本發明涉及一種葉酸-磷酰膽堿齊聚物修飾的氧化石墨烯及其制備方法和應用，屬于藥物載體技術領域。

背景技術：

針對腫瘤，尤其是肝癌的經導管栓塞化療(tace)是目前治療無法手術切除的腫瘤的手段之一。傳統tace以碘化油為栓塞劑，但由于目前大部分化療藥物如阿霉素、伊立替康等都是水溶性的，碘化油和這些藥物的混合體系極不穩定，化療藥物在很短時間內就會釋放，進入體循環引起副作用。為了徹底改善這個問題，一些新的栓塞劑開始出現。wingard，lb等人將阿霉素以共價鍵的形式鏈接到交聯的聚乙烯醇上，在栓塞過程中發現共價鍵無法割斷，藥物釋放困難(cancerresearch(1985)45(8)3529-3536)；中國專利201010547876.x中公開了一種磺酸基巰基殼聚糖介入栓塞化療緩釋微球的制備方法，磺酸基修飾比率可達60％～75％，將微球懸浮于化療藥物水溶液中，微球的載藥量可達到25mg/ml，微球在體內的生物相容性和物理性能都較好。

但是，現有技術中藥物進入人體后，存在損耗高，利用率差，預期效果不夠理想的缺陷。

技術實現要素：

發明目的：本發明的目的是在于提供一種葉酸-磷酰膽堿齊聚物修飾的氧化石墨烯及其制備方法和應用，所得氧化石墨烯能夠負載腫瘤化療藥物，可以為肝動脈化療栓塞治療提供一種新的方法——氧化石墨烯的親水修飾物誘導肝動脈血栓從而達到栓塞的目的，同時氧化石墨烯上負載的化療藥物持續釋放加強治療。

技術方案：為了實現上述目的，本發明公開了一種葉酸和含有磷酰膽堿結構的齊聚物修飾的氧化石墨烯，其結構如下式所示：

r1,r3＝h,ch3

r2，r4＝cxh2x+1，x＝2，3，4

如上所示，參與聚合的有兩個單體：一個含磷酰膽堿結構的丙烯酸酯和一個含氨基結構的丙烯酸酯，m:n值的比例在1-10范圍內。

其中，根據r1基團的不同，參與聚合的含有磷酰膽堿結構的單體可以是丙烯酰氧基烷基磷酰膽堿、2-甲基丙烯酰氧基烷基磷酰膽堿中的一種或兩種的混合物；根據r2基團的不同，相應的磷酰膽堿結構可以是丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿、丙烯酰氧基丙基磷酰膽堿、丙烯酰氧基丁基磷酰膽堿中的一種或多種的混合物。綜合r1和r2基團的組合，參與聚合的單體可以是丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿、丙烯酰氧基丙基磷酰膽堿、丙烯酰氧基丁基磷酰膽堿、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿、2-甲基丙烯酰氧基丙基磷酰膽堿、2-甲基丙烯酰氧基丁基磷酰膽堿中的一種或多種的混合物。

根據r3基團的不同，參與聚合的化合物可以是丙烯酸氨基乙酯、甲基丙烯酸氨基乙酯；根據r4基團的不同，對應的化合物可以是丙烯酸氨基乙酯、丙烯酸氨基丙酯、丙烯酸氨基丁酯中的一種或多種的混合物。綜合r3和r4基團的組合，參與聚合的單體可以是丙烯酸氨基乙酯、丙烯酸氨基丙酯、丙烯酸氨基丁酯、甲基丙烯酸氨基乙酯、甲基丙烯酸氨基丙酯、甲基丙烯酸氨基丁酯中的一種或多種的混合物。

在上述含有磷酰膽堿結構的齊聚物修飾的氧化石墨烯的齊聚物鏈上連接了葉酸分子。

所述葉酸和含有磷酰膽堿結構的齊聚物修飾的氧化石墨烯的制備方法，包括以下步驟：采用了hummers方法合成的氧化石墨烯，在水溶液中，利用含磷酰膽堿結構的丙烯酸酯和含氨基結構的丙烯酸酯，通過原子轉移自由基聚合的方法合成得到含有磷酰膽堿結構的齊聚物修飾的氧化石墨烯，在此基礎上，利用齊聚物鏈上的氨基，通過edc/nhs化學，在齊聚物鏈上連接了葉酸分子，得到葉酸和含有磷酰膽堿結構的齊聚物修飾的氧化石墨烯。

