本發明涉及增生性玻璃體視網膜病變(pvr)的研究，尤其是涉及一種mir-194-5p作為增生性玻璃體視網膜病變的治療藥物的應用。
背景技術：
：增生性玻璃體視網膜病變(pvr)是指孔源性視網膜脫離后玻璃體腔內和視網膜表面的膜增生和收縮的病變，這些增生的膜可以牽拉和重新打開已經修復的裂孔，造成新的裂孔并且扭曲和遮擋黃斑，同時pvr也是最常見的導致視網膜脫離手術失敗的原因，據報道其發生率為5.1％～11.7％，在最終失敗的視網膜脫離手術中，75％的病因都歸因于pvr，因此其也是致盲的主要原因。文獻報道僅有11～25％的pvr患者經治療后視力能夠達到0.2以上。但是迄今為止對pvr的發病機制的研究仍不明確，臨床上沒有可用的有效治療藥物，仍主要通過玻璃體切除手術治療，但手術較為復雜，且手術也不能徹底解決問題，術后容易復發，往往經過多次手術，患者的視功能仍逐漸下降甚至喪失，而且手術費用也很昂貴，給患者及家屬帶來沉重的心理負擔及經濟損失，因而深入研究pvr的發病機制，探尋安全有效的靶向藥物治療方法，來輔助視網膜脫離手術的成功，對于pvr的治療具有重要的臨床意義和社會價值。在增生性玻璃體視網膜病變的發病機制中，上皮-間質化(emt)被認為是最重要的機制之一。emt是指上皮細胞通過特定程序逐步轉化成為具有間質表型細胞的生物學過程，如失去典型的上皮樣形態，而轉變為纖維樣形態，并失去細胞之間的緊密連接，上皮細胞標記物如zo-1，e-cad等表達下降，而間質細胞標記物如a-sma，fn，vimentin等表達增加，細胞的增生、遷移能力增強，在多種纖維化疾病中有著重要的作用。rpe細胞在多種細胞因子的作用下發生emt是pvr的重要病理過程。zeb1是emt最主要的轉錄因子之一，zeb家族是脊椎動物中一類e盒結合鋅指蛋白，有zeb1/tcf8和zeb2/sip1兩個成員，分別由zfhx1a和zfhx1b編碼，主要結構特點是其n端和c端都有c2h2鋅指簇和位于中間的一段同源結構域(homeodomain,hd)，另外還有smad結合域(smadbindingdomain,sbd)和ctbp相互作用結構域(c-terminalbindingproteininteractiondomain,cid)，因此，zeb1和zeb2有相似的dna結合特異性，即每個鋅指簇能夠獨立結合靶基因轉錄調控區啟動子的e盒核心元件5′-cacct(g)-3′，調節靶基因的轉錄；同源結構域雖不能結合dna，但在蛋白質-蛋白質相互作用中起重要作用。此外，zeb家族激活或抑制基因轉錄是通過招募其輔激活因子p300、pcaf(p300/cbp結合因子)或輔抑制因子ctbp而起作用的。與emt密切相關的上皮和間質標志物有多種，如e-cadherin、vimentin、n-cadherin等，其中，e-cadherin是細胞緊密連接的中心復合物，作為上皮細胞的連接蛋白維持上皮的完整性，其表達的降低或缺失與腫瘤細胞的分化、分期、侵襲、轉移以及預后密切相關。因此，e-cadherin是一種典型的腫瘤侵襲抑制分子，是emt最主要的標志物之一。e-cadherin的轉錄抑制因子主要有兩大類：一類是堿性螺旋-環-螺旋結構，如twist1、twist2、e12/e47等；另一類是鋅指蛋白，如snail、slug、zeb1、zeb2、klf8(krüppel-likefactor8)等。e-cadherin失調的重要機制之一是其轉錄水平受抑。zeb1同其他轉錄因子(snail、slug和e12/e47)能夠直接結合e-cadherin啟動子的e盒，抑制e-cadherin轉錄。有研究還發現，e-cadherin的表達特異性地受zeb1表達水平的影響：當zeb1表達水平高時，e-cadherin的表達受到抑制；當用sirna抑制zeb1表達時，zeb1對e-cadherin的抑制作用解除。另外，還有研究顯示，能夠誘導非小細胞肺癌emt的4個主要的轉錄因子(zeb1、sip1、snail和slug)中，zeb1引起vimentin升高和e-cadherin降低的效應更明顯，形成更顯著的間質表型。