本發明涉及一種山茶皂苷a(camelliosidea)的應用，屬功效性化妝品技術領域。

背景技術：

皮膚內黑色素含量直接決定膚色深淺，黑色素由黑素細胞合成與分泌。受遺傳、紫外線等因素的影響，可導致黑色素代謝異常，黑素細胞分泌的黑色素增加，造成局部皮膚變黑，引起黃褐斑、雀斑、老年斑和炎癥后色素沉著等。

黑素細胞中的酪氨酸在酪氨酸酶、多巴色素互變酶、二羥基吲哚酸氧化酶等酶和蛋白作用下經多巴、多巴醌、多巴色素、二羥基吲哚等中間體逐步轉化成為黑色素。酪氨酸酶(tyr)及酪氨酸酶相關蛋白1(trp-1)影響黑素細胞合成黑素的關鍵酶。抑制酪氨酸酶活性，降低酪氨酸酶相關蛋白1的表達均能減少黑色素的合成。

紫外線輻射是皮膚物理性損傷的主要因素，尤其是中波紫外線(uvb)，可導致皮膚炎癥、色素沉著、老化、皮膚癌。uvb主要作用于表皮角質形成細胞，增加其活性氧族(ros)的產生，引起一系列氧化性損傷，導致sod)含量下降，非酶自由基清除劑耗竭，過氧化最終產物丙二醛(mda)大量積累，而損傷的皮膚抗氧化防御體系會導致更多ros的產生，以正反饋形式加劇皮膚組織和細胞的損傷。超氧化物歧化酶對機體的氧化和抗氧化平衡起到了非常重要的作用，能清除超氧陰離子，保護細胞免受損傷，sod的活力高低間接反映了機體清除氧自由基的能力；mda的量常反應機體脂質過氧化的程度，mda的高低間接反映了細胞受自由基攻擊的嚴重程度。

山茶(camelliajaponica)屬于山茶科(theaceae)山茶屬(camellia)植物，其分布于云南、四川、臺灣、山東、江西等省區。灌木或小喬木，高9米，嫩枝無毛。除了作為著名的觀賞植物外，還有一定的藥用價值。其性偏涼，味辛、苦，無毒；具有散瘀消腫，止血涼血之功效；可用于治療血崩，吐血等出血癥，及燙傷和跌打損傷等癥。目前未見有抑制黑素細胞酪氨酸酶活性、降低trp-1表達及對紫外線照射細胞的抗氧化作用的公開報道。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種山茶皂苷a(camelliosidea)的應用。

本發明是這樣實現的：

1、制備山茶植物活性化合物

本發明的山茶植物活性化合物為山茶皂苷a(camelliosidea)，經由如下步驟得到：

a.選用山茶(camelliajaponical.)，將5kg干燥的山茶枝葉粉碎，分別用75％乙醇熱回流提取3次，時間依次分別為：3h、2h、2h，合并提取液，減壓回收乙醇，得到粗提物。粗提物溶解于水中，經d-101大孔樹脂柱層析，分別用水、80％乙醇和95％乙醇洗脫。回收溶劑得到80％乙醇洗脫部分和95％乙醇洗脫部分。

b.將80％乙醇洗脫部分用乙醇溶解后，用400g硅膠(80-100目)拌樣，2kg硅膠(200-300目)濕法裝柱，用氯仿-甲醇-水梯度洗脫(20:1:0→10:1:0→8:2:0.2→7:3:0.5→1:1:0.5)，tlc檢測后合并后得到三部分(fr.1-3)。經過薄層層析tlc檢測，發現fr.3富含三萜皂苷類成分，因此主要對fr.3(90g)進行分離純化。用mcigelchp20p樹脂柱對fr.3脫色，乙醇-水梯度洗脫(30％→40％→50％→60％→70％→100)，皂苷集中在50-70％洗脫部位；再通過硅膠柱層析進行濕法裝柱上樣，用氯仿-甲醇-水梯度洗脫(8:2:0.2→7:3:0.5→1:1:0.5)，得到山茶皂苷a(camelliosidea)粗品。粗品溶解于乙醇-水(2:1)中，得到結晶，再次重結晶后，過濾結晶，得到98％的山茶皂苷a(得率：0.06％)。

2、黑素細胞酪氨酸酶抑制率的測定

取對數生長期的小鼠黑素瘤b16細胞，消化，計數，將細胞接種于96孔板，接種密度為10⁴個/孔，過夜后棄去培養液，分別加入100μl/孔的藥液，陰性對照組為含溶劑dmso的培養液，空白對照組為無細胞含相應溶劑dmso的培養液，分別在37℃、5％co2細胞培養箱中培養72小時后，棄上清液，pbs洗滌2次，每孔加入50μl含1％tritonx-100的pbs，低速震蕩30min，放置于-80℃冰箱中1h，取出后37℃水浴40min，黑素細胞完全裂解。每孔加入100μl濃度為0.1％l-dopa(pbs液配制)溶液，繼續置于37℃孵育2h，用酶標儀測定在490nm處的吸光度。每組6孔，重復3次。