本發明葉酸和含有磷酰膽堿結構的齊聚物修飾的氧化石墨烯可以用于制備抗腫瘤藥物，利用石墨烯大比表面積的特點，可以負載抗腫瘤化療藥物，包括鹽酸阿霉素、伊立替康等。

所述葉酸和含有磷酰膽堿結構的齊聚物修飾的氧化石墨烯，可以經導管介入到肝癌供血血管局部時，會引起局部的快速栓塞，起到切斷腫瘤血供的作用。在栓塞血管后，葉酸結構可以增強石墨烯復合物與葉酸受體過表達的腫瘤細胞的親和作用，而石墨烯上負載的藥物可以緩慢釋放，起到增強腫瘤治療效果的作用。

因此，利用本發明所得負載藥物的氧化石墨烯，能夠提出一種新的腫瘤血管栓塞方法，將含有磷酰膽堿結構齊聚物進行親水修飾的氧化石墨烯利用導管灌注到腫瘤供血血管局部，利用該物質在血管內快速團聚并引起局部凝血的方法形成局部血栓，從而起到栓塞血管的作用。同時，在氧化石墨烯上連接葉酸結構，可以起到與葉酸受體過表達的腫瘤細胞更好的相互作用，有利于石墨烯表面負載的抗腫瘤藥物的輸送，可以起到更好的腫瘤治療效果。

技術效果：相對于現有技術，本發明提供了一種新的葉酸-磷酰膽堿齊聚物修飾的氧化石墨烯，能夠利用修飾后的氧化石墨烯誘發肝動脈血栓，起到栓塞腫瘤組織的效果，同時氧化石墨烯上負載的阿霉素會持續的釋放，起到殺滅癌細胞的作用。跟傳統碘油系的tace療法相比，利用本發明所得載藥氧化石墨烯治療腫瘤，療法更加簡單，而且化療的效果會更加出色，避免了傳統療法中由于化療藥物的迅速擴散而引起的副作用。

附圖說明

圖1：修飾后的氧化石墨烯(go-pcn-fa)的載藥量和體外釋放曲線；

圖2：tace前后兔子肝組織血管造影圖像；

圖3：tace后的病理檢查，以及go-pcn-fa的分布。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但本發明要求保護的范圍并不局限于實施例所描述的范圍。

實施例：

葉酸和含有磷酰膽堿結構的齊聚物修飾的氧化石墨烯的制備方法：

采用改進的hummers方法合成氧化石墨烯(以下稱go)。將2g石墨置入裝有25ml濃硫酸的圓底燒瓶中，在冰水浴中攪拌均勻，再加入0.5g硝酸鈉，磁力攪拌20分鐘，然后分三次共加入8g高錳酸鉀，繼續磁力攪拌30min。將反應體系升溫至35℃，攪拌30分鐘后，向燒瓶中加入100ml去離子水，升溫至98℃，繼續攪拌30分鐘。向燒瓶中加入150ml30％的過氧化氫水溶液，去除未反應完的高錳酸鉀，此時溶液變為亮黃色。然后分別用5％的鹽酸和去離子水離心洗滌，直至上層清液用鋇鹽檢測不到硫酸根的存在。將產物放在60℃真空干燥箱中干燥48小時。

將200mg氧化石墨烯粉末置入250ml的的圓底燒瓶中，加入80ml氯化亞砜(socl2)，在65℃下強力超聲3個小時，使go在氯化亞砜中分散均勻。再將燒瓶置于50℃的油浴鍋中，冷凝回流24小時，待氧化石墨烯和氯化亞砜充分反應后，使用旋轉蒸發儀將剩余的氯化亞砜蒸餾干凈，得到酰氯化的氧化石墨烯(go-cocl)。隨后，邊超聲邊向燒瓶中緩慢滴加150ml乙醇胺，在室溫下攪拌24小時，反應完全后加入過量丙酮，離心分離收集沉淀部分，并用無水乙醇洗滌三次，產物放在50℃下真空干燥48小時，得到羥基化的氧化石墨烯(go-oh)。

取100mg羥基化的氧化石墨烯，置于250ml的圓底燒瓶中，加入50ml四氫呋喃，超聲分散后再加入10ml的三乙胺，常溫下磁力攪拌3小時。隨后向燒瓶中加入10g2-溴異丁酰溴，繼續攪拌24小時。反應完成后向燒瓶中加入100ml去離子水，將溶液進行離心分離，收集底部沉淀，用無水乙醚洗滌若干次，將產物在室溫下真空干燥24小時，備用。