zeb1是e-cadherin最主要的轉錄抑制因子之一。lkb1基因是一種保守的抑癌基因，其編碼產物是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶。lkb1參與細胞凋亡、細胞周期阻滯、細胞極性、染色體重組和新陳代謝等生物過程，并且也能調控肺癌的起始、分化和轉移。lkb1基因失活很可能與肺癌細胞侵襲、轉移、emt有關。zeb1表達和lkb1呈負相關，lkb1沉默或突變可促使zeb1誘發emt。zeb1直接抑制sema3f的表達。sema3f是導向蛋白家族(semaphorin)3的成員之一，也是一種有強大抗血管生成和抗轉移活性的分泌性導向蛋白，zeb1水平與sema3f表達情況呈顯著的負相關關系，zeb1過表達或抑制表達都會相應地影響sema3f的表達情況；zeb1通過抑制sema3f表達引起hif-1α升高，hif-1α又抑制e-cadherin表達導致細胞間黏附性降低發生emt。轉化生長因子β(transforminggrowthfactorβ，tgf-β)在多種腫瘤組織中均有廣泛表達，并且生物學作用復雜，如在腫瘤發生早期，tgf-β作為腫瘤抑制因子，促使腫瘤細胞生長停滯和誘導凋亡。在腫瘤發展后期，當細胞對tgf-β抑制生長的敏感度降低時，腫瘤細胞能發生emt，甚至繼續惡化。肺癌細胞和基質細胞均能分泌tgf-β，并且其表達水平與癌癥分期有關，而且，tgf-β能夠刺激肺癌的侵襲和轉移，是emt的關鍵誘導因子之一，可由smad通路及多條非smad通路共同調節emt相關的靶基因，如zeb1、snail等。在經典的tgf-β/smad信號途徑中，tgf-β受體接受信號刺激后，使smad家族蛋白成員(主要是smad3)磷酸化而激活，激活后的smad蛋白一方面可以通過抑制分化抑制因子2(inhibitorofdifferentiation2,id2)從而抑制e2a。e2a是堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子家族的成員，有e12和e47兩個亞型，e12/e47可以抑制e-cadherin表達，另一方面smad可以誘導ets1(e26transformationspecific-1)表達，ets1己經證實為促癌和促腫瘤血管生成的轉錄因子，e2a與ets1可協同促進zeb1轉錄。發生emt的細胞也具有干細胞樣的特性。emt的主要誘導因子tgf-β可能與干細胞途徑wnt、ras、notch、hedgehog等共同影響誘導emt。emt相關的轉錄因子zeb1/2、snail、twist等可以作為smads的輔因子，與smads相互作用，形成emt促進smad蛋白復合物(emtpromotingsmadcomplexes,epsc)，從而抑制上皮基因，激活間質基因表達。tgf-信號激活后促進zeb1表達，從而抑制e-cadherin。環氧合酶2(cyclooxygenase-2,cox-2)是前列腺素(prostaglandin,pg)合成過程中一個關鍵的限速酶，可以將花生四烯酸代謝成pge2、pgd2、txa2等前列腺素產物。cox-2高表達，代謝產物pge2水平也升高，而pge2可以誘導炎癥反應，活化表皮生長因子受體，zeb1表達升高，促進emt，pge2對zeb1的上調、e-cadherin的下調有劑量效應。在cox-2依賴的通路中，zeb1與pge2有直接的正相關關系，zeb1通過影響pge2的自分泌或旁分泌抑制e-cadherin的表達，從而引起emt。與zeb1相關的信號轉導途徑中，tgf-β信號研究得較多，并且tgf-β本身也是emt的誘導因子。另外，還有wnt/β-catenin、成纖維細胞生長因子(fibroblastgrowthfactor,fgf)、notch等。顯然zeb1是emt發生發展及其emt相關的信號。而本發明正是以mir-194-5p直接作用于zeb1。