本發明涉及一種高純度的沙棘黃酮類提取物及其制備方法。

背景技術：

沙棘，為胡頹子科多年生灌木或喬木植物沙棘hippophaerhamnoideslinn.的果實。沙棘為藥食同源植物。沙棘的根、莖、葉、花、果，特別是沙棘果實含有豐富的營養物質和生物活性物質，可以廣泛應用于食品、醫藥、輕工、航天、農牧魚業等國民經濟的許多領域。沙棘果實入藥具有止咳化痰、健胃消食、活血散瘀之功效?，F代醫學研究，沙棘可降低膽固醇，緩解心絞痛發作，還有防治冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的作用。

沙棘果實中含有多種維生素、脂肪酸、微量元素、亞油素、沙棘黃酮、超氧化物等活性物質和人體所需的各種氨基酸。研究發現，沙棘黃酮具有增加冠狀動脈血流量、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集、抗腫瘤、調節免疫系統、抗衰老等多種藥理作用。

當前市售的沙棘黃酮含量(或稱純度)規格一般在20％～65％，含量偏低，這不利于對沙棘黃酮的進一步研究。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種高純度的沙棘黃酮類提取物及其制備方法。

具體地，本發明提供了一種沙棘黃酮類提取物，所述提取物中總黃酮含量為80～95％w/w。

進一步地，所述提取物中總黃酮含量為85～94％w/w；其含量更進一步可以達到89～94％。例如，本發明具體實施方式中，總黃酮含量可以達到約89％或94％。

其中，所述總黃酮含量，是以蘆丁為對照品，采用alcl3比色法在270nm下檢測得到。

本發明所述“alcl3比色法”，為本領域對總黃酮含量測定的常規方法，可參照一般操作規程進行。

本發明還提供了上述沙棘黃酮類提取物的制備方法，它包括如下操作步驟：

(1)將沙棘果汁，冷凍干燥得沙棘果粉，乙醇超聲提取2.0～3.0h，超聲功率80～100w，提取溫度為50～80℃，乙醇體積分數為40～80％，料液比為3～7ml/g，提取次數為3次；

(2)取步驟(1)提取液，除去乙醇后，以水為溶媒，用苯乙烯型大孔吸附樹脂進行分離，采用體積分數60-80％乙醇進行洗脫，收集乙醇洗脫液，除去乙醇，干燥，即得沙棘黃酮類提取物。

進一步地，步驟(1)中，超聲提取2.0～3.0h，超聲功率為100w，提取溫度為65～75℃，乙醇體積分數為40～60％，料液比為5～7ml/g。

更進一步地，步驟(1)中，超聲提取2.5h，超聲功率為100w，提取溫度為65～68℃，乙醇體積分數為54～55％，料液比為5ml/g。為了便于操作，本發明一個具體實施方式中，采用的提取溫度為65℃，乙醇體積分數為55％。

進一步地，步驟(2)中，所述苯乙烯型大孔吸附樹脂為hpd-100、hpd-826、hpd-600或d101。

更進一步地，步驟(2)中，所述苯乙烯型大孔吸附樹脂為d101。

進一步地，步驟(2)中，洗脫用乙醇體積分數為80％。

在考慮到生產成本和效率的情況下，步驟(2)中，選擇使用動態吸附的方式，大孔吸附樹脂的上樣量在4bv(柱體積)以下，優選4bv；進一步地，上樣液室溫下吸附40～60min。

本發明還提供了上述沙棘總黃酮在制備一氧化氮合酶抑制劑或血管內皮生長因子抑制劑中的用途；所述一氧化氮合酶是誘導型一氧化氮合酶或/和內皮型一氧化氮合酶。

本發明中所述“除去乙醇”，是指盡可能地除去提取液或洗脫液中的乙醇，其中也包括了有少量乙醇殘留的情況。

本發明提供的沙棘黃酮類提取物中黃酮含量(或純度)顯著高于市售規格，為沙棘黃酮的進一步研究提供了有利條件；同時也為以沙棘黃酮作為活性成分的保健品或藥品提供了純度更高的提取物原料。