取100mg上述干燥后的產物置于100ml的圓底燒瓶中，加入25ml甲醇，超聲分散，再加入0.9g2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿(mpc)和0.1g甲基丙烯酸氨基乙酯(ama)，通入氮氣，待整個體系中的空氣除盡后，加入40mg溴化亞銅(cubr)和100mg2-2聯吡啶，然后常溫攪拌24小時。反應完全后使用丙酮將產物沉淀下來，并離心分離，得到的產物用無水乙醚洗滌若干次后在室溫下真空干燥24小時，記為go-pcn。

取100mg的go-pcn粉末，置于100ml的圓底燒瓶中，再加入30mg葉酸粉末和50ml無水的二甲基甲酰胺(dmf)，超聲分散。隨后向燒瓶中加入30mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和18mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，常溫下磁力攪拌24小時。反應結束后，將產物在純水中透析3至5天，最后使用離心分離收集底部沉淀，然后在室溫下真空干燥24小時，得到go-pcn-fa粉末。

鹽酸阿霉素在葉酸和含有磷酰膽堿結構的齊聚物修飾的氧化石墨烯上的負載

取適量go-pcn-fa粉末，與純水配置成1mg/ml的溶液，超聲使其良好分散。再取適量鹽酸阿霉素，與純水配置成0.5mg/ml的溶液。將30ml上述阿霉素溶液與10ml上述go-pcn-fa溶液混合，超聲5min后放入37℃的搖床中，頻率為80轉/min，使dox和go-pcn-fa充分接觸和負載。24小時后，將混合液在10000轉/min的條件下離心10分鐘，收集底部沉淀，并在室溫下真空干燥48小時得到dox@go-pcn-fa，于5℃下保存備用。

附圖1修飾后的氧化石墨烯(go-pcn-fa)的載藥量和體外釋放曲線，如圖所示，左側圖顯示隨著載藥過程中藥物dox與載體go-pcn-fa的比例逐漸增大，go-pcn-fa上負載的藥物量逐漸增大，但整體藥物負載率逐漸下降。當達到dox:go-pcn-fa的重量比大約1.5時，負載量達到飽和的大約20％重量比，繼續增大這一比例并不會使藥物負載量顯著提升。右側圖顯示了dox@go-pcn-fa在不同ph值的緩沖溶液中的藥物釋放曲線。可見在酸性環境下，dox更容易從dox@go-pcn-fa復合體系中釋放出來，而且在初期的12小時中表現出更大的藥物釋放速率。

在兔vx2肝癌模型上進行tace術治療和評估

將vx2肝癌模型兔用3％戊巴比妥鈉以40mg/kg的劑量靜脈注射全麻后，以仰臥位固定四肢于手術臺上，常規雙側腹股溝區備皮、消毒、鋪巾，在腹股溝區沿股動脈走形縱行切開皮膚，暴露股動脈鞘，小心剪開股動脈鞘，分離出一段長約3-4cm的股動脈，近端用絲線穿過并提起，保持適當張力以暫時阻斷血流。用眼科剪在股動脈前壁剪一小“v”形切口，插入4f導管鞘進入股動脈并向近端推進，結扎近端絲線以固定導管鞘。

將dox@go-pcn-fa分散于蒸餾水中(5.0mg/ml)，在冰水浴中以超聲震蕩分散，經導管鞘引入2.7f微導管，選擇性插管至腹腔干和肝左、右動脈，dsa下造影，觀察血管形態以及肝臟腫瘤血供。證實腫瘤染色后在dsa透視下經腫瘤供血動脈緩慢注入go-pcn-fa分散液，栓塞腫瘤直至腫瘤染色基本消失(根據腫瘤大小，量約0.2-0.3ml)。術畢拔管，以可吸收縫線結扎股動脈止血，包扎。tace術后3天內后行動態增強ct掃描評估病灶情況。

附圖2是tace前后兔子肝腫瘤部位的血管造影圖像。可以看出術后三天，腫瘤部位的主血管均被栓死，末端的毛細血管觀察不到血管造影，證明其并無血流通過。

如圖3是tace后的病理檢查，以及go-pcn-fa的分布(白色箭頭)。(a)腫瘤微血管內栓塞；(b)腫瘤內血管栓塞；(c)腫瘤實質內栓塞；(d)正常肝組織(右邊部分)與腫瘤組織(左邊部分)內的go-pcn-fa分布對比；值得注意的是，腫瘤組織內的go-pcn-fa沉積顯著高于周圍正常肝臟組織，驗證了氧化石墨烯上接枝的葉酸帶來的靶向效應。