本發明涉及用于獲得蜂膠衍生物的方法，所述蜂膠衍生物中變應原性物質的含量降低，從而使得其大量使用而對人健康沒有禁忌癥；處理生蜂膠(rawpropolis)或其衍生物的方法；以及有利地用于營養保健(nutraceutic)和美容領域的蜂膠水醇性衍生物。由蜜蜂((apismellifera))產生的蜂膠得自植物樹皮和葉芽(例如，楊樹、山毛櫸、樺樹、栗樹、松樹等)的樹脂滲出物，蜜蜂通過其唾液分泌和添加蠟來對所述滲出物進行采集和處理。在室溫下，蜂膠表現為粘性的可塑性物質，具有芳香氣味和取決于植物來源的不同顏色。蜂膠的化學組成取決于樹脂滲出物的植物來源，以及來源地區和采集季節。來自楊屬(populusgenus)植物的蜂膠由樹脂(20％～55％)、蠟(30％～40％)、揮發油(5％～10％)和多種酚類化合物(10％～30％)(尤其是包含類黃酮)組成。酚部分還包含苯烷基酸(例如，肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸和對香豆酸)及其一些酯。由于其中一些組分，蜂膠具有多種生物和藥理特性，包括抗細菌、抗病毒、抗真菌、抗炎、抗氧化、免疫刺激、止齲(cariostatic)、抗腫瘤和抗幽門螺旋菌(helicobacterpylori)活性(lg.coelho等，″braziliangreenpropolisonhelicobacterpyloriinfection.apilotclinicalstudy″，helicobactervol.12：572-4(2007))。對于這些特性，長久以來，已知在常用藥中使用基于蜂膠的制劑，并且主要應用涉及治療呼吸道感染、流感、痤瘡、創傷、燒傷、皰疹、牙齦炎和口炎以及預防齲齒。蜂膠還用于美容領域用于配制霜劑、軟膏劑、洗發劑、洗劑、凝膠劑等。但是，除多種有益作用外，使用蜂膠可在特別敏感的人群中引起一些不希望的作用，例如口干、輕度胃紊亂和變應性皮膚反應(變應性接觸性皮炎)(contactdermatitis，vol.17：163(1987)；pediatr.dermatol.vol.22：1(2005)；contactdermatitis，vol.51：255(2004))。近期研究(f.giusti，″sensitizationtopropolisin1255childrenundergoingpatchtesting″；contactdermatitis，vol51：255-258(2004))表明，這些變態反應可歸因于定義明確的蜂膠組分的混合物，稱為lb-1，其由咖啡酸及其通式(1)的一些酯組成。其中，r可以是：3-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、芐基和苯乙基。這些化合物以不同百分比存在于lb-1級分中，例如3-甲基-2-丁烯基咖啡酸酯(54％)、3-甲基-3-丁烯基咖啡酸酯(28％)、2-甲基-2-丁烯基咖啡酸酯(4％)、咖啡酸苯乙酯(8％)、咖啡酸芐酯(1％)和咖啡酸(1％)(degroota.c.，weyl和j.w.，naterj.p.，unwantedeffectsofcosmeticsanddrugsusedindermatology，pp.770，elsevier，ny，1994)。如foodchem.toxicology，vol.36：34763(1998)中所報道的那樣，在這些化合物中，3-甲基-2-丁烯基咖啡酯表現出最大的變應原性作用。蜂膠還包含3-甲氧基咖啡酸(或阿魏酸)和3，4-二甲氧基咖啡酸酯，但并不認為它們具有變應原活性(contactdermatitis，vol.23：274-75，(1990))。為了消除蜂膠的變態反應，已提出了一些方法，例如專利文件wo2009/133073所述的方法，其中公開了用于獲得有效的低變應原性蜂膠提取物的化學或物理化學方法。該方法包括一系列步驟，包括在高于25℃的溫度下用溶劑(例如，醇與水的混合物)進行蜂膠提取，在等于室溫的反應溫度下進行對不溶性物質的第一分離，在低于0℃的溫度下進行對不溶性物質的第二分離，以及除去提取介質。然而，該方法有一些缺點。首先，工作時間通常較長，尤其是因為通過該方法提供的溫度下降必須逐漸地發生，以允許使基本上不溶的物質形成和定量沉淀，從而需要進行仔細和準確的監測。因而，需要在溫度控制中保證高準確性的設備和/或植物。另一缺點是無法通過沉淀和過濾完全除去不溶性物質，如已知的那樣，因為每種化合物在溶劑中都有特定的溶解度，即使非常低。因此，為了獲得最好的結果，必須重復沉淀和過濾步驟。那么清楚的是生產成本明顯很高。此外，因為上述方法不是選擇性的，所以其不能保證維持所得提取物的生物/藥理效力。而專利申請wo2009/133073中公開的方法沒有示出蜂膠中變應原性物質含量的有效降低。用于除去蜂膠的變應原性反應的另一方法公開于日本專利申請no.7-8185中，其教導了從蜂膠中除去一些變應原性物質而不影響其藥理特性和引起變應原性的酶促方法。