技術實現要素：本發明的目的就是為了探討mir-194-5p抑制emt的機制，并提供mir-194-5p作為pvr治療藥物的應用。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：本發明所述的mir-194-5p基因號是mimat0000460，序列為uguaacagcaacuccaugugga，如seqidno.1所示。本發明發現在體外tgfβ誘導的emt細胞模型以及體內sd大鼠pvr模型中，mir-194-5p都能夠有效地抑制pvr。在體外模型中，本發明利用10ng/ml的tgfβ在arpe19細胞中誘導emt，用化學合成的mir-194-5pagomir轉染視網膜色素上皮細胞(arpe19)，可以降低emt相關基因a-sma、zeb1等的表達，而升高上皮相關基因zo-1等的表達，同時還能保護emt引起的緊密連接的破壞及組織細胞骨架的重構。在體內試驗中，本發明利用玻璃體腔注射8ul的arpe19細胞(2.4*106)的血小板富集血漿(prp)懸液的方法成功誘導pvr模型，再通過玻璃體腔注射mir-194-5p的agomir進行治療，與生理鹽水對照組相比，發現h-89能夠保護由于pvr造成的sd大鼠的erg下降以及視網膜結構的破壞。通過熒光素酶活性實驗分析，發現mir-194-5p能夠與zeb1的3‘-非翻譯區直接互補，發揮抑制emt的作用。本發明的第一方面，提供了在體外的細胞模型中，mir-194-5p能夠抑制arpe19細胞發生emt過程模擬的pvr過程。本發明的第二方面，提供了在體內的sd大鼠pvr模型中，mir-194-5p能夠抑制pvr的癥狀，并延緩其進展。本發明的第三方面，揭示了mir-194-5p能夠直接靶向zeb1的3‘非翻譯區，下調zeb1，從而發揮作用。本發明的第四方面，提供了mir-194-5p作為pvr治療藥物的依據，提供了一種通過玻璃體腔注射化學合成的mir-194-5p的agomir進行pvr治療的手段，所述的mir-194-5p的agomir的形式是膽固醇修飾而成。本發明的第五方面，提供一種增生性玻璃體視網膜病變的治療藥物，主要成分為mir-194-5p或mir-194-5p的agomir。本發明首次發現了mir-194-5p在體外以及體內的pvr模型中對pvr的抑制作用，mir-194-5p能夠靶向zeb1，抑制pvr發病過程中如emt等引起的emt相關的基因表達水平改變以及緊密連接的破壞等。這些結果首次mir-194-5p可以玻璃體腔注射，作為pvr治療的藥物。與現有技術相比，本發明具有以下優點：目前pvr的治療仍以玻璃體切除手術為主，但是手術費用昂貴，要反復手術；而mir-194-5p的agomir小分子化合物價格便宜，容易獲得；而mir-194-5p能夠在體內體外均有效抑制pvr的依據，同時通過玻璃體腔注射進行眼局部用藥，可以避免全身用藥帶來的潛在風險。附圖說明圖1：轉染psuper-mir-194-5p的arpe19細胞劃痕0小時、24小時和48小時的顯微鏡圖；圖2：psuper空載體的arpe19細胞劃痕0小時、24小時和48小時的顯微鏡圖；圖3：熒光定量pcr檢測顯示mir-194-5p抑制tgfβ1誘導的emt相關標記物zo-1在mrna水平的變化結果；圖4：熒光定量pcr檢測顯示mir-194-5p抑制tgfβ1誘導的emt相關標記物zeb1在mrna水平的變化結果；圖5：熒光定量pcr檢測顯示mir-194-5p抑制tgfβ1誘導的emt相關標記物vimintin在mrna水平的變化結果；圖6：westernblot檢測圖譜；圖7：westernblot檢測顯示mir-194-5p抑制tgfβ1誘導的emt相關標記物zeb1在蛋白水平的變化；圖8：westernblot檢測顯示mir-194-5p抑制tgfβ1誘導的emt相關標記物nectin-1在蛋白水平的變化；圖9：westernblot檢測顯示mir-194-5p抑制tgfβ1誘導的emt相關標記物zo-1在蛋白水平的變化；圖10：免疫熒光顯示mir-194-5p抑制tgfβ1誘導的emt相關標記物在細胞原位的變化結果；圖11：免疫熒光顯示mir-194-5p抑制tgfβ1誘導的emt相關標記物在細胞原位的變化結果；圖12：熒光素酶報告系統分析mir-194-5p與zeb1的3‘-utr區相互作用結果；圖13：免疫熒光顯示mir-194-5p抑制大鼠pvr模型zeb1的表達結果；圖14：mir-194-59抑制大鼠pvr模型的眼底照片。