本發明沙棘黃酮類提取物的制備方法，僅僅使用了較為常見的醇提、大孔樹脂純化，沒有堿提酸沉或超臨界萃取等復雜的提取工藝，也沒有在大孔樹脂純化后再涉入進一步地的純化手段，這看似常規的技術手段，卻能夠在較短的時間內，在特定的提取、純化條件配合下，制備得到極高純度(80％w/w以上，甚至可以達到90～94％)的沙棘黃酮類提取物，取得了令人意想不到的效果。同時，本發明方法可以避免堿提酸沉中酸、堿可能帶來的開環、閉環或水解反應，也可以避免超臨界萃取的高成本，為高純度沙棘黃酮的制備提供了一種低成本且不易改變原黃酮成分結構的新方法。

本發明研究結果還表明，本發明提取物對enos、inos、血管內皮生長因子等的抑制作用較為明顯，同樣可以作為enos、inos或血管內皮生長因子抑制劑，在治療enos、inos或血管內皮生長因子過度表達的疾病(如動脈粥樣硬化)中發揮治療或輔助治療的作用。

顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其他多種形式的修改、替換或變更。

以下通過具體實施例的形式，對本發明的上述內容再做進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。

附圖說明

圖1不同超聲溫度對沙棘總黃酮取得率的影響

圖2不同提取時間對沙棘總黃酮提取得率的影響

圖3不同超聲功率對沙棘總黃酮提取得率的影響

圖4不同料液比對沙棘總黃酮提取得率的影響

圖5不同乙醇濃度對沙棘總黃酮提取得率的影響

圖6響應面圖形

圖7五種大孔吸附樹脂吸附率計算

圖8五種大孔吸附樹脂解析率

圖9大孔吸附樹脂靜態吸附動力學曲線

圖10大孔吸附樹脂靜態解析動力學曲線

圖11動態吸附曲線

圖12動態解析曲線

圖13泄漏曲線

圖14沙棘總黃酮對高血脂大鼠血清血脂的作用

圖15沙棘總黃酮對高血脂大鼠肝臟sod和mda的作用

圖16沙棘總黃酮對高血脂大鼠血清vegf和vcam-1的作用

圖17沙棘總黃酮對高血脂大鼠的作用inos和enosmrna水平的影響

圖18沙棘總黃酮對高血脂大鼠蛋白表達的影響

具體實施方式

本發明所用提取沙棘總黃酮的原料為沙棘果粉，是由沙棘果汁冷凍干燥所得。

實施例1本發明沙棘總黃酮提取物的制備

將沙棘果汁，冷凍干燥得沙棘果粉，乙醇超聲提取2.5h，超聲功率為100w，提取溫度為65℃，乙醇體積分數為55％，料液比為5ml/g，提取次數為3次，合并提取液，除去乙醇后，經蒸餾水溶解，上d101大孔吸附樹脂柱動態吸附，上樣量為4bv，室溫下吸附1h，選用60-80％乙醇進行洗脫，解析，收集洗脫液，便可得到純度在90％以上的沙棘黃酮類提取物。

試驗例本發明制備方法的條件篩選

一、單因素結合響應面法超聲提取高純度沙棘總黃酮的提取

1.1標準曲線的制作：

1.1.1采用alcl3比色法，測定效果較好，稱取蘆丁1.98mg,用甲醇溶解，定容于10ml的容量瓶中，從中吸取5ml，置于25ml的容量瓶中定容，然后準確吸取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml與6.0ml分別置于10ml的容量瓶中，加入5％的alcl3甲醇溶液1ml定容至10ml，混勻備用

1.1.2樣品處理：取干燥浸膏10mg,用甲醇溶液溶解，定溶于10ml的容量瓶中，精密量取2.0ml置于25ml的容量瓶中，加入5％的alcl3甲醇溶液1ml定容，混勻至10ml備用

1.2檢測波長確定：

將標準品在190nm至600nm進行全波長掃描，在417nm、270nm處有吸收峰，同理，將樣品在190nm至600nm進行全波長掃描，在270nm處有吸收峰，故選擇270nm處為檢測波長，并進行比較。

1.3標準曲線的制作：

將標準品依次在270nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并求回歸方程?；貧w方程：y＝0.0504x+0.0723，r²＝0.9998，在40～240μg/ml之內線性關系良好。