在這些現有技術文件中，認為變應原性物質是咖啡酸的一些酯，更具體地是咖啡酸異戊二烯酯(isoprenylcaffeateacid)和咖啡酸苯乙酯，其通過水解酶或氧化還原酶而被酶促地除去。所述水解酶優選為酯酶，并且更優選羧酸酯酶，而所述氧化還原酶優選為漆酶(laccase)、酪氨酸酶、酚酶(phenolase)、膽紅素氧化酶或過氧化物酶。根據jp-7-8185，選擇具有高特異性的酶，并且應當準確地選擇酶，蜂膠降解獲得了非期望的化合物。為了說明根據jp-7-8185的該理論，將標準品和蜂膠與酶一起孵育，提取之后，通過lc-uv或gc-fid評價了咖啡酸異戊二烯酯和咖啡酸苯乙酯的殘余量。由jp-78185教導的方法的限制既是概念上的也是方法上的。事實上，漆酶、酪氨酸酶、酚酶、膽紅素氧化酶或過氧化物酶是非特異性氧化還原活性酶。實際上，這些酶具有包括酚殘基或兒茶酚殘基在內的底物，其分別變為醌或二醌，導致產物連續聚合。jp-78185教導進行凝膠滲透(lc-gpc-uv)以檢測酶促反應后聚合物的產生。但是，每種類黃酮(蜂膠的活性級分)都包含酚殘基或兒茶酚殘基。因此，類黃酮還被氧化還原酶高度地降解。在下文中示出了類黃酮的結構，其中，氧化還原活性酶可攻擊酚殘基或兒茶酚殘基。根據jp-78185，未對酶促反應之前和之后的類黃酮含量進行評價，因此，無法知道其含量是如何變化的。此外，變應原性物質(即，咖啡酸異戊二烯酯和咖啡酸苯乙酯)的劑量是以特異性較差的方法進行的，對于蜂膠樣品的分析來說更尤其是如此。已通過帶有氫火焰離子化檢測器(fid)的氣相色譜進行了評價，其能夠僅通過比較化合物的保留時間而鑒定所述化合物。鑒于蜂膠的復雜結構以及變應原性物質是蜂膠的一小部分，通過液相色譜(hplc-uv)進行的測定幾乎不可靠，因此，為了正確地對它們進行鑒定和定量，必須采用靈敏且準確的方法，以防止蜂膠的活性部分(例如，類黃酮)也被除去。同樣，jp-78185中使用的用于引起底物與酶反應的方法也有問題。首先，將蜂膠在乙醇中分散一周，隨后，用水將酒精度(alcoholicdegree)降低至10％。使一小部分液體(即，10ml)與酶(100mg)反應，8小時之后，將混合物蒸餾并通過氣相色譜進行分析。根據該現有技術文件，必須將酒精度降低以使酶起作用。如果溶液整體是乙醇性的，那么酶可被變性，導致其活性大幅降低。此外，jp-7-8185中使用的酶非常昂貴，因為它們是工業上獲得的。因此，很明顯的是，該方法不能被工業化，因為乙醇和酶都非常昂貴。此外，根據jp-7-8185，對于每克蜂膠，酶的用量為0.1至0.5g，或者如果孵育時間為1至3天，那么酶的用量為10至50g。因此，由jp-7-8185教導的方法除了昂貴之外，持續時間還很長而且不符合工業需要。ep-0109993教導了通過以下方法制備蜂膠的純化提取物：在1至10天的時間間隔中用有機溶劑進行提取，冷卻并過濾如此獲得的懸液。然后將濾液用于制備不同的制劑。由于這種方法，所得提取物在水中不分散，因為大量溶劑將脂肪部分(包括存在于蜂膠中的蠟部分)保留在溶液中。提取所需的時間范圍為1至10天，該事實與缺少溫度控制一起使該方法在工業規模上的適用性很差。因此，如此獲得的提取物不是標準化的或者不可標準化。ep-0109993還教導了使用乙醇濃度為10至25％體積/體積的水性乙醇溶液對生蜂膠進行提取，以獲得水溶性提取物。cn-1162613和wo-2009/133073公開了通過以下順序獲得的蜂膠的水醇提取物：用乙醇對生蜂膠進行提取以獲得懸液，過濾以除去殘余固體，將溶液冷卻至0℃或更低，將懸液過濾以除去不溶性物質并獲得純化的提取物。如此獲得的提取物在活性成分含量上或在脂肪量上都不是標準化的。在提取過程結束時，如果將溶劑(乙醇)蒸發(即，從提取物中除去)，則隨后加入新乙醇以獲得滴定提取物(titredextract)，這會過度浪費昂貴的材料。顯然，該方法不能以工業規模進行，因為乙醇是非常昂貴的工業產品，并且其在該過程中將發生蒸發并因而被浪費。根據上述現有技術文件中所描述的方法，其不能先驗地建立并且從而使蜂膠中活性成分的含量標準化。此外，雖然據稱除去了變應原性物質，但沒有報道對其含量之實際評價的任何分析，因此，這種除去未被證實。本發明的主要目的是提供一種用于除去或顯著降低包含于固體生蜂膠中的變應原性組分的方法。本發明的另一目的是提供一種處理和純化蜂膠的方法，其保留生蜂膠特有的感官特征以及活性成分含量。本發明的另一目的是提供可分散于水中的蜂膠提取物；即，其中脂肪物質(例如，蠟)的量極度降低。本發明的另一目的是對于生蜂膠的生產人員和終端使用者而言，該工藝和方法完全安全。本發明的另一目的是提供用于處理和純化蜂膠的合算的可行方法。本發明的另一目的是提供通過本發明方法獲得的經預處理的蜂膠衍生物。本發明的另一目的是提供如通過本發明的純化方法獲得的蜂膠水醇性衍生物。附圖說明：圖1顯示了孵育溫度對咖啡酸酯降解的作用。