具體實施方式下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例中，arpe19細胞購自atcc，培養基為dmem：f12培養基，含10％血清和1％p/s。培養環境是37℃、5％co2和95％空氣。tgfβ1或者tgfβ2購買自r&d公司。h-89購自selleck公司，使用濃度為5-50um。反轉錄試劑盒是primescripttmrtmastermix(購自takara公司)，pcr試劑盒是superrealpremixplus(sybrgreen)(購自天根公司)。所用引物由蘇州金維智公司合成。transwell小室，8um孔徑(購自康寧公司)。細胞分別為轉染psuper-mir-194-5p和psuper空載體的arpe19細胞。實施例1過表達mir-194-5p能夠抑制tgfβ1誘導的細胞遷移的驗證1、細胞處理：將細胞接種在96孔板中，轉染空載體psuper和psuper-194-5p各0.1ug采用lipo2000轉染試劑進行轉染。2、劃痕：用10ul移液槍槍頭在細胞上呈“一”字劃痕，然后用pbs清洗3次洗掉浮起的細胞。加入對應處理的培養基繼續進行培養。3、拍照：在顯微鏡下分別在劃痕0小時，24小時和48小時的時間點進行拍照。4、數據分析：用imagej軟件進行劃痕寬度的測量，獲得寬度數據，然后再利用graphpadprism軟件進行統計分析及作圖。劃痕0小時、24小時和48小時時，轉染psuper-mir-194-5p的arpe19細胞和psuper空載體的arpe19細胞的顯微鏡圖如圖1、圖2所示，從圖1、圖2可以看出，由圖1、2我們可以看出經tgfβ1處理后，轉染空載體arpe19細胞的增殖遷移能力明顯增強，48小時后劃痕距離減少，轉染psuper-mir-194-5p細胞的增殖遷移能力下降特別明顯，說明過表達1mir-194-5p能夠抑制tgfβ1誘導的遷移。實施例2熒光定量pcr檢測顯示mir-194-5p抑制tgfβ1誘導的emt相關標記物在mrna水平的變化：將正常對照、tgfβ處理的轉染psuper-mir-194-5p和psuper空載體的arpe19細胞分別用1mltrizol收集在1.5ml管中，進行抽提總rna。經過逆轉錄和實時定量pcr分析，采用半定量的方法計算。主要步驟如下：1.向trizol收集的樣品中，加入五分之一200ul體積的氯仿，劇烈混勻后，以12000rpm的轉速4℃離心10分鐘。2.離心后，將上清轉移到新的離心管中，注意不要取到中間的蛋白層，加入等體積的異丙醇。3.12000rpm的轉速4℃離心10分鐘，棄去上清，將沉淀用75％的乙醇洗1-2次。4.將沉淀室溫干燥后，用適量的20uldepc水溶解。5.nanodrop定量，并計算反轉錄所需的體積。6.rna反轉錄：(1)20ul的體系，1000ng的rna，取4ul的takara的逆轉錄試劑supermix，再加ddh2o補到20ul.(2)反轉錄程序：37℃15分鐘，85℃5秒，然后可于-20℃冰箱保存備用。7.定量pcr(1)將rna反轉錄后得到的cdna10倍稀釋作為為模板，設計引物如表1。(2)利用天根公司的sybrgreen實時熒光定量pcr檢測試劑盒，q-pcr的體系為20ul,2ul的cdna模板，1ul的引物，10ul的2xpcrmix，7ul的ddh2o，檢測目的基因的表達量。pcr擴增條件如下：94℃變性10分鐘，進入循環(95℃5sec，60℃60sec)，一共40個循環，并收集溶解曲線。