酪氨酸酶抑制率＝1-[(藥物組平均吸光值-空白組平均吸光值)/(陰性對照組平均吸光值-空白組平均吸光值)]×100％

3、酪氨酸酶相關蛋白(trp-1)表達的檢測

取對數生長期的小鼠黑素瘤b16細胞，接種于培養瓶中，密度為5000個/cm²，過夜培養后棄去培養液，分別加入藥液培養72h。消化離心，用pbs液洗滌3次，加入60ul/瓶細胞裂解液(含1％pmsf、1％磷酸酶抑制劑)，震蕩30min，使細胞充分裂解。勻漿離心，根據bca法測定蛋白質濃度。根據測定的蛋白濃度，計算蛋白上樣量上樣，進行sds-聚丙烯酰氨凝膠電泳，120v，電泳90min后將蛋白質轉移到pvdf膜上，2.5a，13min。取膜，封閉液室溫封閉2h，分別加入(1:200)多克隆兔抗鼠酪氨酸酶相關蛋白1(trp-1)抗體和(1:2000)內參gapdh，4℃過夜。洗膜后，加入(1:5000)辣根過氧化物酶標記的羊抗兔igg，室溫輕搖1h。充分洗膜后，做化學發光(ecl)，顯影，采用凝膠成像分析軟件分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，進行分析。計算所測目標蛋白/gapdh比值，得到目標蛋白的相對含量。

4、黑素細胞中黑素合成的檢測

取對數生長期的小鼠黑素瘤b16細胞接種于24孔板，過夜培養，棄去培養液，分別加入1ml/孔的藥液，陰性對照組為含溶劑dmso的培養液，空白對照組為無細胞含相應溶劑dmso的培養液，分別在37℃、5％co2細胞培養箱中培養72小時后，棄上清，pbs洗滌2次，加入含1mnaoh溶液120ul/孔，80℃，水浴2h。將溶解液體吹勻轉移至96孔板中(100ul/孔)，用酶標儀測定在405nm處的吸光度。每組3孔，重復3次。

黑素合成抑制率＝1-[(藥物組平均吸光值-空白組平均吸光值)/(陰性對照組平均吸光值-空白組平均吸光值)]×100％

5、細胞中的抗氧化能力評價

對數生長期的角質形成細胞hacat，以濃度為2×10⁵個/ml，接種于6孔培養板，每孔2ml，分組加藥處理12h,撤去藥液后加入pbs,以60mj/cm²的劑量照射uvb,24h后收集各組細胞，用4℃pbs洗2遍，反復凍融破碎細胞，將各管細胞懸液置于液氮中4s后，37℃水浴5min，按此操作反復凍融細胞4次，以充分破壞細胞并使其釋放出細胞成分，4000r/min離心10min，收集上清液嚴格參照試劑盒說明分別測細胞內sod和mda水平。并用bca法測定各組細胞內的蛋白濃度。

本發明的山茶皂苷a(camelliosidea)在制備護膚美白劑及抗氧化劑中的應用。

本發明的有益效果在于：山茶植物活性化合物是生態化合物，成本低，具有抑制黑素合成和提高對uvb照射細胞的抗氧化能力，能夠在制備護膚美白劑及抗氧化劑中的應用。

附圖說明

圖1為westernblot檢測酪氨酸酶相關蛋白(trp-1)的表達。

圖2顯示與空白對照組相比，uvb照射的模型組中sod的活力。

圖3顯示與uvb模型組相比，加入山茶皂苷a的紫外照射組細胞中sod的活力。

具體實施方式：

下面結合附圖，對本發明實施例來進一步說明本發明的實質內容。

實施例一：用常規方法制備山茶皂苷a(camelliosidea)

將5kg干燥的山茶枝葉粉碎，分別用75％乙醇熱回流提取3次(3h,2h,2h)，合并提取液，減壓回收乙醇，得到粗提物。粗提物溶解于水中，經d-101大孔樹脂柱層析，分別用水、80％乙醇和95％乙醇洗脫?；厥杖軇┑玫剿疵摬糠?、80％乙醇洗脫部分和95％乙醇洗脫部分。

