本發明屬于獸用生物制品
技術領域：
，尤其涉及一種用傳代細胞系生產豬偽狂犬病活疫苗的方法。
背景技術：
：豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒引起一種急性傳染病。該傳染病遍布世界主要養豬國家。免疫接種是預防豬偽狂犬病的主要措施。我國目前生產豬偽狂犬病活疫苗所用的細胞未雞胚成纖維細胞和st細胞。由于每批雞胚原材料的差異，使得雞胚成纖維原代細胞的批間差異大；用雞胚成纖維細胞培養豬偽狂犬病病毒的病毒滴度不高，給疫苗產量、效力的提高帶來困難，而且細胞碎片與雜蛋白多，容易引起過敏反應。中國專利(cn101695573b)提供了一種用傳代細胞源生產偽狂犬病活疫苗的方法及其偽狂犬病活疫苗產品。該方法包括如下步驟：用傳代細胞培養偽狂犬病病毒弱毒株；收獲得到的細胞培養毒液；再加入穩定劑和抗生素，經冷凍真空干燥得到傳代細胞源偽狂犬病活疫苗。傳代細胞為豬睪丸傳代細胞st、豬腎傳代細胞pk15或ibrs-2。而st細胞來源于豬，容易帶上外源病毒，從而對生產豬偽狂犬病活疫苗有很大的影響。技術實現要素：為解決上述問題，本發明提供了一種用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法，所用傳代細胞系為vero細胞。利用本發明生產方法得到的病毒含量高，批間差異小；所得豬偽狂犬活疫苗穩定性高，保存時間長。本發明通過以下技術方案實現：一種用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步驟：s1.制苗用細胞的傳代與培養：將傳代細胞經edta-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液繼續培養，形成單層時，用于繼續傳代或接種病毒；s2.細胞毒種的繁殖：將偽狂犬病病毒弱毒株接種生長良好的上述傳代細胞單層，用細胞維持液繼續培養；2～3日后收獲細胞培養毒液作為生產用毒種；s3.制苗毒液的繁殖：取已形成單層的上述傳代細胞培養瓶，棄去細胞生長液，接種上述含毒的維持液，繼續培養；接毒后2～3日收獲細胞培養毒液，收獲的毒液置-15℃以下保存；s4.配苗、分裝及凍干：將病毒培養液，混合于同一容器內，加入穩定劑，同時加入抗生素，充分搖勻，定量分裝；分裝后進行冷凍真空干燥后即得；所述穩定劑由以下成分及其終濃度組成：白蛋白3-6％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2-3％w/v、l-谷氨酸0.5-1.5％w/v、腐胺1-3％w/v、蔗糖2-5％w/v和檸檬酸鈉3-7％w/v。優選地，所用傳代細胞系為vero細胞。優選地，步驟s1所述細胞生長液包括以下成分及其含量：dmem液85-90％，無患子皂苷1-5％和新生牛血清5-14％。優選地，步驟s1所述細胞生長液由以下成分及其含量組成：dmem液89％，糖萜素0.25％，無患子皂苷2.75％和新生牛血清8％；且ph值為7.0-7.2。優選地，步驟s2所述細胞維持液包括以下成分及其含量：dmem液93-95％，蔗糖1-3％，乳酸鏈球菌肽0.01-0.05％，甘油0.5-1.5％，糖萜素0.1-0.3％和新生牛血清2-5.5％；優選地，步驟s2所述細胞維持液由以下成分及其含量組成：dmem液94％，蔗糖2％，乳酸鏈球菌肽0.03％，甘油1％和新生牛血清3％，且ph值為7.0-7.4。優選地，步驟s2所述穩定劑由以下成分及其終濃度組成：白蛋白4％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2.5％w/v、l-谷氨酸1％w/v、腐胺2.75％w/v、蔗糖3.5％w/v和檸檬酸鈉5％w/v。優選地，步驟s3接種時的接種量為1％～2％體積百分比的生產用細胞種毒的維持液。無患子皂苷含有豐富的糖苷類物質，主要為三萜皂苷類、倍半萜糖苷類，除此外還含有豐富的營養物質，如：還原糖，脂肪酸，油脂，油酸，類胡蘿卜素，菸酸，核黃素，蛋白質，維生素c、維生素a、維生素b及賴氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸和組氨酸等10多種氨基酸，是一種天然的非離子型表面活性劑。在本發明細胞生長液中加入無患子皂苷有利于vero細胞的傳代培養，并且由實施例1制備得到的病毒效價明顯高于對比例1，說明由本發明含有無患子皂苷的細胞生長液所培養得到的vero細胞有利于偽狂犬病病毒的增殖和病毒液分泌。