本發明屬于海洋生物技術領域，尤其涉及一種浮顫藻水提取物及其應用。

背景技術：

微藻是一群生理學和生物形態學異構的單細胞微生藻類，地球上的品種超過20萬種。微藻能產生許多生物活性物質，大多數運用于藥物生產、食品或飼料添加劑、化妝品和其他應用中。

活性氧，如超氧陰離子、羥基自由基、過氧化氫自由基等，會攻擊脂質、蛋白質、酶、dna、rna等生物活性分子，導致細胞或組織損傷老化甚至致癌。抗氧化劑可有效清除活性氧，保護機體免受活性氧的損害。微藻作為一類具有重要研究利用價值的海藻，其抗氧化性一直是研究的熱點之一。目前，已報道具有抗氧化活性的微藻主要有以下幾種：螺旋藻、球等鞭金藻、薔薇藻、紫球藻、扁藻和小球藻。

浮顫藻(planktothrixsp.)，隸屬絲狀藍藻屬，顫藻目，沒有異形細胞和厚壁孢子，具有獨立的毛狀體和充氣液泡，通過細胞分裂生長形成毛狀體，和顫藻目的其它微藻不同，這些毛狀體具有趨光性，能輕微的運動。經檢索，未見浮顫藻相關應用的報道。

技術實現要素：

本發明的的在于提供一種浮顫藻水提取物及其在制備具有抗氧化功能的保健食品和藥品中的應用。本發明提供的浮顫藻水提取物是通過將新鮮的浮顫藻濕藻反復凍融，離心去上清；取沉淀加乙醇進行超聲提取，離心去上清；取沉淀，用水洗滌后加水進行加熱提取制得，具有顯著的抗氧化作用，可應用于制備具有抗氧化功能的保健食品和藥品。

為實現本發明的目的，本發明的技術方案如下：

一種浮顫藻水提取物，其制備方法包括如下步驟：

s1、取新鮮的浮顫藻濕藻，在溫度為-20℃～-40℃的條件下冷凍10～12小時，室溫融化10～12小時，反復凍融3～5次，在轉速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；上清液即為浮顫藻胞內液；

s2、向步驟s1所述的沉淀中加入體積分數為70％～99％的乙醇超聲提取2～4次，在轉速為5000r/min～10000r/min的條件下離心10～15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s3、用一級水洗滌步驟s2所述的沉淀1～3次，在轉速為5000r/min～10000r/min的條件下離心10～15min，將上清液和沉淀分離，去上清液，向沉淀中加入一級水在溫度為70℃～100℃的條件下提取3～5次，每次30～60min，在轉速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，取上清液，即得浮顫藻水提取物。

優選地，步驟s2中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入乙醇進行超聲提取。

優選地，步驟s2中超聲提取的頻率為35～40khz，溫度為4℃。

優選地，步驟s2中每次超聲提取的時間為10～30min。

優選地，步驟s3中按濕藻與一級水的固液比1g/ml加入一級水進行加熱提取。

在整體動物水平上以氧化應激模型及衰老相關模型進行試驗的試驗結果表明，300mga/ml的浮顫藻水提取物可以顯著提高氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的存活率，延長其平均壽命，具有顯著的抗氧化、抗衰老作用。因此，本發明提供的浮顫藻水提取物具有顯著的抗氧化作用，可應用于制備具有抗氧化功能的保健食品和藥品。

在試驗過程中也發現，經100mga/ml的浮顫藻水提取物飼喂后，氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的存活率降低，平均壽命縮短，但與對照組相比，無顯著差異。

同時，本發明發明人在進一步的研究中，也發現上述制備浮顫藻水提取物過程中，步驟s1得到的浮顫藻胞內液同樣具有一定的抗氧化作用，也可應用于制備具有抗氧化功能的保健食品和藥品。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