(3)數據分析，采用2-△△ct法進行處理，以gapdh做為內參。實驗結果如圖3、4、5所示，圖3、4、5分別為熒光定量pcr檢測顯示mir-194-5p抑制tgfβ1誘導的emt相關標記物zo-1、zeb1、vimintin在mrna水平的變化結果；說明psuper-mir-194-5p能夠有效地抑制arpe19細胞的增殖遷移。通過圖3、4、5可以看出，經tgfβ1處理有，與轉染空載體相比，轉染psuper-194-5p細胞緊密連接蛋白zo-1升高，zeb1和vimintin的mrna下降。表1q-pcr中所用到的引物序列gapdh-forwardaggtcggtgtgaacggatttggapdh-reversetgtagaccatgtagttgaggtcazo-1-forwardattgtcgtcgcatgtagatcczo-1-revrsegggttcataggtcagattaggca-sma-forwardaatgcagaaggagatcacgga-sma-reversetcctgtttgctgatccacatcnectin-1-forwardcggatggacgtgaagctcnectin-1-reversecaggctgtagttgatgggtcvimentin-forwardcgtgaataccaagacctgctcvimentin-reverseggaaaagtttggaagaggcag實施例3westernblot檢測顯示mir-194-5p抑制tgfβ1誘導的emt相關標記物在蛋白水平的變化：將正常對照、tgfβ處理的轉染psuper-mir-194-5p和psuper空載體的arpe19細胞進行蛋白抽提。1、蛋白的提取：將細胞接種在6cm的細胞培養皿中，經相應的處理后，加150μl含有proteaseinhibitorcocktail的ripa裂解液，用細胞刮收集細胞到新的ep管中，放冰上孵育30分鐘，10000rpm，4℃離心15分鐘，輕輕吸出上清至干凈的離心管中，-80℃保存備用。2、蛋白濃度的測定：蛋白定量采用bca定量法，具體方法如下：配制標準蛋白溶液2μg/μl,-20℃保存備用；根據標準品和樣品的數目配制工作液，試劑a和試劑b按50:1的體積比充分混勻，現配現用；工作液總體積＝(標準品個數+待測樣品個數)×(2個復孔數)×(200μl工作液)。將標準品按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、16μl的體積加到酶標孔中，每孔加入200μl的bca工作液，制作標準曲線；待測樣品每孔加入2μl，再加入200μl的bca工作液，37℃孵育30分鐘；用多功能酶標儀測定560nm處的吸光度值。3、蛋白樣品的準備：根據準備上樣的蛋白量和蛋白濃度，加入5×loadingbuffer，混合后于100℃加熱10分鐘，使其充分的變性，4℃，12000rpm，離心2分鐘，除去沉淀，-80℃貯存備用。4、sds-page電泳：分離膠的制備：10％的分離膠(10ml)配制方法如下：30％聚丙烯酰胺3.3ml，ddh2o2.7ml，1mtris(ph8.8)3.8ml，10％sds0.1ml，10％過硫酸銨0.1ml，temed0.004ml；灌膠前加aps和temed，加完后充分混勻，迅速灌膠。用移液槍將配制好的分離膠溶液緩慢加入到裝配好的玻璃板中，分離膠溶液高度約為6cm，給濃縮膠留出1.5cm高的位置，加好后在凝膠頂部緩緩加入無水乙醇促進膠凝，使凝膠表面呈一條直線；放置1小時左右直到凝膠完全凝固，當無水乙醇和凝膠之間有一條折線時說明凝膠已經凝固，倒掉膠上的無水乙醇，用濾紙吸干。制備5％的濃縮膠(4ml)方法如下：30％聚丙烯酰胺0.67ml，ddh2o2.7ml，1mtris(ph6.8)0.5ml，10％sds0.04ml，10％過硫酸銨0.04ml，temed0.004ml；灌膠前加aps和temed，加完后充分混勻，迅速灌膠。