本發明細胞維持液除dmem和新生牛血清成分外，還含有蔗糖、乳酸鏈球菌肽、甘油和糖萜素成分。這些成分的加入不僅能夠促進病毒液的分泌，而且還對病毒液具有保護作用。本發明所用的穩定劑由白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、l-谷氨酸、腐胺、蔗糖2和檸檬酸鈉組成，由試驗例3可知，本發明穩定劑疫苗保護作用顯著。本發明用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法，與現有技術相比，具有以下優異效果：(1)本發明以vero細胞作為傳代細胞系，能夠制得高效價的病毒液，從而克服了用雞胚成纖維細胞培養豬偽狂犬病病毒的病毒滴度不高、細胞碎片與雜蛋白多，容易引起過敏反應的問題；(2)本發明制備得到的疫苗穩定性高、保持期長，從而有利于豬偽狂犬活疫苗的運輸和貯存。具體實施方式下面將結合實施例進一步的詳細說明本發明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發明要求保護的技術方案的舉例說明，并非對這些技術方案的任何限制。本發明的保護范圍以所附權利要求書記載的內容為準。無患子皂苷購于四川三禾田生物技術有限公司；新生牛血清購于南京迪安生物科技有限公司；乳酸鏈球菌肽cas號1414455，購于上海將來實業股份有限公司。實施例1一種用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法所述用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法，分為以下步驟：s1.制苗用vero細胞的傳代與培養：將傳代細胞經edta-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液繼續培養，形成單層時，用于繼續傳代或接種病毒；所述細胞生長液由以下成分及其含量：dmem液89％，無患子皂苷3％和新生牛血清8％；且ph值為7.2；s2.vero細胞毒種的繁殖：將偽狂犬病病毒弱毒株接種生長良好的上述傳代細胞單層，用細胞維持液繼續培養；3日后收獲細胞培養毒液作為生產用毒種；所述細胞維持液由以下成分及其含量組成：dmem液94％，蔗糖2％，乳酸鏈球菌肽0.03％，甘油1％，糖萜素0.25％和新生牛血清3％，且ph值為7.4；s3.制苗毒液的繁殖：取已形成單層的上述傳代細胞培養瓶，棄去細胞生長液，接種上述含毒的維持液，接種量為1.5％，繼續培養；接毒后3日收獲細胞培養毒液，收獲的毒液置-15℃以下保存；s4.配苗、分裝及凍干：將病毒培養液，混合于同一容器內，加入穩定劑，同時加入抗生素，充分搖勻，定量分裝；分裝后進行冷凍真空干燥后即得；所述穩定劑由以下成分及其終濃度組成：白蛋白4％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2.5％w/v、l-谷氨酸1％w/v、腐胺2.75％w/v、蔗糖3.5％w/v和檸檬酸鈉5％w/v。實施例2一種用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法所述用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法，分為以下步驟：s1.制苗用vero細胞的傳代與培養：將傳代細胞經edta-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液繼續培養，形成單層時，用于繼續傳代或接種病毒；所述細胞生長液包括以下成分及其含量：dmem液90％，無患子皂苷1％和新生牛血清9％；s2.vero細胞毒種的繁殖：將偽狂犬病病毒弱毒株接種生長良好的上述傳代細胞單層，用細胞維持液繼續培養；3日后收獲細胞培養毒液作為生產用毒種；所述細胞維持液包括以下成分及其含量：dmem液93％，蔗糖1％，乳酸鏈球菌肽0.01％，甘油0.5％，糖萜素0.1％和新生牛血清5.39％；s3.制苗毒液的繁殖：取已形成單層的上述傳代細胞培養瓶，棄去細胞生長液，接種上述含毒的維持液，接種量為1％，繼續培養；接毒后3日收獲細胞培養毒液，收獲的毒液置-15℃以下保存；s4.配苗、分裝及凍干：將病毒培養液，混合于同一容器內，加入穩定劑，同時加入抗生素，充分搖勻，定量分裝；分裝后進行冷凍真空干燥后即得；所述穩定劑由以下成分及其終濃度組成：白蛋白3％w/v、聚乙烯吡咯烷酮2％w/v、l-谷氨酸0.5％w/v、腐胺1％w/v、蔗糖2％w/v和檸檬酸鈉3％w/v。