取溫度為50～60℃，提取時壓力為0.3～0.5mpa。
在上述方案中，作為優選，在超臨界狀態下，通入的二氧化碳與葡萄果實凍干樣品粉末與水的料液混合物的體積比為1：8～10。
在本發明的其中一個實施例中，作為優選，所述超臨界co2方法中，提取時間為10min。
在本發明的其中一個實施例中，作為優選，所述超臨界co2方法中，提取溫度為55℃。
在本發明的其中一個實施例中，作為優選，所述超臨界co2方法中，提取壓力為0.4mpa。
為使本領域技術人員更好地理解本發明，還提供如下的實施例進行說明。
針對葡萄果實黃酮醇的傳統方法提取過程中有機溶劑殘留問題，本發明擬首先以葡萄果實為原料，以亞臨界水提取法為提取手段，分別以提取溫度、提取時間、提取壓力、料液比為實驗因素，以總黃酮醇得率為評價指標，通過4因素3水平正交實驗對亞臨界水提取法的工藝參數進行篩選，從而確定葡萄果實黃酮醇亞臨界水提取最佳工藝條件。同時通過與傳統有機溶劑提取法的黃酮醇得率進行比較，確定亞臨界水提取法是否為葡萄果實黃酮醇提取的有效方法。如下說明：
實施例1
1.實驗方案：
(1)原料準備：赤霞珠葡萄果實樣品采摘后，于2h內運回實驗室，經除梗、清洗后迅速冷凍干燥。凍干果實經粉碎后，過60目篩，制得凍干樣品。如無特殊說明實驗所需黃酮醇標準品(蘆丁/斛皮素/楊梅酮/山奈酚/異鼠李素/鼠李素/菲瑟酮/高良姜等均購于sigma有限公司，液譜檢測用試劑均為色譜純。
(2)儀器設備：biosafer-10a臺式凍干機(賽飛中國)，kcfd05-03型亞臨界反應釜(日本島津)；高效液相色譜儀(日本島津)
(3)黃酮醇提取方法：
a.亞臨界水提取工藝篩選：葡萄果實黃酮醇提取實驗在亞臨界反應釜中進行，準確稱取2.5g葡萄果實凍干樣品粉末置于反應釜中，以高溫蒸餾水為提取溶劑，經單因素實驗確定提取時間(10min,20min,30min)、提取溫度(100℃,110℃,120℃)、提取壓力(0.9mpa,1.0mpa,1.1mpa)和料液比(1:15g/ml,1:20g/ml,1:25g/ml)為實驗主要因素，以總黃酮醇得率為評價指標，通過4因素3水平正交實驗對亞臨界水提取法的工藝參數進行篩選，正交實驗因素水平見表1，正交實驗結果見表2。
b.傳統有機溶劑提取工藝：參照hertog等(1992)方法略加調整。準確稱取2.5g葡萄果實凍干樣品粉末加入50ml含1.2m鹽酸的50％的甲醇溶液中，于90℃冷凝回流4小時，待提取溶液冷卻后定容至100ml，超聲處理5min，室溫避光靜置2h后，取2ml提取液過0.45μm有機濾膜上液相色譜檢測黃酮醇含量。
(4)黃酮醇含量測定：參照fang等(2007)方法測定黃酮醇含量。采用德國merck公司lichrospher100rp-18e色譜柱(250×4.0mmi.d，5μm)，rp-18(10mm×4mm)保護柱。紫外檢測波長為360nm，柱溫為20℃，流速為1.0ml/min，進樣量為40μl，以峰面積外標法定量。流動相a：乙睛∶甲醇∶水∶四氫呋喃為19∶5∶76∶1(v/v)，ph值為3.0。流動相b：乙睛∶甲醇∶水為55∶15∶30(v/v)，ph值為3.0。洗脫程序：0～15min，2.0％b；15～28min，2.0％～28％b；28～40min，28％～36％b；40～44min，36％b；44～45min，36％～80％b；45～52min，80％b。
(5)總黃酮醇得率的計算公式(李加興等，2013)：
得率(％)＝提取所得黃酮醇化合物質量(g)/提取上述質量黃酮醇所需葡萄果實凍干粉質量(g)×100
2.實驗結果：
(1)亞臨界水提取條件篩選：
實驗結果表明，采用亞臨界水提取葡萄果實黃酮醇時，各因素對黃酮醇得率的影響順序為提取時間>料液比>提取溫度>提取壓力，當提取時間30min,料液比為1：25，提取溫度110℃，提取壓力0.9mpa時，黃酮醇最高得率可達2.6％，因此選擇提取時間30min,料液比1：25，提取溫度110℃，提取壓力0.9mpa為最佳提取工藝參數。
表1.正交實驗因素水平表
表2.正交實驗結果表
(2)亞臨界水提取與傳統有機溶劑提取結果對比
亞臨界水提取法與傳統有機溶劑提取對比結果見表3。由對比結果可見，與傳統有機溶劑提取法相比，亞臨界水提取法提取葡萄果實總黃酮醇的得率更高，雖然提取過程中所需提取溫度略高，但由于提取時間短，且提取過程中無有機溶劑參與，不僅可以有效降低能耗，而且可以徹底解決有機溶劑殘留問題，綠色安全環保。
表3.不同提取方法對葡萄果實總黃酮醇得率的影響
在確定了亞臨界水提取法為葡萄果實黃酮醇提取的有效方法后，本發明還進一步探討了在采用亞臨界水提取法提取葡萄果實中黃酮醇后，利用超臨界co2再次進行葡萄果實中黃酮醇提取的方法，為了本領域技術人員更好地理解本發明，提供如下的實施例進行說明。
實施例2
在實施例1中的表2正交實驗結果表的第4、7和8組的實驗后，繼續采用超臨界co2提取黃酮醇，并計算兩種方法聯合使用后，各組實驗中黃酮醇的總含量及總得率。各實施例中的參數如下表4所示：
表4超臨界co2提取黃酮醇
由上表可以看出，在利用超臨界co2再次進行葡萄果實中黃酮醇提取后，黃酮醇的總含量和總得率都得到了提高，且能夠在亞臨界水提取后，直接向殘留物質中通入二氧化碳，即可調整溫度進行提取，超臨界co2中黃酮醇提取中，co2用量少，提取時間短，提取溫度較低，并且壓力也較低，在亞臨界水提取方法后進行提取，各個參數易于調整，且也避免了能源浪費，并且進一步提取亞臨界水提取后葡萄果實殘余的黃酮醇，以提取到原料中盡可能多的黃酮醇。
這里說明的模塊數量和處理規模是用來簡化本發明的說明的。對本發明的葡萄果實黃酮醇的綠色高效提取方法的應用、修改和變化對本領域的技術人員來說是顯而易見的。
盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節。