80％乙醇洗脫部分，用乙醇溶解后，400g硅膠(80-100目)拌樣，2kg硅膠(200-300目)濕法裝柱，用氯仿-甲醇-水梯度洗脫(20:1:0→10:1:0→8:2:0.2→7:3:0.5→1:1:0.5)，tlc檢測后合并后得到三部分(fr.1-3)。經過薄層層析tlc檢測，發現fr.3富含三萜皂苷類成分，因此主要對fr.3(90g)進行分離純化。用mcigelchp20p樹脂柱對fr.3脫色，乙醇-水梯度洗脫(30％→40％→50％→60％→70％→100)，皂苷集中在50-70％洗脫部位；再通過硅膠柱層析進行濕法裝柱上樣，用氯仿-甲醇-水梯度洗脫(8:2:0.2→7:3:0.5→1:1:0.5)，得到山茶皂苷a(camelliosidea)粗品。粗品溶解于乙醇-水(2:1)中，得到結晶，再次重結晶后，過濾結晶，得到純的山茶皂苷a(得率：0.06％)。

試驗中，¹h-nmr和¹³c-nmr的1d、2dnmr譜在avanceiii600mhz超導核磁共振儀上測定(tms為內標，化學位移δ用ppm表示，耦合常數j用hz表示)；ms在xevotq-s超高壓液相色譜三重四極桿串聯質譜聯用儀上測定；紅外光譜(ir)在brukertensor-27紅外光譜儀上測定(kbr壓片)；柱層析用硅膠g(200-300目)或硅膠h(10-40μ)及薄層層析均為青島海洋華工工廠產品。反相材料分離材料(rp-8及rp-18)和反相薄層板為merck公司產品。分析和半制備用agilent1260型高效液相色譜儀，半制備色譜柱為agilent公司的zorbax-sb-c18column(5μm；25×9.4mm)。薄層層析通過5％硫酸-乙醇溶液加熱觀察其斑點。

山茶植物活性化合物山茶皂苷a(camelliosidea)的化學結構式為：

山茶皂苷a(camelliosidea):無色方晶；c53h84o24；ir(kbr)νmax3423,2944,1712,1625,1077cm^-1；positiveesi-msm/z1127[m+na]⁺；¹h-nmr(c5d5n,600mhz)：δh3.27(1h,dd,j＝13.4,4.5hz,h-3),5.46(1h,brs,h-12),1.25(3h,s,me-23),1.12(3h,s,me-24),0.83(3h,s,me-25),1.22(3h,s,me-26),1.34(3h,s,me-27),0.91(3h,s,me-29),1.00(3h,s,me-30),4.94(1h,d,j＝7.0hz,h-1'),5.84(1h,d,j＝8.1hz,h-1”),5.79(1h,d,j＝7.9hz,h-1”'),5.19(1h,,d,j＝7.9hz,h-1””)；¹³cnmrdate(c5d5n,150mhz)見表1。結構解析表明該化合物為山茶皂苷a(camelliosidea)。

山茶皂苷a(camelliosidea)的碳譜數據(c5d5n,150mhz)

實施例二：活性成分山茶皂苷a抑制黑素細胞酪氨酸酶活性的能力

取對數生長期的小鼠黑素瘤b16細胞，消化，計數，將細胞接種于96孔板，接種密度為10⁴個/孔，過夜后棄去培養液，分別加入100μl/孔15μg/ml山茶皂苷a藥液，陽性對照組為相同濃度的熊果苷溶液，陰性對照組為含溶劑dmso的培養液，空白對照組為無細胞含相應溶劑dmso的培養液，分別在37℃、5％co2細胞培養箱中培養72小時后，棄上清液，pbs洗滌2次，每孔加入50μl含1％tritonx-100的pbs，低速震蕩30min，放置于-80℃冰箱中1h，取出后37℃水浴40min，黑素細胞完全裂解。每孔加入100μl濃度為0.1％l-dopa(pbs液配制)溶液，繼續置于37℃孵育2h，用酶標儀測定在490nm處的吸光度。每組6孔，重復3次。

酪氨酸酶抑制率＝1-[(藥物組平均吸光值-空白組平均吸光值)/(陰性對照組平均吸光值-空白組平均吸光值)]×100％

表1提取物對b16細胞內酪氨酸酶活性的抑制率(n＝3，％)

注：*：與陰性對照組相比，p<0.05。

結果如表1所示：與陰性對照組相比，提取物山茶皂苷a及陽性對照物熊果苷在15ug/ml時可顯著抑制b16細胞的酪氨酸酶活性，差異有統計學意義(p<0.05)；且山茶皂苷a的抑制率6.97％±3.15高于陽性對照熊果苷組4.96％±1.57。