實施例3一種用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法所述用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法，分為以下步驟：s1.制苗用vero細胞的傳代與培養：將傳代細胞經edta-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液繼續培養，形成單層時，用于繼續傳代或接種病毒；所述細胞生長液包括以下成分及其含量：dmem液85％，無患子皂苷5％和新生牛血清8.7％；s2.vero細胞毒種的繁殖：將偽狂犬病病毒弱毒株接種生長良好的上述傳代細胞單層，用細胞維持液繼續培養；3日后收獲細胞培養毒液作為生產用毒種；所述細胞維持液包括以下成分及其含量：dmem液93％，蔗糖3％，乳酸鏈球菌肽0.05％，甘油1.5％，糖萜素0.3％和新生牛血清2.15％；s3.制苗毒液的繁殖：取已形成單層的上述傳代細胞培養瓶，棄去細胞生長液，接種上述含毒的維持液，接種量為2％，繼續培養；接毒后2日收獲細胞培養毒液，收獲的毒液置-15℃以下保存；s4.配苗、分裝及凍干：將病毒培養液，混合于同一容器內，加入穩定劑，同時加入抗生素，充分搖勻，定量分裝；分裝后進行冷凍真空干燥后即得；所述穩定劑由以下成分及其終濃度組成：白蛋白6％w/v、聚乙烯吡咯烷酮3％w/v、l-谷氨酸1.5％w/v、腐胺3％w/v、蔗糖5％w/v和檸檬酸鈉7％w/v。對比例1一種用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法所述用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法與實施例1的區別在于步驟s1細胞生長液中不含有無患子皂苷，其它步驟均與實施例1類似。對比例2一種用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法所述用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法與實施例1的區別在于步驟s2細胞維持液中不含有糖萜素，其它步驟均與實施例1類似。對比例3一種用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法所述用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法與實施例1的區別在于步驟s4所述穩定劑中不含l-酪氨酸，其它步驟均與實施例1類似。試驗例1病毒效價檢測以vero細胞為傳代細胞，分別按照實施例1-3及對比例1-3用傳代細胞系生產豬偽狂犬活疫苗的方法制備豬偽狂犬病病毒液b1、b2、b3、b4、b5和b6，按《中華人民共和國獸藥典》(2005年版)附錄15、19頁進行檢驗，結果證明無細菌、霉菌、支原體生長；并對病毒液進行效價測定，具體結果如表1所示。表1不同病毒液效價毒液效價(tcid50/ml)b1108.3b2108.1b3108.2b4107.5b5107.8b6107.9由表1可知，利用實施例1-3生產方法得到的病毒效價均在108tcid50/ml左右，說明利用傳代細胞系vero細胞可以生產高效價豬偽狂犬活疫苗；并且均高于對比例1、對比例2生產得到的病毒液，說明本發明生產過程中所用細胞生長液和細胞維持液中有利于病毒繁殖和病毒液分泌。試驗例2疫苗成品檢驗取實施例1-3及對比例1-3制備得到的疫苗，按照《中華人民共和國獸藥典》(2010年版)進行成品檢驗，每頭份疫苗含病毒分別為108tcid50、107.6tcid50、107.8tcid50、106.8tcid50、106.5tcid50、107.0tcid50，符合“偽狂犬病活疫苗”的規定，每頭份疫苗含病毒≥106tcid50。試驗例3疫苗的穩定性試驗將試驗例2中制備得到的每份疫苗分為兩份分別置于4℃條件下保存，不同時間取樣，測定病毒含量，分別如表2所示。表24℃條件下保存期試驗由表2數據可以看出本發明制備得到的豬偽狂犬活疫苗在4℃條件下，能夠保持15天，其效價下降不超過0.5個滴度，具有顯著的穩定性，尤其是與對比例相比3相比，穩定性更為突出，這說明本發明所用穩定劑對疫苗保護效果顯著。當前第1頁12