用移液槍將配制好的濃縮膠溶液緩慢加入分離膠的上層，直至玻璃板的邊緣，然后小心插入梳子，注意不要產生汽包，放置約1小時左右凝膠，凝膠之后拔出梳子，準備電泳。將準備好的蛋白樣品和蛋白標記分子加入到加樣孔中，防止氣泡產生，使用bio-rad電泳儀，槽內加滿電泳液以后即可開始電泳，電泳條件為：80v電壓，30分鐘，換120v電壓，1小時30分鐘左右。電泳至溴酚藍剛好跑出分離膠底部停止。5、轉膜：sds-page凝膠電泳結束以后，將玻璃板撬開后小心分離出凝膠，切去濃縮膠的部分，保留分離膠，浸泡于去離子水中；剪取與凝膠大小相似的pvdf膜放入無水甲醇中浸泡2分鐘；將切好的凝膠、濾紙以及事先用無水甲醇浸泡過的pvdf膜放入轉膜平衡液中平衡10分鐘；采用bio-rad的轉膜系統，以夾三明治的方式，從黑面到白面的順序依次為：黑面(負極)-海綿墊-濾紙-凝膠-pvdf膜-濾紙-海綿-白面(正極)，濾紙、凝膠和pvdf膜要對齊，徹底清除內部氣泡，然后放入裝滿轉膜液的轉膜儀中，轉膜條件為300毫安，2小時；轉膜槽置于冰浴中。轉膜結束后可以參考蛋白marker轉上pvdf膜作為轉膜成功的標志，也可將膜用1×麗春紅染液染色，然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。6、免疫雜交反應：用1×pbst洗掉麗春紅，配置5％的bsa閉液，室溫封閉1小時。加入用pbst稀釋的一抗，4度過夜；1×pbst洗膜3次，每次10。加入pbst稀釋的hrp標記的二抗，室溫1小時。1×pbst洗膜3次，每次10。ecl化學發光采集結果，以gapdh作為對照內參。7、數據統計分析：用imagej軟件western條帶的灰度分析，然后與對應的gapdh進行相比，然后再利用graphpadprism軟件進行統計分析及作圖。mir-194-5p抑制tgfβ1誘導的emt相關標記物在蛋白水平的變化實驗結果如圖6、7、8、9所示，由圖6、7、8、9可知經tgfβ1理后，緊密連接蛋白zo-1表達下降，而emt相關基因zeb1表達量明顯上升，在mir-194-5p組zeb1明顯下降，zo-1上升，nectin-1蛋白水平沒有變化。實施例4免疫熒光顯示mir-194-5p抑制tgfβ1誘導的emt相關標記物在細胞原位的變化。1、細胞處理：將細胞接種于預置在培養皿中的玻片上，經相應的處理之后，取出玻片；2、固定：用4％多聚甲醛固定10分鐘，pbs洗3次，每次5分鐘；3、透膜：0.1％tritonx-100透膜10分鐘，pbs洗3次，每次5分鐘；4、封閉：5％馬血清室溫封閉1小時；5、一抗：加5％馬血清室稀釋的一抗，置于濕盒內防止干燥，4℃孵育過夜；6、二抗：pbs洗3次，每次5分鐘；加5％馬血清室稀釋的熒光素酶標記的與一抗同種屬來源的二抗，置于濕盒內，避光37℃孵育1，pbs洗3次，每次5分鐘；7、染核：用0.5μg/mldapi染細胞核3分鐘，pbs洗3次，每次5分鐘；8、封片：用熒光封片劑封片。9、拍照：用激光共聚焦顯微鏡，在油鏡，600倍放大進行拍照。免疫熒光顯示mir-194-5p抑制tgfβ1誘導的emt相關標記物在細胞原位的變化實驗結果如圖10所示，nectin-1、occludin和zo-1定位在細胞膜，經tgfβ1理后，轉染空載體的arpe19細胞之間的緊密連接被破壞細胞膜zo-1、nectin-1、occludin染色不連續，轉mir-194-5p的arpe19則膜定位的zo-1、nectin和occuldin相對完整連續。如圖11所示，經如圖10、11中緊密連接蛋白zo-1的染色所示；zeb1轉位如核，而在轉染mir-194-5p的arpe19保護了tgfβ1對細胞緊密連接的破壞，減少核內的zeb1。實施例5mir-194-5p對zeb13-utr的相互作用在hek293t細胞系轉入mirna-194-5p質粒和psicheck-2質粒(含有zeb13’-utr區域)，檢測熒光素酶的活性，熒光素酶活性檢測試劑盒購自promega。轉染質粒時，采用的是invitrogen公司的lipofectamine2000脂質體，主要步驟如下：1.