總黃酮提取率(％)＝(c*v/m)*100％

v定容體積，m為果粉質量c為黃酮含量

2單因素實驗結果

2.1超聲溫度對沙棘總黃酮提取率的影響

固定其它條件不變，在(乙醇濃度60％，超聲時間2h，超聲功率100w，料液比為1:5)提取三次的提取條件下，考察超聲溫度(40、50、60、70、80℃)對沙棘總黃酮得率的影響。

結果如圖1所示，超聲溫度從40℃到70℃之間時，沙棘總黃酮得率逐漸升高，超聲溫度到達70℃時，沙棘總黃酮的提取率可以達到最高，為8.2％，溫度為80℃時，提取率降低，這個現象主要是因為黃酮類化合物具有熱不穩定性，溫度超過70℃會使其分解。因此，當其他因素不變時，提取的最佳溫度為70℃。

2.2、超聲時間對沙棘總黃酮提取率的影響

固定其它條件不變，在(液料比1:5，超聲溫度50℃，乙醇濃度60％，超聲功率100w)提取一次的提取條件下，考察超聲時間(1h、1.5h、2h、2.5h、3h)對沙棘總黃酮得率的影響。

結果如圖2所示，沙棘總黃酮的提取率隨著超聲時間的增加而顯著增加，在2.5h的時候得率為最佳，3h時沙棘總黃酮的得率與2.5h相差不大，基本一致，由此可見，超聲時間應選2.5h。

2.3、超聲功率對沙棘總黃酮提取得率的影響

固定其它條件不變，在(液料比1:5，超聲溫度50℃，乙醇濃度60％，超聲時間2h)提取一次的提取條件下，考察超聲功率(20w、40w、60w、80w、100w)對沙棘總黃酮得率的影響。

結果如圖3所示，沙棘總黃酮得率隨著超聲功率的增大呈顯著升高趨勢，在功率為100w時，得率為5.85％。

2.4、超聲料液比對沙棘總黃酮提取率的影響

固定其它條件不變，在(超聲功率100w，超聲溫度50℃，乙醇濃度60％，超聲時間2h)提取一次的提取條件下，考察料液比(1:3、1:4、1:5、1:6、1:7)對沙棘總黃酮得率的影響。

結果如圖4所示，沙棘總黃酮的得率隨著料液比的增大呈上升趨勢，但是上升到一定程度時，上升趨勢減緩，如圖所示，當料液比在1:6時，提取率為60％，在1:7時，提取率為61％，因此，最佳的料液比應該選擇1:6.

2.5、乙醇濃度對沙棘總黃酮提取率的影響

固定其它條件不變，在(超聲功率100w，超聲溫度50℃，超聲時間2h、料液比1:5)提取一次的提取條件下，考察乙醇濃度(20％、40％、60％、80％、100％)對沙棘總黃酮得率的影響。

結果如圖5所示，乙醇濃度對沙棘總黃酮提取的得率有重要的影響，如圖所示，沙棘總黃酮的提取率隨著乙醇濃度的增加而增大，乙醇濃度增加到60％時，提取率為最大，當濃度升高到80％至100％時，提取率降低，這跟與所提的沙棘總黃酮中相關成分的極性相關，因此最佳的乙醇濃度應該為60％。

3響應面法提取

根據前期試驗篩選，本試驗主要研究超聲溫度、超聲時間、超聲功率以及料液比四個因素對響應值的影響，首先進行單因素試驗，單因素試驗只考察多個因素單獨對響應值的影響，不能反映出多個因素之間相互作用的影響；通過單因素預試驗，應用design-expert8.0軟件，設計4因素3水平的響應面試驗，利用響應面試驗結果，確定沙棘總黃酮粉提取的最佳提取條件。

3.1響應面實驗結果

3.1.1試驗因素與水平設計見表1

表1中心組合設計因素與水平表

以a(提取時間)、b(提取溫度)、c(料液比)、d(乙醇體積分數)為自變量，沙棘總黃酮含量為響應值(y)，進行響應面分析試驗，共有29個試驗，其中24個為析因試驗，5個為中心試驗，用以估計誤差。29組響應面試驗結果，見表2所示。對四個自變量模型，單獨存在及交互作用下的方差分析結果，見表3所示。