(1)本發明提供浮顫藻的新應用，浮顫藻水提取物和胞內液具有顯著的抗氧化作用，可應用于制備具有抗氧化功能的保健食品和藥品。

(2)本發明提供的浮顫藻水提取物可以顯著提高氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的存活率，緩解秀麗隱桿線蟲由氧化脅迫引起的早衰現象，具有顯著的抗氧化作用。

(2)本發明提供的浮顫藻水提取物能夠促進體內ros的清除，降低體內ros水平，具有顯著的抗氧化能力。

附圖說明

圖1浮顫藻水提取物對氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響。

圖2浮顫藻水提取物對秀麗隱桿線蟲體內ros水平的影響。

圖3浮顫藻胞內液對氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響。

圖4浮顫藻胞內液對自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命的影響。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明做進一步的詳細說明。

本發明所述浮顫藻(planktothrixsp.)由中國科學院水生生物研究所提供，其在中國科學院淡水藻種庫中的編號為fachb-1365。

本發明所述一級水符合gb/t6682-2008中一級水的標準。

本發明所述的抗氧化作用是指對以病理或生理條件下因發生氧化應激反應所產生的變化為主要特征的衰老及衰老相關疾病的防治作用。

本發明浮顫藻水提取物可單獨或與其他活性成分合用，作為唯一或主要活性成分應用于制備具有抗氧化功能的保健食品和藥品，所述保健食品和藥品的劑型優選為片劑、膠囊劑、注射液、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑和滴丸劑等。

本發明實施例中所使用的試驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材料、試劑，如無特殊說明，均為可從商業途徑得到的試劑和材料。

sbasal溶液：稱取5.8gnacl，1.3gk2hpo4·3h2o和6.0gkh2po4置于試劑瓶中，加入750ml去離子水，完全溶解后定容至1l，滅菌30min，冷卻至40-50℃備用。

smedium溶液：取1l滅菌后的sbasal溶液，逐滴加入1ml5.0mg/ml膽固醇乙醇溶液，邊加變振搖，使其充分溶解(溶液由無色透明轉為微乳白透明，無明顯沉淀)，然后依次加入3ml1mcacl2溶液，3ml1mmgso4，10ml1m檸檬酸鉀溶液(ph＝6.0)和10ml微量元素溶液，常溫放置備用。

實施例1浮顫藻水提取物的制備

s1、取新鮮的浮顫藻濕藻，在溫度為-20℃的條件下冷凍12小時，室溫融化10小時，反復凍融5次，在轉速為8000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分數為80％的乙醇超聲提取3次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時間為30min，在轉速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s3、用一級水洗滌步驟s2所述的沉淀2次，在轉速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，去上清液，向沉淀中按濕藻與一級水的固液比1g/ml加入一級水在溫度為100℃的條件下提取4次，每次45min，在轉速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取上清液，加一級水調節其相對于浮顫藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示浮顫藻濕藻)，即得浮顫藻水提取物。

此外，取步驟s1離心后分離得到的上清液，加一級水調節其相對于浮顫藻(濕藻)重量的濃度為2ga/ml(a表示浮顫藻濕藻)，即得浮顫藻胞內液。

實施例2浮顫藻水提取物的制備

s1、取新鮮的浮顫藻濕藻，在溫度為-30℃的條件下冷凍12小時，室溫融化12小時，反復凍融4次，在轉速為10000r/min的條件下離心5min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分數為90％的乙醇超聲提取3次，超聲提取的頻率為35khz，溫度為4℃，每次超聲的時間為20min，在轉速為10000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s3、用一級水洗滌步驟s2所述的沉淀3次，在轉速為10000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，去上清液，向沉淀中按濕藻與一級水的固液比1g/ml加入一級水在溫度為90℃的條件下提取3次，每次30min，在轉速為10000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取上清液，加一級水調節其相對于浮顫藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示浮顫藻濕藻)，即得浮顫藻水提取物。