圖2顯示了孵育時間對咖啡酸酯降解的作用。圖3顯示了乙醇百分比對肉桂酰酯酶活性的作用。圖4顯示了3-甲基-2-丁烯基咖啡酸酯的降解取決于細菌細胞數。圖5顯示了用lh5處理生蜂膠24小時后變應原性酯的降解。發明詳述本發明的一個相當重要的目的是提供蜂膠的水醇性衍生物，用于營養保健和美容領域而沒有因變應原活性而引起的禁忌癥。根據本發明的第一方面，提供了一種用于預處理蜂膠的方法，該方法使包含通式(1)的至少一種變應原性物質的蜂膠與包含至少一種具有選擇性肉桂酰酯酶活性之酶的益生微生物反應以獲得基本上缺乏或耗盡變應原性物質的半固體蜂膠衍生物，在通式1中，r是烷基或烯基，其選自包含以下的組：3-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、芐基以及苯乙基。根據本發明的另一方面，提供了通過本發明方法獲得的蜂膠的半固體衍生物，其具有比生蜂膠更低的一種或更多種變應原性物質含量，所述含量低于0.5％。該降低大于60％。根據本發明用于預處理生蜂膠的方法旨在降低上文中報道的通用結構式(1)的變應原性化合物的含量。該方法基本上包括以下工作步驟，包括：使生蜂膠或基于蜂膠的制備物與包含具有選擇性肉桂酰酯酶活性之一種或更多種酶的特定微生物相接觸并反應，以獲得半固體狀態的衍生物。有利地，具有選擇性酯酶活性的所述酶包含至少一種肉桂酰酯酶。具有酯酶活性的酶(尤其是肉桂酰酯酶)得自乳桿菌屬(lactobacillus)、肉桿菌屬(carnobacterium)、腸球菌屬(enterococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)和雙歧桿菌屬(bifidobacterium)的細菌，其中的一些列于下文中的表1中，其中還示出了其來源。表1.其中存在具有酯酶活性之酶的微生物優選地，肉桂酰酯酶由乳桿菌屬和腸球菌屬的多種細菌種產生，具體地由以下種的細菌菌株產生：瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、發酵乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、糞腸球菌等。優選地，肉桂酰酯酶由稱為lh5之乳品源的瑞士乳桿菌菌株產生。因此，本發明方法的反應步驟包括：-將數目大于104、優選為104至1020且更優選為1016的細菌細胞(例如，瑞士乳桿菌細胞)接種到生蜂膠或其產物中；通過在合適的培養基(例如，manrogosashape(mrs)或腦心浸液(brainheartinfusion，bhi))中培養細菌而后通過離心除去任何上清液而獲得接種物；-添加乙醇水溶液以獲得反應混合物(通常為懸液)，其中乙醇存在的百分比為按體積計低于100％，優選在5％至20％的范圍內，且優選為約10％；以及，-在20℃至47℃、優選30℃至42℃、更優選在37±2℃下，將反應混合物孵育30分鐘至72小時、優選24小時，以獲得通常為半固態的衍生物。有利地，本發明方法使用的乙醇水溶液包含濃度優選地低于40％v/v、更優選20％v/v的一種或更多種分散劑，例如聚乙二醇(peg)，優選聚乙二醇400(peg400)。優選通過下文中描述的分光鏡(spectroscopic)和分光計(spectrometric)分析法來確定由本發明方法獲得的蜂膠衍生物的定性和定量組成。具體地，使用uplc分析法進行咖啡酸酯的定量測定，而采用hplc分析法測定類黃酮含量。實際進行本發明的酶促方法涉及確定下列操作條件：1.選擇合適的細菌菌株；2.確定對于生蜂膠來說酯酶活性的最佳溫度；3.確定最適宜的細菌細胞孵育時間；4.確定待用于第一步驟的最佳乙醇百分比；5.確定每克蜂膠中細菌細胞的最佳數目；6.合成作為參照分析標準物的通式(1)的酯化合物；7.將在下文中詳述的操作條件。根據本發明的另一方面，提供了一種用于純化生蜂膠或如上所述獲得的半固體蜂膠衍生物的方法，其依次包括以下步驟：-將生蜂膠或經酶促預處理的蜂膠通過極性有機溶劑熱溶解，以獲得分散體，所述極性有機溶劑優選乙醇，更優選60％至90％乙醇，且更優選90％乙醇。-將如此得到的分散體冷卻至室溫，以形成固體顆粒在有機溶劑中的懸液；-過濾固體顆粒以使其與懸液分離，以獲得濾液；然后進行包括以下的至少一個循環：-對濾液進行化學分析以測定酒精測定體積滴度(alcoholimetricvolumictitre)(或酒精度)、干殘余物和按重量計的類黃酮濃度；-用水稀釋濾液以調節酒精測定體積滴度；-將濾液冷卻至低于0℃的溫度，保持8至30小時的時間，從而獲得分散體；-將分散體與任何不溶性物質分離，以分離出流體組分；然后，進行以下步驟：-對流體組分進行定量化學分析以測定類黃酮的重量/體積濃度；以及-調節流體組分濃度以獲得類黃酮含量為2.5％至3.0％w/v、優選2.6％w/v的水醇性衍生物。