表2響應面試驗結果

表3擬合二次多項式模型的方差分

注:＊＊，p＜0.01，差異極顯著；*，p＜0.05，差異顯著。

通過對試驗結果進行響應面軟件分析，經二次回歸擬合后，得到沙棘總黃酮得率(y)與上述四個因素(a、b、c、d)之間的模擬方程為：y＝8.973+0.159a+0.584b-0.073c+0.19d-0.248ab+0.039ac+0.066ad+0.01bc+0.606bd-0.132cd-3.02a²-1.58b²-1.82c²-0.99d²。該回歸模型f檢驗為顯著(p＜0.01)，其失擬項在α＝0.05水平上不顯著，說明該模型較為可靠。其決定系數r²＝0.9972，說明該擬合方程與實際情況相符，且誤差較小，能充分反映出各因素與響應值之間的關系，其影響不是呈簡單的線性關系。通過該方程發現，各種因素之間存在著一定的交互作用，其中b、bd、呈顯著影響(p＜0.05)、a²、b²、c²、d²均呈極顯著影響(p＜0.01)，a呈顯著影響,c、ab、ac、ad、cd、bd之間的交互作用均不顯著。從單因素水平觀察，可以得出其影響順序為：b(提取時間)＞d(乙醇體積分數)＞a(液料比)＞c(提取溫度)。在有交互作用存在下，對沙棘總黃酮含量的影響順序為：bc＞bd＞ab＞cd＞ad＞ac。

3.1.2響應面分析

根據擬合模型繪制沙棘總黃酮提取得率響應面的三維圖與等高線，可直觀地看出響應面的最高點，即參數范圍內的極值以及因素間的相互作用對響應值的影響，依次可以確定最佳工藝參數范圍，design-expert8.0軟件處理后三維響應面和等高線圖,見圖6。從各因素之間兩兩相互作用的響應面圖形(圖6)觀察曲線走勢越平滑，其影響越??；圖形曲線走勢較陡，說明其影響最為顯著。由design-expert7.0軟件進行系統分析，得出影響沙棘總黃酮含量的最佳提取工藝條件為：液料比5ml/g、提取時間2.5h、提取溫度為67.17℃、乙醇體積分數為54.88％，此時沙棘總黃酮得率估計值為90.19％。

3.1.3工藝驗證

綜合考慮時間、成本等因素，對工藝參數進行了一定的修正，確定適宜的提取工藝條件為:超聲時間為2.5h，超聲溫度為65℃，乙醇體積分數為55％，料液比為5ml/g、在此條件下，沙棘總黃酮平均提取得率為9.02％，與預測值基本吻合。

4結論

通過box-behnken中心組合試驗設計得到超聲提取沙棘總黃酮的優化工藝條件:超聲時間為2.5h，超聲溫度為65℃，乙醇體積分數為55％，料液比為5ml/g,沙棘總黃酮平均提取得率為9.02％。結果表明，采用響應面法優化沙棘總黃酮的提取工藝條件具有實際應用價值，為沙棘總黃酮的進一步開發利用提供了理論依據

二、純化工藝

選取hpd-100，hpd-826，hpd-600，d101，ab-8五種大孔吸附樹脂，首先進行樹脂的預處理，d101，ab-8兩種樹脂可用乙醇浸泡24h，放出浸液，再用蒸餾水洗滌，洗至洗滌液加水不渾濁，無醇味，再用5％的hcl泡3h后蒸餾水洗至中性，再用2％的naoh泡3h水洗至中性，用蒸餾水浸泡備用。hpd系列樹脂，洗去細小樹脂以及破碎的樹脂，乙醇浸泡4h，放出浸出液，加水不渾濁為止，再用蒸餾水洗至無醇味，用蒸餾水浸泡待用。

(1)大孔吸附樹脂吸附率測定

稱取處理好的各種樹脂1.0g，用濾紙吸干表面水分，裝入具塞三角瓶中，加入提取液50ml，樣品濃度(c0為125.733mg/ml),于25℃100r/min恒溫振蕩24h，充分吸附后過濾，測定濾液中的黃酮含量，并按照下列公式計算各樹脂吸附率，解析率，樹脂吸附容量。

