本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是山藥水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物雌激素(phytoestrogen,pe)來源于植物，是一類具有雌激素樣作用的活性成分，與類固醇激素—17β-雌二醇有相似的結(jié)構(gòu)。植物雌激素與雌激素受體(estrogenreceptor,er)結(jié)合，雌激素受體與配體結(jié)合后誘導(dǎo)形成雌激素受體同源或異源二聚體，接著激活細胞核與細胞外的信號通路發(fā)揮雌激素樣作用。有報道稱長期使用合成的雌激素易產(chǎn)生高凝血狀態(tài)、高血壓、水腫等副反應(yīng)，并有可能會增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率。而植物雌激素是一類不良反應(yīng)小，對生殖系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及中樞神經(jīng)等方面具有廣泛的作用的天然化合物，應(yīng)用起來更加安全，因此對含有植物雌激素的中藥的作用研究逐漸成為熱點。
山藥為薯蕷科植物薯蕷dioscoreaoppositathunb.的干燥根莖。冬季莖葉枯萎后采挖，切去根頭，洗凈，除去外皮和須根，干燥，或趁鮮切片，干燥。中國藥典中記載，山藥性甘，平。歸脾、肺、腎經(jīng)，具有補脾養(yǎng)胃，久瀉不止，肺虛喘咳，腎虛遺精，帶下，尿頻，虛熱消渴的功效。可見山藥的藥理作用十分廣泛，但目前對山藥水提物雌激素的研究還未見公開報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種山藥水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，可有效解決山藥水提物的制備及其治療雌激素缺乏癥的用藥問題。
本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種山藥水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，所述的山藥水提物是，將山藥洗凈，切片烘干，每次加10倍藥物重量的水煎煮3次，第一次先加10倍重量的水浸泡30min，煎煮30min，過濾，得第一次濾液；藥渣再加藥物10倍重量的水，煎煮30min，過濾，得第二次濾液；第二次藥渣再加藥物10倍重量的水，煎煮30min，過濾，得第三次濾液，合并三次濾液，減壓濃縮，真空干燥得山藥水提物。
本發(fā)明山藥水提物具有雌激素樣活性，作為唯一活性成分有效用于制備雌激素類藥物，開拓了山藥的藥用價值和商業(yè)價值，有良好的經(jīng)濟和社會效益。
具體實施方式
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作詳細說明。
實施例1
本發(fā)明在具體實施中，一種山藥水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，所述的山藥水提物是，將山藥洗凈，切片烘干，取干山藥100g，每次加1000ml的水煎煮3次，第一次先加1000ml的水浸泡30min，煎煮30min，過濾，得第一次濾液；藥渣再加1000ml的水，煎煮30min，過濾，得第二次濾液；第二次藥渣再加1000ml的水，煎煮30min，過濾，得第三次濾液，合并三次濾液，減壓濃縮，真空干燥得山藥水提物，提取率為16.3％。
實施例2
本發(fā)明在具體實施中，一種山藥水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，所述的山藥水提物是，將山藥洗凈，切片烘干，取干山藥50g，每次加500ml的水煎煮3次，第一次先加500ml的水浸泡30min，煎煮30min，過濾，得第一次濾液；藥渣再加500ml的水，煎煮30min，過濾，得第二次濾液；第二次藥渣再加500ml的水，煎煮30min，過濾，得第三次濾液，合并三次濾液，減壓濃縮，真空干燥得山藥水提物，提取率為15.9％。
實施例3
本發(fā)明在具體實施中，一種山藥水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，所述的山藥水提物是，將山藥洗凈，切片烘干，取干山藥150g，每次加1500ml的水煎煮3次，第一次先加1500ml的水浸泡30min，煎煮30min，過濾，得第一次濾液；藥渣再加1500ml的水，煎煮30min，過濾，得第二次濾液；第二次藥渣再加1500ml的水，煎煮30min，過濾，得第三次濾液，合并三次濾液，減壓濃縮，真空干燥得山藥水提物，提取率為16.8％。
本發(fā)明提取物作為唯一活性成分經(jīng)實驗和實際應(yīng)用，具有雌激素樣活性和有效用于制備雌激素藥物，有關(guān)試驗資料如下：
本發(fā)明首先通過小鼠子宮增重實驗對山藥水提物進行雌激素樣活性的篩選，接著采用mcf-7細胞增殖實驗對山藥水提物進行體外雌激素樣活性的篩選，并且分析山藥水提物對性未成熟雌性小鼠的臟器系數(shù)、血清e2(雌二醇)、lh(促黃體生成素)的影響，初步探討其作用特點。
1實驗材料
實驗藥物
本發(fā)明山藥水提物。
實驗動物與細胞株
清潔級昆明種小鼠，雌性，出生21天(剛斷乳)，體重9～12g，購自于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：scxk(京)2016-0011。人乳腺癌細胞(mcf-7)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心。
1.3儀器與試劑
戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥)；酶標儀(bio-rad680)；zrd-7080全自動新型鼓風(fēng)干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；微量加樣器(nichipetexplus)；ab204-n電子讀數(shù)分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品)；10cm培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板、凍存管(corning)；普通手術(shù)器械；90-3磁力攪拌器(上海振捷實驗設(shè)備有限公司)；倒置顯微鏡(nikoneclipsets100)；二氧化碳培養(yǎng)箱(stik)；sorvallst16rcentrifuge高速低溫冷凍離心機(thermofisherscientific公司)。
2實驗方法
2.1小鼠子宮增重實驗
將小鼠按體重均衡和隨機的原則分組，連續(xù)給藥7天。正常組每日蒸餾水0.02ml/g灌胃；陽性對照組隔日灌胃戊酸雌二醇(0.33mg/kg/d)灌胃；山藥水提物按藥典規(guī)定人用藥量的20倍量×提取率為低劑量、40倍量×提取率為高劑量計算，配成相應(yīng)濃度的混懸液，每日按0.02ml/g灌胃。最后一次給藥24h后，摘眼球取血，立即摘取子宮稱重，計算子宮系數(shù)(子宮濕重×(體重)-1×100％)。實驗平行重復(fù)三次。結(jié)果與正常組相比，計算p值，考察有無統(tǒng)計學(xué)意義。
2.2mcf-7細胞增殖實驗
mcf-7細胞經(jīng)含5％去雌激素胎牛血清的無酚紅dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后，選取對數(shù)生長期細胞，pbs洗兩次，用0.05％胰蛋白酶消化后，加入無酚紅dmem培養(yǎng)基吹打均勻，以2×104個/ml的濃度接種于96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)總體積為200μl。培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，換為含藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。37℃、5％co2培養(yǎng)48h后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150μldmso，震蕩5-10min，使紫色結(jié)晶完全溶解。用酶標儀在490nm下測定各孔吸光度值(a)，計算平均a值和細胞活力。實驗平行重復(fù)三次。
細胞活力＝各組od值/正常組od值
2.3elisa法檢測血清e2、lh
小鼠摘眼球取血，3000轉(zhuǎn)離心10min，取上清。按照elisa試劑盒說明書仔細操作。
2.4統(tǒng)計方法
采用spss20.0軟件進行單因素方差分析統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)以
3.實驗結(jié)果
3.1山藥水提物對mcf-7細胞促增殖的作用
山藥水提物在10-2mg/ml時與正常組比，對mcf-7細胞有顯著的促增殖作用(p<0.05)，提示山藥水提物在體外具有雌激素樣作用，結(jié)果見表1。
表1山藥水提物對促mcf-7細胞增殖的作用(
注:與正常組比較，表示p<0.05，表示p<0.01。
3.2山藥水提物對小鼠子宮和胸腺系數(shù)的影響
與正常組相比，山藥水提物能顯著的增加性未成熟雌性小鼠的胸腺系數(shù)和子宮系數(shù)(p<0.05)，提示山藥水提物在動物體內(nèi)產(chǎn)生了雌激素樣作用，結(jié)果見表2。
表2山藥水提物對小鼠子宮和胸腺系數(shù)的影響
注:與正常組比較，表示p<0.05，表示p<0.01。
3.3山藥水提物對小鼠血清e2和lh的影響
與正常組相比，山藥水提物能顯著增加小鼠血清e2、lh的水平(p＜0.01)，提示山藥水提物在體內(nèi)具有雌激素樣作用，可能與其增加血清中e2以及l(fā)h的水平有關(guān)，結(jié)果見表3。
表3山藥水提物對小鼠血清e2和lh的影響
注:與正常組比較，表示p<0.05，表示p<0.01。
四結(jié)論
子宮中含有大量的雌激素受體，雌激素類物質(zhì)通過與該受體結(jié)合，可誘導(dǎo)子宮靶蛋白含量增加，表現(xiàn)為子宮組織增生等，因此可以通過測定外源雌激素對性未成熟小鼠子宮促增長作用來評價藥物的雌激素樣活性。本實驗采用性未成熟雌性小鼠子宮濕重與體重之比(子宮系數(shù))作為評價雌激素樣活性的指標。實驗結(jié)果表明，山藥水提物可顯著增加性未成熟小鼠子宮系數(shù)，提示山藥水提物在體內(nèi)具有雌激素樣作用。
mcf-7細胞是雌激素受體陽性的人乳腺癌細胞株，能特異地受雌激素或雌激素樣活性物質(zhì)調(diào)節(jié)而增殖，是最常用的檢測雌激素樣活性的細胞株。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山藥水提物在濃度為0.01mg/ml時對mcf-7細胞有顯著的促增殖作用。提示山藥水提物在體內(nèi)、體外均有一定的雌激素樣作用。
雌二醇是體內(nèi)主要由卵巢成熟濾泡分泌的一種天然雌激素，能促進和調(diào)節(jié)女性性器官及副性征的正常發(fā)育。促黃體生成素由垂體產(chǎn)生的一種激素在在女性中刺激卵巢分泌女性雌激素。實驗發(fā)現(xiàn)，山藥水提物可以顯著增加性未成熟雌性小鼠的血清e2以及l(fā)h的水平。推測山藥水提物增加小鼠子宮系數(shù)發(fā)揮雌激素樣活性可能與其增加體內(nèi)e2以及l(fā)h的水平有關(guān)。
實驗證明，山藥水提物作為唯一活性成分有效用于制備雌激素藥物，實現(xiàn)山藥水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，開拓了制備雌激素類藥物的新途徑，提高了山藥的藥用價值和商業(yè)價值，有良好的經(jīng)濟和社會效益。