有利地，所述至少一個循環包括：-用水稀釋濾液以使酒精測定體積滴度值在70％至80％v/v的范圍內；-將濾液冷卻至低于0℃的溫度，保持8至30小時的時間以獲得分散體；-將分散體與任何不溶性物質分離，以分出離流體組分；-對所述流體組分進行定量化學分析以測定類黃酮的重量/體積濃度；-用水稀釋濾液以使酒精測定體積滴度值在60％至70％v/v的范圍內；-將濾液冷卻至低于0℃的溫度，保持8至30小時的時間以獲得分散體；-從分散體中分離任何不溶性物質，以分離出流體組分；-對所述流體組分進行定量化學分析以測定類黃酮的重量/體積濃度；-用水稀釋濾液以使酒精測定體積滴度值在50％至60％v/v的范圍內；-將濾液冷卻至低于0℃的溫度，保持8至30小時的時間以獲得分散體；以及-將分散體與任何不溶性物質分離，以分離出流體組分。根據本發明的另一方面，提供了一種由上文中說明的生蜂膠或其衍生物的純化方法獲得的蜂膠的水醇性水可分散衍生物，其特別適于用作營養保健劑或用于美容產品制劑中。本發明的另一些方面和優點將通過對本發明的一些目前優選的實施方案進行的以下詳述而變得更明顯；下文中所舉例說明不是本發明的限制性實施方案。實驗部分1縮寫mrsmanrogosasharpebhi腦心浸液lh5瑞士乳桿菌5peg聚乙二醇etoh乙醇etoac乙酸乙酯thf四氫呋喃dmap4-n，n-二甲基氨基吡啶dccn，n′-二環己基碳二亞胺dcun，n′-二環己基脲uplc超高效液相色譜hplc高效液相色譜分析方法對于定性和定量測定生蜂膠和/或其衍生物中存在的通式(1)的咖啡酸酯而言，聯合使用uplcacquity型(waters)系統和裝配有電噴霧接口并在負離子模式[esi(-)]下運行的三重四極質譜儀(ms/ms)。在以下實驗條件下進行分析：hssc18色譜柱(150×2.1mm，1.8μm)；柱溫度：60℃；流動相：開始時(t＝0)80％洗脫劑a(水中的0.1％甲酸)和20％洗脫劑b(乙腈)，然后在2分鐘內從20％至35％b，然后在2.5分鐘內從35％至45％b；然后在10秒內從35％至45％b，然后45％b保持40秒，然后在10秒內從45％至95％b，然后95％b保持2分鐘，然后在30秒內回到初始條件；注射體積：2μl；流速：0.6ml/分鐘。quattromicro(micromass)型質譜儀；接口：負esi，毛細管：3kv；錐(cone)：15ev；碰撞氣體：氬氣；氬氣壓強：2.5×10-3毫巴(mbar)；模式：多反應監測(multiplereactionmonitoring，mrm)；躍遷對(transitionpair)：179→135(就咖啡酸而言)；247→134(就3-甲基-2-丁烯基咖啡酸酯和2-甲基-2-丁烯基咖啡酸酯而言)；247→135(就3-甲基-3-丁烯基咖啡酸酯而言)；269→135(就咖啡酸芐酯而言)以及283→135(就咖啡酸苯乙酯而言)。使用hplc-dad/ms系統[與二極管陣列檢測器(diodearraydetector，dad)mod.2996(waters)通過接口連接的hplcmod.alliance2695(waters)和quattromicro(micromass)型質譜儀(ms)]測定了生蜂膠和/或其衍生物中類黃酮的百分含量。在以下實驗條件下進行分析：symmetryc18色譜柱(250×4.6mm，5μm)；柱溫度：40℃；流動相：開始時80％洗脫劑a(水中的0.1％甲酸)和20％洗脫劑b(乙腈)，然后在6分鐘內從20％至35％b，然后在40分鐘內從35％至45％b；然后在10分鐘內從45％至65％b，然后在10分鐘內從65％至95％b，然后95％b保持10分鐘，并在3分鐘內回到初始條件；注射體積：20μl；流速：1.5ml/分鐘。quattromicro(micromass)型質譜儀；接口：負esi，毛細管：3kv；錐：20-40ev；模式：掃描；收集范圍：100-800da。[c.gardana等，j.pharm.biomed.anal.45(3)：390-9(2007)]。預備步驟1.選擇細菌菌株。在預備階段中，鑒定并選擇了一些已知其中存在具有肉桂酰酯酶活性之酶的食物細菌微生物和腸內細菌微生物，例如列于上文中報道的表1中的細菌。在以下實驗條件下，用氯原酸或阿魏酸乙酯作為底物評價了這些細菌的肉桂酰酯酶活性：將選定的細菌菌種的細胞(約1010個細胞)懸于10mlh2o/etoh(其中按體積計的etoh％等于10％)中的氯原酸溶液(底物，0.1mg/ml)中。在37℃下雙孵育反應混合物，24小時之后，將其以1000×g離心5分鐘。通過hplc-dad分析法分析上清液以確定底物(氯原酸)水解成咖啡酸的水解百分比。測試結果表明，酶促活性最高的細菌屬于乳桿菌屬。在屬于乳桿菌屬的細菌中，選擇不同種和菌株并用其進行實驗以評價肉桂酰酯酶活性是否為種特異性的，然后鑒定出選擇性酶促活性(肉桂酰酯酶)最高的菌株，這是在以下實驗條件下，通過使用兩種不同的底物(氯原酸和阿魏酸乙酯)確定的：將細菌細胞(約1010個)懸于10mlh2o/etoh(其中etoh的體積百分比等于10％)中的氯原酸或阿魏酸乙酯溶液(底物，0.1mg/ml)中。