吸附率(％)＝(c0﹣c1)/c0×100％吸附容量(mg/g)＝(c0﹣c1)v/m

c0：吸附前溶液黃酮初始濃度c1：吸附后溶液中黃酮剩余濃度

m：樹脂質量v：黃酮溶液體積

由圖7可知，試驗所選取的五種大孔吸附樹脂對于沙棘總黃酮的吸附率實驗效果都比較好，其中，hpd系列和d101樹脂的吸附率都較高，可以達到80％以上。ab-8樹脂的吸附率較低為75％。

(2)大孔吸附樹脂的解析率測定

取吸附好的飽和樹脂各1.0g，加入50ml(95％)乙醇，于25℃100r/min恒溫振蕩器24h，充分解析后，過濾測定濾液中的黃酮濃度，計算各樹脂的解析率。公式：解析率(％)＝c2/(c0﹣c1)×100％

c2解析液中黃酮的濃度

由圖8可知，五種大孔吸附樹脂的解析效果都較好，均可以達到65％以上。

(3)大孔吸附樹脂的靜態吸附動力學特性測定

根據吸附率與解析率的比較，選取三種樹脂進行吸附動力學測定，進一步篩選出最佳樹脂，準確稱取四種樹脂各1.0g，吸干表面水分，裝入具塞三角瓶中，加入黃酮溶液50ml，于25℃100r/min恒溫振蕩，每隔0.5h取樣，測定黃酮含量，計算各樹脂吸附量，繪制靜態吸附動力學曲線。

選擇的三種大孔吸附樹脂的靜態吸附動力學曲線如上圖所示，d101樹脂隨著時間的增長，吸附量逐漸增大，hpd-100以及hpd-826樹脂的吸附量隨時間的增長變化不大，到達三個小時的時候，兩種樹脂吸附的沙棘總黃酮的量基本接近，大大低于d101型大孔樹脂。

(4)靜態吸附與解析實驗

稱取各樹脂1.0g，加入黃酮提取液50ml充分吸附后過濾，取濾液，測黃酮濃度計算吸附率，向吸附后飽和的樹脂中加入不同濃度的乙醇溶液50ml，充分解析后過濾，測定解析液中黃酮濃度，并計算不同濃度的乙醇溶液對黃酮的解析率。

由圖10可知，所選取的三種大孔吸附樹脂的靜態解析效果差別不大，解析量都隨著乙醇濃度的增大而增大。乙醇濃度在80％的時候解析率達到最大，而后依次減小。

(5)動態吸附與解析實驗

1)取適量大孔吸附樹脂，濕法裝入玻璃柱中，將濃度為0.1257mg/ml的黃酮溶液上樣，以1.0ml/min流速進行吸附，對流出液進行收集，每5ml收集一管，檢測每一流分沙棘總黃酮的濃度，以流出液體積為橫坐標，沙棘總黃酮濃度為縱坐標，繪制吸附曲線。

2)吸附結束后，用95％的乙醇溶液，以1.0ml/min流速進行洗脫，每5ml收集一管，檢測每一流分沙棘總黃酮的濃度，以流出液體積為橫坐標，沙棘總黃酮濃度為縱坐標，繪制洗脫曲線。

由圖11可見，吸附的過程中，d-101型樹脂在15min時，吸附率顯著增大，20min時達到最大值，隨后與其他兩種樹脂相同；根據圖12動態解析實驗圖示可見，三種樹脂的解析效果隨時間的變化基本一致。

上述試驗中，d101大孔吸附樹脂具有較好的分離沙棘黃酮類物質的效能，因此，選取d101型大孔吸附樹脂進一步進行上樣量以及重復試驗和驗證試驗，

(6)上樣質量濃度的考察:

將提取得到的沙棘黃酮類樣品稀釋，分別通過d101型大孔吸附樹脂,保持上樣量和體積流量相同,考察不同的上樣質量濃度對大孔吸附樹脂吸附效果的影響,結果見表4。

表4不同上樣質量濃度對吸附效果的影響

結果表明不同上樣質量濃度對d101型大孔吸附樹脂的吸附行為影響不大,因此選擇沙棘黃酮提取物直接上樣,有利于操作。

(7)泄漏曲線的繪制:

按上述所確定的吸附條件,進行動態吸附,分段收集流出液。每份10ml,收集25份。以測定沙棘總黃酮質量濃度為考察指標,繪制泄漏曲線,結果見圖13。可以看出,當上樣大約40～50ml(4～5bv)時,沙棘總黃酮就已經明顯泄漏了,因此確定最大上樣量為4bv的樣品液。

(8)樹脂重復使用次數的考察:

按照上述所確定的吸附和洗脫條件,取樣品液進行上柱、吸附、洗脫,在同一根樹脂柱上重復操作4次,分別計算4次總黃酮吸附量,結果第4次使用時沙棘總黃酮吸附量已明顯下降,說明d101型大孔吸附樹脂重復使用3次后,需要再生才可繼續使用。

(9)驗證試驗

按照上述所確定的純化沙棘總黃酮吸附和洗脫條件,取樣品液進行上柱、吸附、洗脫,沙棘總黃酮的質量分數93.89％,回收率為81.11％?？梢钥闯?經d101型大孔吸附樹脂純化后,沙棘總黃酮的出膏率明顯減低,除雜效果好,質量分數達到90％以上。

2.3結論

從上述實驗的結果可知，hpd-100，hpd-826，hpd-600，d101，ab-8五種樹脂均具有的純化沙棘總黃酮的作用，通過試驗篩選，綜合各個性能指標以及后續驗證試驗，最終的工藝流程為：選取本實驗提取工藝提取的沙棘黃酮類提取物，經蒸餾水溶解，d101大孔吸附樹脂柱動態吸附，最大上樣量為4bv，室溫下吸附40min～60min，選用80％乙醇進行洗脫，解析，收集洗脫液，便可得到純度在90％以上的沙棘黃酮類提取物。

試驗例1本發明高純度沙棘黃酮類提取物對血管內皮保護活性的機制研究

1.材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物

4周齡spf級sd雄鼠(合格證no.62001000000134)60只，90±10g，購于甘肅中醫藥大學。

1.1.2儀器及試劑

eyelan1100旋轉蒸發儀，梅特勒ms105型電子天平，hc-3018r冷凍離心機，酶標儀，紫外分光光度計，大孔吸附樹脂，膽固醇，膽鹽，丙基硫氧嘧啶，吐溫-80，蒸餾水，生理鹽水，高脂飼料(北京科奧協力公司)；tc，tg，hdl，ldl，sod，mda，vegf，vcam-1試劑盒(南京建成)；水浴鍋，酶標儀，離心機，無水乙醇(天津百世化工有限公司)；enos、inos、lox-1、icam-1、gapdh(abcam)，羊抗兔hrp標記二抗，羊抗鼠hrp標記二抗(碧云天)。

1.1.3沙棘總黃酮的制備：

新鮮沙棘果，采自青海省玉樹及果洛地區(96.97°e、33.03°n,100.23°e、34.48°n)。將5kg沙棘果汁冷凍干燥，得2kg干燥果粉，用70％乙醇以料液比1:3，在60℃提取3次，每次兩小時，濃縮濾液得到1kg，將所得浸膏溶解于蒸餾水中，用d101大孔吸附樹脂進行分離，50％-70％的乙醇進行洗脫，最后得到精制沙棘總黃酮35g，測得最終的沙棘總黃酮中黃酮含量為89.98±0.032％。所述總黃酮含量，是以蘆丁為對照品，采用alcl3比色法在270nm下檢測得到。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物造模及給藥

高血脂模型建立：購買動物后，正常飲食適應三天后，隨機分為正常對照組(縮寫為nc)，模型對照組(縮寫為mc)，陽性對照組(縮寫為pc)，沙棘總黃酮低、中、高劑量組(縮寫為vph、vpm、vpl)，正常對照組給與基礎飼料，其余均給予高脂飼料6周，并于隔天給予脂肪乳劑4周，12小時交替照明，高脂飼料配方為：12％豬油、10％蛋黃粉、5％膽固醇、1％膽鹽、0.2％丙基硫氧嘧啶、71.8％基礎飼料；脂肪乳劑配方為：10％豬油、5％膽固醇、1％膽鹽、0.2％丙基硫氧嘧啶、1％吐溫-80、其余為蒸餾水。造模過程中，每周隨機抽取兩只動物，眼底靜脈取血，檢測血脂指標，驗證模型建立情況。造模第七周開始給藥，灌胃(i.g)給予藥物5周，沙棘總黃酮高、中、低劑量組劑量分別為7mg/kg、14mg/kg、28mg/kg，以辛伐他丁為陽性對照藥，劑量為0.3mg/kg；同時給與空白對照組和模型組蒸餾水；試驗期間，記錄各組大鼠飲食、飲水以及體重。