前一天先將細胞按照50％左右的密度鋪在六孔板里。2.轉染前將培養基換成無血清無抗生素的dmem培養基，然后取兩個滅菌的離心管，各加入250μl無血清無抗生素的培養基，再分別加入5μl的脂質體和4μg的質粒(mir-194-5p和psicheck2質粒各2ug)，各自混勻后，靜置5分鐘。3.將含有脂質體的培養基加入到含有質粒的培養基中，混勻，30分鐘后均勻滴加到細胞里。4.6小時后換成正常的高糖dmem培養基繼續培養，轉染36小時，裂解進行報告基因檢測。結果參見圖12。通過報告基因分析支持過表達mir-194-5p與zeb1的3’-utr相互作用。圖12可以看出，在hek293中，mirna-194-5p過表達降低熒光素酶的活性。實施例6mir-194-5p抑制pvr大鼠的干預的眼底檢查玻璃體腔注射pvr造模1、大鼠準備：6-8w的sd大鼠購自斯萊克公司，飼養在同濟大學動物中心。，160～180g重，隨機分為三組，pbs對照組，模型組(arpe19+prp)，治療組(arpe19+prp+h89)。2、細胞準備：取體外培養的arpe19細胞，p10-p15之間，調節細胞濃度使得每只眼的細胞數量為2.4*106，分到兩個ep管中分別為模型組合治療組，置于冰上備用。3、血小板富集血漿(prp)的制備：將大鼠固定于鼠籠內，鼠尾暴露于籠外。穿刺前用酒精棉球擦拭鼠尾，將5號頭皮針和1ml注射器相連接，用肝素鈉稀釋液沖洗針頭和注射器；右手持針，左手拇指在上、示指在下捏住鼠尾，將鼠尾略彎曲以使進針處血管和針頭方向平行，針頭平行于鼠尾刺破表皮后繼續進針3-5mm，針頭進入尾靜脈見回血，左手捏住鼠尾，右手推拉1ml注射器活塞，制造負壓進行取血；取血結束后，應用脫脂棉球按壓針眼部位30s，確定止血后放開大鼠。將取得的血轉移到含3.8％枸櫞酸鈉的采血管內，低溫離心，1000g，1min，其上清液為prp。4、arpe19+prp懸液制備：按照已經計算好的細胞量和注射量，分別用prp重懸arpe19細胞，模型組為arpe19+prp，治療組為arpe19+prp+mir-194-5p；mir-194-5p的量為100-50um。5、玻璃體腔注射：注射前大鼠腹腔注射2％戊巴比妥鈉(1ml/400g體重)進行麻醉，1×速眠新(0.1ml/200g)進行肌肉松弛，然后給予一滴0.5％托吡卡胺散瞳(wuxishanhegroup，jiangsu，china)，一滴0.4％鹽酸奧布卡因表面麻醉(eisaicoltd，tokyo，japan)。在體視顯微鏡下，先用1ml注射器自角膜緣后垂直進針扎一小孔，然后再用注射針由該孔向玻璃體腔內注入相應液體。每只眼的注射體積為8ul。數據如圖14所示，control為正常對照顯示眼底血管結構清晰，pvr組眼底照相出現血管部分彎曲，造模組對視網膜結構造成明顯損傷，且有前膜形成，說明聯合注射arpe19細胞和血小板富集血漿的方法能夠成功誘導pvr模型。mir-194-5p治療組顯示為眼底血管結構明顯好于造模組。實施例7mir-194-5p對pvr大鼠模型的zeb1表達眼球冰凍切片的制備1.眼球準備：pvr造模后的sd大鼠在不同時間點收取眼球樣本，sd大鼠脫臼處死后，仔細摘除眼球，注意保留視神經；2.固定：置于4％多聚甲醛固定過夜；3.解剖：在解剖顯微鏡下沿角鞏膜緣上緣解剖眼球，小心去除角膜，虹膜和晶狀體，形成完整的視杯，注意操作輕柔防治造成視網膜脫離；4.脫水：用30％的蔗糖過夜脫水；5.包埋：用組織包埋液oct包埋4℃平衡過夜；6.液氮速凍：將眼球用液氮快速冷凍，冷凍之前使得眼球的位置盡量垂直居中。-80℃保存冰凍樣品。7.切片：用冰切機按8μm的厚度進行連續切片，取過視神經乳頭的切片。將切片放在-80℃保存，使用前吹干。視網膜冰凍切片免疫熒光1.切片準備：取實施例7中所得的眼球冰凍切片樣品進行免疫熒光染色檢測。2.烤片：50℃烤片半小時。3.固定：4％pfa固定10分鐘，再用pbs清洗三次，每次5分鐘。4.透膜：用0.25％triton-x100透膜15min，pbs洗3次，每次5min。