在37℃下雙孵育反應混合物，24小時之后，將其以1000×g離心5分鐘。使用hplc-dad分析法分析上清液以分別確定底物水解成咖啡酸和阿魏酸的水解百分比。該實驗允許驗證存在于受試菌株中的酶是否具有非選擇性或選擇性酯酶活性。事實上，生蜂膠中存在阿魏酸乙酯和阿魏酸類似物的酯，但它們不具有變應原性作用。該實驗所得結果報道于以下的表2中，從其中可以看到，在一些瑞士乳桿菌種菌株(包括稱為lh5的菌株)中，肉桂酰酯酶水解活性較高。表2包含肉桂酰酯酶之菌株的酶促活性。圖例：＊：無活性；±：活性差或不確定；+：差；++：好；+++：強。nt：未測試。2.確定對于生蜂膠來說酯酶活性的最佳溫度。根據下列方法制備了多種反應混合物，其中首先提供用于制備包含確定數目細菌細胞的接種物(或細胞基質)。制備接種物將瑞士乳桿菌(lh5)的預接種物在37℃下孵育約16小時。將4ml所得接種物在mrs培養基(150ml)中于37℃下孵育約16小時，以獲得肉湯培養基，對其進行細胞計數。將4ml肉湯培養基作為樣品，并以2000×g離心5分鐘以將細胞與肉湯培養基分離，從而獲得期望的接種物。將根據段落“制備接種物”中所描述方法獲得的瑞士乳桿菌lh5(約1013個細胞)細胞基質添加至包含1g生蜂膠的h2o/etoh溶液(9∶1，1ml)中。隨后，將反應混合物在以下實驗溫度下雙孵育24、48和72小時：22、26、30、34、40、44和47℃。然后，將混合物冷卻，用乙酸乙酯(3×20ml)提取，并以4000×g離心10分鐘。在氮流下蒸發所得上清液中的溶劑，并將殘余物懸于100ml甲醇中。將如此獲得的溶液先用甲醇(1∶10)稀釋，然后用uplc-ms/ms進行分析。所得結果報道于圖1中，其中示出了咖啡酸酯降解作為變應原(即，通式(1)的酯，也包括咖啡酸酯)的殘余百分比而確定的發生率在溫度為約37℃時較高。3.確定細菌細胞接種物的最佳孵育時間。根據以下方法進行實驗，其中孵育溫度在6至72小時的范圍內。具體地，孵育或反應時間確定為6、12、18、24、30、36、42、48、60和72小時。將根據段落“制備接種物”中的上述方法制備的瑞士乳桿菌lh5接種物(包含1013個細胞)與10.0ml具有已知滴度咖啡酸酯的生蜂膠(10g)分散體在10％v/vetoh水溶液中混合。在37℃下孵育混合物并在預定時間(如前述段落所示)之后通過添加乙醇(90.0ml)終止反應。然后用乙酸乙酯提取反應混合物，并通過咖啡酸衍生物(在段落中定義為“變應原”)的uplc-ms/ms分析對酶促活性進行評價，其結果示于圖2中。所得結果示出，在24小時的孵育時間之后，咖啡酸酯降解了約80％。在后續時間中降解沒有統計學上顯著地提高。然后，根據上述實驗方法制備另一lh5接種物(1013個細胞)，并使其與滴定的蜂膠(10g)反應，之前已將所述蜂膠分散于10％v/vetoh水溶液(10ml)中。用滴定生蜂膠(10g)在10％v/vetoh水溶液(10ml)中制備對照1，并用lh5接種物(1013個細胞)在10％v/vetoh水溶液(10ml)中制備對照2。將反應混合物在37℃下雙孵育24小時，隨后用乙酸乙酯(3×30ml)提取，在真空中干燥所得有機混合物，并通過uplc-ms/ms和hplc-dad對用etoh懸浮的殘余物進行定性和定量分析，所得結果報告于直方圖(histogram)5中。圖5顯示了用lh5處理生蜂膠24小時后變應原性酯的降解。4.確定用于酶促活性的最佳etoh％(v/v)。4.確定用于酶促活性的最佳etoh％(v/v)。為了確定用于酶促活性的水中的最佳etoh％，根據下述實驗方法進行了數個測試，其中僅改變所使用etoh的體積(或％)，其分別為：0ml(0％)、0.5ml(5％)、1.0ml(10％)、1.5ml(15％)、2.0ml(20％)、2.5ml(25％)、3.0ml(30％)、3.5ml(35％)、4.0ml(40％)、4.5ml(45％)、5.0ml(50％)、6.0ml(60％)、7.0ml(70％)、8.0ml(80％)、9.0ml(90％)、10.0ml(100％)。將用段落“制備接種物”中的上述方法獲得的細菌細胞基質懸于10ml用以上報告的etoh百分比制備的h2o/etoh中的氯原酸溶液(底物，1mg)中。將反應混合物在37℃下雙孵育22小時，然后以1000×g離心5分鐘。通過hplc-dad-ms分析法分析上清液以確定氯原酸水解成咖啡酸的水解百分比。如此獲得的結果示于圖3中，其中etoh百分比＞20％對酶促活性有不利影響，而etoh百分比在5％至20％的范圍內使得可以獲得約80％的酶促水解。5.確定最佳細菌細胞數目為了確定每克生蜂膠的最佳細菌細胞數目，根據以下方法進行了多個實驗，其中改變所使用的接種物細菌細胞的數目并分別選擇為：104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015和1016。