1.2.2血清參數檢測

灌胃給藥5周后，將各組大鼠禁食禁水12小時，腹腔注射20％烏拉坦0.5ml/kg，腹主動脈取血，4000r/min離心，取血清。采用tba比色法檢測肝臟丙二醛(mda)含量，wst-1法檢測肝臟超氧化物歧化酶(sod)活力；測定總膽固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白(hdl)以及低密度脂蛋白(ldl)。檢測血管內皮生長因子(vegf)和血管細胞粘附因子(vcam-1)。

1.2.3大鼠主動脈形態變化觀察

樣品經3％戊二醛預固定，1％四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，epon812包埋，半薄切片光學定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，日立h-600iv型透射電鏡觀察。

1.2.4主動脈enos以及inosmrna水平檢測

1.2.4.1總rna提取：實驗動物取血后，取下胸主動脈，輕柔分離周圍組織，置于生理鹽水中清洗干凈，切成小段，取組織或者細胞于1ml的trizol的勻漿管中，于勻漿機勻漿20sec，置于超凈臺中，溫育5min，12000r/min，離心10min；吸上清于新的1.5ml離心管中，加入200μl的氯仿，搖勻，室溫靜置2min，4℃，12000r/min，離心10min；吸取上清于新的1.5ml離心管中，加入600μl的異丙醇，混合均勻，室溫靜置15min，4℃，12000r/min，離心15min，棄上清；加入1ml75％的無水乙醇(750μl無水乙醇+250μldepc水)漂洗沉淀，4℃，12000r/min，離心5min，棄上清；加入1ml無水乙醇，漂洗沉淀，4℃，12000r/min，離心5min，棄上清，室溫干燥10min；加入40μl的depc水溶解rna，置于-80℃冰箱保存備用。

1.2.4.2cdna第一條鏈的合成：消除總rna中的dna，用反轉錄試劑盒在相應體系中反應。

1.2.4.3pcr擴增，將制備好的cdna進行pcr擴增。引物序列如下：

表5rt-pcr引物序列

1.2.5主動脈enos以及inos以及lox-1，icam-1蛋白水平檢測

將切成小塊的血管，加入蛋白裂解液裂解組織、勻漿、離心，取上清液，用bca蛋白分析試劑盒檢測樣品總蛋白濃度。提取蛋白用5×蛋白上樣緩沖液于100℃變性5min。用10％sds-page電泳分離蛋白，每泳道上樣蛋白量為80μg。用半干轉印槽(biorad，usa)轉印蛋白至pvdf膜上，之后用5％脫脂奶粉室溫下封閉2h，分別加入兔抗enos，inos，lox-1，icam-1兔抗gapdh(1:1500)，于4℃孵育過夜。洗膜后加入經辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1:1000)，室溫孵育2h，之后使用ecl液發光顯影，掃描膠片后，采用imagej軟件對凝膠圖像蛋白表達條帶積分光密度值進行分析，并計算enos，inos，lox-1，icam-1與gapdh條帶積分光密度值的相對比值。

2實驗結果

2.1實驗大鼠體重變化

造模后，給予高脂飼料大鼠體重值顯著高于正常對照組大鼠的體重，給藥后，各個藥物組體重增長速度降低，給藥第二周藥物組體重增長顯著下降，沙棘總黃酮高劑量組和中劑量組的大鼠體重增長低于正常對照組，差異顯著；說明沙棘總黃酮有抑制體重增長的作用，具體的結果請見表6。

表6.沙棘總黃酮高血脂大鼠體重的影響

注：與模型組比較，^▲p＜0.05，^▲▲p＜0.01.