實施例3浮顫藻水提取物的制備

s1、取新鮮的浮顫藻濕藻，在溫度為-40℃的條件下冷凍10小時，室溫融化12小時，反復凍融3次，在轉速為5000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分數為70％的乙醇超聲提取4次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時間為20min，在轉速為5000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s3、用一級水洗滌步驟s2所述的沉淀2次，在轉速為10000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，去上清液，向沉淀中按濕藻與一級水的固液比1g/ml加入一級水在溫度為70℃的條件下提取5次，每次60min，在轉速為10000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取上清液，加一級水調節其相對于浮顫藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示浮顫藻濕藻)，即得浮顫藻水提取物。

實施例4浮顫藻水提取物對氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響

百草枯，學名甲基紫精，是一種強氧化劑，可誘導體內大量產生活性氧自由基(ros)，使機體處于氧化脅迫環境，進而出現早衰現象。

取實施例1制得的浮顫藻水提取物，按終濃度300mga/ml加入到成蟲初期的野生型秀麗隱桿線蟲(n2)(由美國明尼蘇達大學秀麗隱桿線蟲遺傳信息保藏中心提供)中，對照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養24h后，加入終濃度為50mm的百草枯進行氧化脅迫造模，然后每隔12h統計秀麗隱桿線蟲存活的比例，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的存活率以生存曲線表示，結果用kaplan-meier法進行分析。結果如圖1所示。

圖1結果顯示，300mga/ml的浮顫藻水提取物能夠顯著延長氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命，提高其存活率，說明本發明提供的浮顫藻水提取物能夠緩解由氧化脅迫引起的早衰現象，具有顯著的抗氧化作用。

實施例5浮顫藻水提取物對秀麗隱桿線蟲體內ros水平的影響

取24孔培養板，設試驗組和對照組，每組設兩個孔，每孔終體積為1ml，試驗組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和實施例1制得的浮顫藻水提取物，浮顫藻水提取物的終濃度100mga/ml，對照組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和與試驗組浮顫藻水提取物等體積的smedium溶液，置于20℃培養24h后，每孔加入百草枯至終濃度為2mm，繼續培養48h后，收集各組秀麗隱桿線蟲，將其分別在冰浴條件下勻漿，將勻漿液在4℃、10000g條件下離心5min，收集上清液，向上清液中加入終濃度為50μm的dcfh-da探針(購于sigma公司，cas號：2044-85-1)溶液，利用熒光酶標儀在485nm激發波長和538nm發射波長下檢測熒光強度，室溫檢測2h，每10min測一次，結果如圖2所示。

圖2結果顯示，與對照組相比，經浮顫藻水提取物飼喂后，秀麗隱桿線蟲體內ros水平顯著下降。試驗結果表明本發明提供的浮顫藻水提取物能夠促進體內ros的清除，降低體內ros水平，具有顯著的抗氧化能力。

實施例6浮顫藻胞內液對氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響

取實施例1制得的浮顫藻胞內液，按終濃度100mga/ml分別加入到成蟲初期的野生型秀麗隱桿線蟲(n2)中，對照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養24h后，加入終濃度為50mm的百草枯進行氧化脅迫造模，然后每隔12h統計秀麗隱桿線蟲存活的比例，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的存活率以生存曲線表示，結果用kaplan-meier法進行分析。結果如圖3所示。

圖3結果顯示，浮顫藻胞內液能夠延長氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的生存時間，提高其存活率。試驗結果表明本發明提供的浮顫藻胞內液能夠緩解由氧化脅迫引起的早衰現象，具有顯著的抗氧化作用。

實施例7浮顫藻胞內液對自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命的影響

向同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)中加入終濃度為100mga/ml的實施例1制得的浮顫藻胞內液，對照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養，然后每隔1天統計秀麗隱桿線蟲的存活情況，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的壽命以生存曲線表示，結果用kaplan-meier法進行分析。結果如圖4所示。

圖4結果顯示，與對照組相比，浮顫藻胞內液能夠延長自然條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命。試驗結果表明本發明提供的浮顫藻胞內液具有延緩衰老進程的作用，即具有抗衰老作用。

以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的保護范圍。