5.封閉：5％馬血清室溫封閉1小時；6.一抗：加5％馬血清稀釋的相應一抗，置于濕盒內防止干燥，4℃孵育過夜。7.二抗：pbs洗3次，每次5min；加5％馬血清稀釋的熒光素酶標記的與一抗同種屬來源的二抗，置于濕盒內，避光37℃孵育1小時。8.dapi染核：pbs洗3次，每次5min；用0.5μg/mldapi染細胞核1min，pbs洗3次，每次5min。9.封片：用熒光封片劑封片。10.拍照觀察：在顯微鏡下拍照觀察。如圖13所示，為2w的眼球冰凍切片免疫熒光照片，其中藍色為dpai染核，高亮的白色為emt標記物zeb1，而經mir-194-5p治療后，眼球結構的破壞減輕，同時zeb1的表達量也下降，進一步說明mir-194-5p對pvr有治療作用。上述的對實施例的描述是為便于該
技術領域：
的普通技術人員能理解和使用發明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經過創造性的勞動。因此，本發明不限于上述實施例，本領域技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明范疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保護范圍之內。<110>同濟大學<120>mir-194-5p的應用<160>11<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1uguaacagcaacuccaugugga22；<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>gapdh-forward<400>2aggtcggtgtgaacggatttg21；<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<220><221>gapdh-reverse<400>3tgtagaccatgtagttgaggtca23；<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>zo-1-forward<400>4attgtcgtcgcatgtagatcc21；<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<220><221>zo-1-revrse<400>5gggttcataggtcagattaggc22；<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<220><221>a-sma-forward<400>6aatgcagaaggagatcacgg20；<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>a-sma-reverse<400>7tcctgtttgctgatccacatc21；<210>8<211>18<212>dna<213>人工序列<220><221>nectin-1-forward<400>8cggatggacgtgaagctc18；<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<220><221>nectin-1-reverse<400>9caggctgtagttgatgggtc20；<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>vimentin-forward<400>10cgtgaataccaagacctgctc21；<210>11<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>vimentin-reverse<400>11ggaaaagtttggaagaggcag21；當前第1頁12