2.2大鼠主動脈形態觀察結果

在電鏡下觀察各實驗組大鼠主動脈結構，其中，模型組大鼠內皮細胞呈現一系列不正常的表現，染色質聚集，儲量了一些泡沫細胞，而且細胞結構不清晰，并出現內皮脫落的現象，伴有線粒體腫脹；在平滑肌細胞上，也可觀察到一些空泡細胞。和模型組相比較，正常組大鼠的內皮細胞和平滑肌細胞幾乎觀察不到上述情況，細胞結構完整清晰，細胞器結構正常。此外，用藥的各個劑量組和陽性對照組可見到少量的泡沫細胞，相比模型組有一定的改善，沙棘總黃酮的低中劑量組和陽性對照組也可見一定程度的線粒體腫脹，綜合各個組的形態學比較，實驗發現沙棘總黃酮高劑量組的細胞形態較好，能有效改善抑制高血脂引起的主動脈形態學變化。

泡沫細胞是指吞噬了脂質的單核細胞或組織細胞，其胞漿中含有許多脂滴，是動脈粥樣硬化斑塊內出現的特征性病理細胞，主要來源于血液單核細胞與血管中膜平滑肌細胞。泡沫細胞形成是動脈粥樣硬化形成的早期事件。

2.4血脂變化

沙棘總黃酮對高血脂大鼠血清血脂的影響見圖14。造模后，模型組血清血脂指標顯著升高，tc，tg以及ldl升高，分別為(2.25±0.2，0.627±0.03,0.399±0.03)mmol/ml，hdl降低，值為0.486±0.02；在連續給藥五周后，給藥組大鼠血清tc，tg，ldl較模型組顯著下降，hdl顯著升高，差異具有統計學意義；且各劑量組之間呈劑量效應關系；相比較而言，沙棘總黃酮各劑量組的降血脂作用優于陽性對照組，沙棘總黃酮中高劑量組血脂水平與正常組相近。本實驗結果說明沙棘總黃酮能顯著降低高脂血癥大鼠血清tc，tg，ldl三項指標，而對大鼠血清hdl升高有促進作用。

2.5肝臟sod及mda含量測定

沙棘總黃酮對高血脂大鼠肝臟sod以及mda的影響見圖15。如圖，模型組的sod降低而mda升高，經過沙棘總黃酮的干預，各個劑量組的肝臟sod和mda均改善，呈劑量效應關系。

2.6血清vegf和vcam-1水平

沙棘總黃酮對高血脂大鼠血清vcam-1和vegf的影響見圖16。如圖，模型組的vcam-1和vegf兩項指標均升高，經過沙棘總黃酮的干預，各個劑量組的vcam-1和vegf顯著降低，呈劑量效應關系。

2.7rt-pcr

通過rt-pcr檢測inos與enos的mrna表達水平，結果見圖17。結果顯示，模型組主動脈血管inos與enos表達水平都顯著高于其他各組，經過沙棘總黃酮以及陽性對照藥物的干預作用，藥物組和陽性組的表達水平均降低，其中和模型組相比，中高劑量組的差異顯著。

2.8westernblot

westernblot實驗結果見圖18，inos與enos的蛋白表達水平與mrna表達水平一致。模型組降低，各個藥物組表達水平依次升高，呈劑量效應關系。

3、結論

因此，本研究結果表明與正常組相比，模型組大鼠血脂水平顯著增強，抗氧化能力降低，主動脈損傷。而沙棘總黃酮可以抑制inos、enos、vegf的表達，通過調節enos/no以及inos/no通路、以及抗氧化能力改善長期高脂飲食引起的機體主動脈內皮功能紊亂及損傷。

當然，本發明提取物對enos、inos、血管內皮生長因子等的抑制作用較為明顯，同樣可以作為enos、inos或血管內皮生長因子抑制劑，在治療enos、inos或血管內皮生長因子過度表達的疾病中發揮治療或輔助治療的作用。

sequencelisting

<110>中國科學院西北高原生物研究所

青海大學

<120>一種沙棘黃酮類提取物及其制備方法

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>enos基因正向引物序列

<400>1

ctttcggaaggcgtttgac19

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>enos基因反向引物序列

<400>2

aactcttgtgctgctcagg19

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>inos基因正向引物序列

<400>3

aggcttgggtcttgttag18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>inos基因反向引物序列

<400>4

ttgttgggctgggaatag18