將根據如上所述段落“制備接種物”中獲得的且包含確定細胞數目(如在前述段落中指定的104至1016個的范圍內)的瑞士乳桿菌lh5接種物添加至生蜂膠(1.0g)在1.0ml10％v/vetoh水溶液中的分散體中。對照混合物由乙醇水溶液(10％v/v，1ml)中的蜂膠和包含1013個細胞的lh5接種物組成。將反應混合物在37℃下雙孵育22小時，然后以1000×g離心5分鐘，并用etoac(3×10ml)提取蜂膠殘余物。用etoh稀釋有機混合物，并通過uplc-dad-ms分析以確定咖啡酸酯(例如，3-甲基-2-丁烯基咖啡酯)的含量并通過hplc-dad/ms分析以確定類黃酮含量。測試結果示于圖4中，其中在實際操作條件下，似乎需要1010個lh5細胞/g生蜂膠以實現3-甲基-2-丁烯基咖啡酯降低約50％，使用1013個細胞/g蜂膠達到降低約80％。相反，在表3中示出了經預處理蜂膠樣品活性成分(例如，類黃酮)含量的分析測定(通過hplc-dad/ms法)結果。表3.在用lh5進行酶促處理之前和之后生蜂膠中多酚的量(％)。6.合成3-甲基-2-丁烯基咖啡酸酯作為參照分析標準物合成方案將3-甲基-2-丁烯-1-醇(170μl，1.67mmol)添加至四氫呋喃(thf，15ml)中的咖啡酸(200mg，1.11mmol)溶液中，并在室溫下攪拌混合物直至完全溶解。然后，添加4-n，n-二甲基氨基吡啶(dmap；13.6mg，0.11mmol)，將所得混合物在冰水浴中冷卻至約4℃，并添加n，n′-二環己基碳二亞胺(dcc，229mg，1.11mmol)。將混合物在4℃下攪拌約10分鐘，然后通過除去冰水浴使其升溫至室溫，并在該溫度下攪拌24小時。通過古氏漏斗(goochfunnel)過濾除去所形成的n，n′-二環己基脲(dcu)，并在減壓下(通過旋轉蒸發儀(rotovapor))濃縮生反應溶劑。將殘余物用乙酸乙酯吸收并再次過濾以除去被沉淀的任何進一步量的dcu。在分液漏斗中，用0.1nhci、鹽水(nacl飽和的水溶液)、以及最后用nahco3飽和水溶液洗滌有機溶液。將有機相用無水na2so4干燥并濃縮至干，獲得生固體(107mg)，然后在下一段所述的條件下通過半制備型hplc將其純化。純化步驟允許獲得期望的產物(90mg，0.36mmol，33％收率)。使用包含mod.alliance2695(waters)hplc、mod.wfii(waters)級分收集器和mod.2996(waters)二極管陣列檢測器(dad)的色譜系統對3-甲基-2-丁烯基-咖啡酸酯進行純化。在以下實驗條件下進行分析：c18symmetry色譜柱(250×4.6mm，10μm)；柱溫度：40℃；流動相：開始時80％洗脫劑a(水中的0.1％甲酸)和20％洗脫劑b(乙腈)，然后在10分鐘內從20％至40％b，然后在10秒內從40％至90％；然后90％b保持10分鐘，然后在3分鐘內回到初始條件；注射體積：200μl；流速：3ml/分鐘。實施例1使根據上述實驗方法制備的lh5接種物(1013個細胞/g)與包含peg400(20％v/v)的10％v/vetoh水溶液中的生蜂膠(10g)反應。用包含peg400(20％v/v)的10％v/vetoh水溶液(10ml)中的生蜂膠(10g)制備對照1，并且用包含peg400(20％v/v)的10％v/vetoh水溶液(10ml)中的lh5接種物(1014個細胞)制備對照2。將反應混合物在37℃下雙孵育24小時，然后以1000×r離心5分鐘以獲得半固體殘余物。取出殘余物的一部分(1g)并用乙酸乙酯(3×30ml)提取，并用etoh稀釋有機混合物用于uplc-ms/ms和hplc-dad的定量和定性分析。實施例2使根據上述方法制備的兩種lh5接種物(分別為1012和1013個細胞/g)與包含peg400(20％v/v)的10％v/vetoh水溶液(2l)中的生蜂膠(1kg)反應。將反應混合物在37℃下雙孵育96小時，并每24小時取出10g部分。然后將多個部分以1000×g離心5分鐘以從各部分獲得半固體殘余物。用乙酸乙酯(3×30ml)提取半固體殘基的一部分(1g)。用etoh稀釋所得有機混合物用于uplc-ms/ms和hplc-dad的定量和定性分析。根據可制備蜂膠的水醇性水可分散衍生物的方法對提供蜂膠衍生物(通常為半固態)的生蜂膠或根據本發明酶促方法預處理的生蜂膠進行純化或者耗盡其中某些組分，所述水醇性水可分散衍生物通常用于此或者用于營養保健和化妝品產品的制劑中。