本發明具有強的酪氨酸酶活性抑制作用。

實施例三：活性成分山茶皂苷a能降低酪氨酸酶相關蛋白(trp-1)的表達取對數生長期的小鼠黑素瘤b16細胞，接種于培養瓶中，密度為5000個/cm²，過夜培養后棄去培養液，分別加入15ug/ml山茶皂苷a、15ug/ml熊果苷或細胞培養基培養72h。消化離心，pbs液洗滌3次，加入60ul/瓶細胞裂解液(含1％pmsf、1％磷酸酶抑制劑)，震蕩30min，使細胞充分裂解。勻漿離心，根據bca法測定蛋白質濃度。根據測定的蛋白濃度，計算蛋白上樣量上樣，進行sds-聚丙烯酰氨凝膠電泳，120v，電泳90min后將蛋白質轉移到pvdf膜上，2.5a，13min。取膜，封閉液室溫封閉2h，分別加入(1:200)多克隆兔抗鼠酪氨酸酶相關蛋白1(trp-1)抗體和(1:2000)內參gapdh，4℃過夜。洗膜后，加入(1:5000)辣根過氧化物酶標記的羊抗兔igg，室溫輕搖1h。充分洗膜后，做化學發光(ecl)，顯影，采用凝膠成像分析軟件分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，進行分析。計算所測目標蛋白/gapdh比值，得到目標蛋白的相對含量。

結果如圖1所示，與對照組(100％)相比，15ug/ml的山茶皂苷a處理組的酪氨酸相關蛋白1相對表達量降低至16.2％，顯著低于同等濃度熊果苷處理組(52.3％)的表達，表明山茶皂苷a能夠顯著降低trp-1蛋白的表達。

本發明具有強的酪氨酸酶相關蛋白表達抑制作用。

實施例四：活性成分山茶皂苷a對黑素合成的抑制能力

取對數生長期的小鼠黑素瘤b16細胞接種于24孔板，過夜培養，棄去培養液，分別加入1ml/孔的含15ug/ml的山茶皂苷a藥液，陽性對照組為相同濃度的熊果苷溶液，陰性對照組為含溶劑dmso的培養液，空白對照組為無細胞含相應溶劑dmso的培養液，分別在37℃、5％co2細胞培養箱中培養72小時后，棄上清，pbs洗滌2次，加入含1mnaoh溶液120ul/孔，80℃，水浴2h。將溶解液體吹勻轉移至96孔板中(100ul/孔)，用酶標儀測定在405nm處的吸光度。每組3孔，重復3次。

黑素合成抑制率＝1-[(藥物組平均吸光值-空白組平均吸光值)/(陰性對照組平均吸光值-空白組平均吸光值)]×100％

表2提取物對b16細胞黑素合成的抑制率(n＝3，)

注：*：與陰性對照組相比，p<0.05；#：與陽性對照組相比，p<0.05。

結果發現：與陰性對照組相比，提取物山茶皂苷a及陽性對照物熊果苷可顯著抑制b16細胞的黑素合成，差異有統計學意義(p<0.05)；并且，山茶皂苷a的抑制率顯著高于陽性對照熊果苷組，差異有統計學意義(p<0.05)，見表2。

本發明具有強的黑素合成抑制能力。

實施例五：活性化合物茶皂苷a對uvb照射細胞的抗氧化能力

實驗設置為空白對照組、uvb模型組、uvb+山茶皂苷a組。uvb+山茶皂苷a組角質形成細胞hacat于紫外線照射前12h加入15ug/ml山茶皂苷a，空白對照組和uvb模型組只加入相同量的dmem培養基。各組于紫外線照射前吸取培養基，再加入pbs覆蓋。以uvb(波長280-320nm)照射，照射劑量為60mj/cm²?？瞻讓φ战M用錫箔紙遮住，輻照結束后棄去pbs液，再分別加入dmem培養基，繼續培養。

對數生長期的hacat細胞，以細胞濃度為2×10⁵個/ml，接種于6孔培養板，每孔2ml，分組與處理如上所述。uvb照射24h后收集各組細胞，用4℃pbs洗2遍，反復凍融破碎細胞，將各管細胞懸液置于液氮中4s后，37℃水浴5min，按此操作反復凍融細胞4次，以充分破壞細胞并使其釋放出細胞成分，4000r/min離心10min，收集上清液嚴格參照試劑盒說明分別測細胞內sod和mda水平。并用bca法測定各組細胞內的蛋白濃度。

圖2結果顯示：與空白對照組相比，uvb照射的模型組中sod活力顯著降低(p<0.01),mda活力顯著升高(p<0.01)，表明uvb輻射對hacat造成明顯損傷，uvb組造模成功。

圖3結果顯示：與uvb模型組相比，加入山茶皂苷a的紫外照射組細胞中sod活力明顯提高(p<0.05)，差異具有統計學意義；而反應細胞受損程度的mda含量在加入山茶皂苷后卻降低(p<0.01)。

本發明具有抗氧化能力，能夠減輕細胞受損程度。