純化方法(也是本發明的主題)依次包括以下步驟：-用極性有機溶劑進行熱溶解以獲得溶液，所述極性有機溶劑優選乙醇，且優選90％乙醇(術語“熱”意為在高于20℃且低于60％的溫度下)；-將溶液冷卻至室溫以形成懸液；-分離懸液中的固體顆粒(通常通過過濾)以獲得濾液；-對濾液進行化學分析以測定酒精測定體積滴度(或酒精度)、干殘余物和按重量/體積計的類黃酮濃度；-用水稀釋濾液以使以乙醇的體積/體積百分比表示的酒精測定體積滴度(或酒精度)值在70％至80％的范圍內；-將濾液冷卻至低于0℃(優選在0℃至-20℃之間)的溫度，保持8至30小時的時間；-例如通過離心、過濾或傾析(decantation)從濾液中分離不溶性物質(例如，蠟和脂肪物質)，以分離出流體組分；-對流體組分進行定量和定性的化學分析以測定以重量/體積表示的類黃酮濃度；-用水稀釋濾液以使以乙醇的體積/體積百分比表示的酒精測定體積滴度(或酒精度)值在60％至70％的范圍內；-將濾液冷卻至低于0℃(優選在0℃至-20℃之間)的溫度，保持8至30小時的時間；-例如通過離心、過濾或傾析從濾液中分離不溶性物質(例如，蠟或脂肪)，以分離出流體組分；-對流體組分進行定量化學分析以測定類黃酮的重量/體積濃度；-用水稀釋濾液以使以乙醇的體積/體積百分比表示的酒精測定體積滴度(或酒精度)值在50％至60％的范圍內，；-將溶液冷卻至低于0℃(優選在0℃至-20℃之間)的溫度，保持8至30小時的時間以獲得分散體；-例如通過離心、過濾或傾析從濾液中分離不溶性物質(例如，脂肪)，以分離出流體組分；-對流體組分進行定量化學分析以測定類黃酮的重量/體積濃度；-調節流體組分濃度以獲得類黃酮含量為2.5％至3.0％w/v、優選2.6％w/v的水醇性水可分散衍生物。可以通過用水稀釋或者通過部分地除去溶劑(通常通過蒸餾)進行流體部分濃度的調節，以達到期望的類黃酮滴度或含量。對于酒精測定體積滴度或酒精度、干殘余物和類黃酮濃度的分析測定，對作為本發明方法中間產物的流體組分進行測定，分別使用了以下分析方法：酒精比重計法(alcoholmetermethod)、通過使用熱天平的稱重法和hplc-dad法。實驗部分2分析方法1.測定酒精測定體積滴度或酒精度通過自動superdeesv蒸餾器和電子靜水densimat天平測定酒精測定體積滴度(alcoholimetricvolumictitre，avt)。數據處理軟件是gibertinialcosoft2。設備符合理事會1990年9月17日的eec條例n.2676/90中描述的官方方法，其確定將用于酒領域的歐共體(uecommunity)的分析方法。首先將待進行分析的樣品(100ml)置于蒸餾安瓿中，然后添加合適的試劑(水、消泡溶液、氯化鈉和鉀礬混合物)，然后開始進行蒸餾。在蒸餾過程中，餾出物收集于刻度瓶中并置于精密天平臂上，精密天平臂在獲得預定量的餾出物時使蒸餾停止。最后，從20℃下餾出物的相對密度(適當地使其達到100ml的準確體積)獲得酒精測定體積滴度v/v％(100ml溶液中的乙醇ml數)。2.測定干殘余物使用mb35濕度分析器(ohauscorporation)，通過歐洲藥典第6版，章節2.2.32“lossondrying”中報道的官方方法測定干殘余物。該方法使得將待分析樣品置于適當地設置為0的平衡板上。在105℃下，對樣品干殘余物進行測量，溶劑蒸發完之后，樣品達到恒重。數據表示為％w/w。3.測定類黃酮含量在以下實驗條件下，通過使用hplc-dad系統[與二極管陣列檢測器(dad)連接的hplc系統]來測定類黃酮含量(濃度表示為g/100ml或w/v％)：symmetryc18色譜柱3.5μm，150×2.1mm(waters)；柱溫度：30℃；樣品溫度：20℃；流動相：a：三氟乙酸(tfa)0.1％；b：乙腈中的0.1％tfa；梯度15-25％b保持10分鐘、在30分鐘內25％-40％b、在15分鐘內40％-55％b、在20鐘內55％-70％b、在2分鐘內70％-90％b以及90％b保持3分鐘；流速：0.25ml/分鐘；獲取：200-450nm；操作波長：290nm。本文中舉例說明的純化方法的多個步驟的另一些方面將在對本發明目前優選但非限制性的實施方案進行的詳述中變得更明顯。實施例3通過將混合物在38℃下攪拌約15小時用90％乙醇(282l；衍生物：乙醇比值＝約1∶3w/v)溶解半固態蜂膠衍生物(100kg)。通過在約7個小時中將溫度降低至20℃而冷卻溶液，從而獲得懸液，然后將其過濾，收集濾液，稱量(320l)并分析，用于測定其酒精度、干殘余物和類黃酮含量。通過分析發現，濾液的酒精度為76.8°，干殘余物為19.4％，且類黃酮濃度為6.5％w/v。用水(84l)稀釋濾液直至酒精度達到55-60％，然后在約15小時中將其冷卻至-15℃，最后在4℃下離心約7分鐘以除去任何不溶性物質并獲得上清液(31l)。用hplc-dad分析懸液。分析表明，類黃酮含量為3％w/v，通過用96％乙醇(48l)稀釋使其降至2.6％，以獲得酒精度為60±1.5％的蜂膠水醇性衍生物(363l)。與本發明申請的方法相比，由jp-7-8185教導的方法有許多缺點，其總結于下文中。首先，所采用的酶(尤其是氧化還原酶)不是特異性的，因此引起蜂膠活性成分(即，類黃酮)量的顯著降低。已在上文中提及氧化還原酶，而羧酸酯酶不如氧化還原酶那么具有侵襲性，但它們也水解蜂膠中類黃酮的酯(例如，乙酸短葉松素(pinobanksinacetate))和另一些微量的酚類(例如，對香豆酸酯(p-cumarate))。因此，羧酸酯酶改變蜂膠提取物的特征性指紋圖譜。相反，本發明申請的方法提供了具有酶促活性(即，肉桂酰酯酶)的益生菌劑的用途，所述益生菌劑對蜂膠的變應原性化合物具有特異性。在本發明申請的方法中，未改變類黃酮的含量，并且盡可能天然地保持蜂膠提取物。在下文中，將本發明方法的反應機制與根據jp-7-8185方法(即，使用羧酸酯酶的方法)的反應機制進行比較。應當理解，購買工業上獲得的酶是非常昂貴的，因此由jp-7-8185提出的方法昂貴且難以以工業規模實施。相反，本發明申請的方法通過使用可以低成本且大量生產的益生菌劑(即，微生物)來實施，因此該方法可有利地用于工業中。此外，氧化還原酶導致形成聚合物，其將包含于蜂膠的水醇提取物中。在方法jp-7-8185結束時，評價了蜂膠中變應原的定量降低。但未提出分析以評價酶促處理之后活性成分的含量。相反，在本發明申請方法結束時，對變應原性物質和活性成分都進行了特異性的和定量的評價。此外，根據jp-7-8185(參見例如第段，實施例3)，提取步驟需要大量乙醇，然后必須用水使酒精度降低，酶促反應后除去溶劑，最后發生在乙醇中分散。很明顯，由于乙醇的高成本，該方法不能以工業規模進行。相反，本發明申請在水環境中提供變應原性物質的顯著降低，并且隨后用溶劑進行提取，以該方式避免不希望的乙醇浪費，并且使得可以在工業中應用該提取方法。根據jp-7-8185的方法，不能獲得標準化的蜂膠，而這是草藥(erboristic)和制藥工業的基本要求。相反，根據本申請，可以降低變應原性物質并使水醇提取物及其水可分散性標準化。就提取方法而言，本申請的方法旨在獲得水醇性蜂膠提取物，其是水可分散性的，并且使其在類黃酮含量和肉桂酸(酚酸)衍生物含量上都標準化。此類提取物可用于如生產可用于獲得固體制劑(例如，食物(table)、軟膏、糖果)或糖漿劑、漱口水等制劑的干蜂膠提取物。更具體地，本發明的提取和純化方法提供了滴定提取物，其包含濃度為2.5+0.1％的類黃酮和濃度為0.5+0.1％的酚酸。此外，所述純化方法允許顯著地降低見于生蜂膠中的脂肪組分(脂肪酸、短鏈甘油三酯和蠟)的含量。采用本發明申請的方法獲得的蜂膠水醇提取物包含低于0.5％的脂肪組分。在索氏提取器(soxhlet’sextractor)中用氯仿-甲醇(1∶3，v/v)回流之后，以重量法測定脂肪的量。“脂肪物質”量的降低使得蜂膠的水醇提取物可分散于水中而沒有任何由于不溶性物質沉淀而產生膠束(micelle)和硅藻細胞(frustule)的風險。使用本發明方法獲得的水可分散性蜂膠提取物的脂肪物質含量很低。因此，經口施用之后，活性組分(多酚)可在腸水平被更好地吸收。事實上，脂肪部分可充當吸收營養物和植物化合物的被動屏障，從而影響其系統活性。因此，本申請的發明人提供了分級純化方法，其允許顯著降低脂肪含量，從而保持蜂膠的活性部分不變。標準化和水可分散性使得本發明的蜂膠水醇提取物成為植物治療和藥理學領域中的獨特產品。此外，上述特征使本發明的方法區別于任何現有技術方法。就ep-0019993而言，因為所采用的乙醇百分比太低，所以其既不能提取蜂膠的脂肪部分，也不能提取其活性部分(類黃酮)。實驗室測試已表明，在35℃至45℃的溫度范圍內，用至少60％或更高(v/v)的乙醇溶液定量地提取蜂膠中的類黃酮。還應當注意的是，在該現有技術文件中，未給出提取脂肪和類黃酮的證據，而根據本發明方法獲得的產品包含一定量的標準化的活性成分，并且脂肪的含量低于0.5％。根據本發明，在第一步驟中，通過微生物使生蜂膠的變應原性物質顯著降低，隨后對經預處理的蜂膠進行提取和純化以獲得滴度已知的水醇性水可分散蜂膠提取物。先滴定生蜂膠以測定活性化合物和變應原的量。然后用具有肉桂酰酯酶活性的微生物(其僅水解變應原)預處理生蜂膠。然后在受控溫度下用乙醇提取經預處理的蜂膠，然后在預定時間間隔之后，除去固體殘余物，評價如此獲得之液體的活性化合物含量、變應原含量、酒精度和干殘余物。基于如此獲得的結果，通過添加水和對分散體進行短時冷卻來進行分級純化。上文中提及的現有技術文件既未提及或也未教導用水進行分級純化。在本發明方法中，逐漸除去脂肪組分而不變更或改變活性成分的量。可以對該方法進行修改以適于具有不同種群地理來源(ethnogeographicorigin)的任何蜂膠(這意味著蜂膠具有不同含量的活性成分和變應原)。此外，根據本發明的方法，不浪費乙醇，并且獲得了提高量的水醇提取物。這些優點與產物的標準化一起使得本發明方法在工業上適用并且經濟上有利。在以下權利要求的要旨所限定的范圍內，可對用于預處理蜂膠的本發明的酶促方法、純化蜂膠或其衍生物的方法、以及通過所述方法獲得的衍生物進行多種改變。當前第1頁12當前第1頁12