本發明涉及醫藥領域，具體的說涉及一種雙網絡水凝膠疫苗及其制備方法和應用。

背景技術：

1、骨感染，尤其是骨髓炎，目前仍是一項重大的臨床挑戰。骨髓炎是一種主要由革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌(s.aureus)感染引起的嚴重慢性骨炎癥性疾病，其特征為持續感染、骨質破壞以及膿腫形成。傳統治療方法包括使用全身性抗生素，但其療效受到多種因素的限制，如藥物難以滲透到感染部位、細菌形成生物膜以及抗生素耐藥性問題日益嚴重。更為棘手的是，骨髓炎患者的骨組織愈合問題和復發性感染仍是臨床治療的重大障礙，尤其是當感染涉及耐多藥細菌時。

2、水凝膠和微球等局部給藥系統的最新進展已顯示出前景，但大多數研究都集中在外用材料抗菌方面，對增強機體免疫反應和促進骨修復的疫苗策略關注有限。疫苗接種被認為是預防細菌性疾病的最有效手段之一。通過激活免疫系統并誘導特異性抗體的產生，疫苗能夠從根本上預防感染。然而，現有疫苗在實際應用中存在若干局限性，例如給藥途徑、免疫原性及靶向性的不足，這些因素使得傳統疫苗無法提供足夠的保護。此外，當前在骨髓炎治療中的疫苗研究仍處于初期階段，尚未得到充分的開發和應用。

3、因此，迫切需要能同時解決感染和骨修復問題的新型治療策略。

4、技術內容

5、本發明首先提供了一種雙網絡水凝膠的制備方法，包括如下步驟：

6、(1)gavan復合物的制備

7、將甘草酸(ga)溶解在水中，配成1mg/ml的ga水溶液；加入萬古霉素(van)；其中萬古霉素與甘草酸的摩爾比例為3-5：1；

8、將nhs和edc溶解于pbs緩沖液中，并加入至ga和van的溶液中，攪拌反應4小時，反應溫度保持在25℃，ph值調節至7.4；反應結束后，加入乙二醇終止反應；其中nhs和edc的量分別為ga摩爾量的1.2倍；

9、將反應液轉移至透析袋中，用pbs緩沖液透析24小時，去除未反應的nhs、edc和其他小分子雜質；透析完成后，將產物凍干得到ga-van復合物。

10、(2)gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠的合成

11、將去離子水預熱至60℃，稱取gavan和cucl2(二者重量比例為30-50：1)，溶解在其中(料液比為31-51mg/ml)，并繼續在60℃下孵育以促進組分的快速溶解，形成前體a溶液；

12、將高碘酸鈉氧化透明質酸hacho溶解在含20％?bsa的水溶液中(形成10-30％重量比的溶液)，并在60℃下徹底混合，制備形成前體b溶液；

13、將前體a溶液和前體b溶液按1-3:3-1的體積比混合，制備得到gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠。

14、其中所用的透析袋為再生纖維塑膜透析袋：壓平寬度(md):34mm，截留分子量:(3500)。

15、本發明還提供了上述方法制備得到的gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠。

16、本發明所制備的gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠能夠捕獲細菌、吸附炎癥因子和血清蛋白，其特性歸因于水凝膠網狀結構與氫鍵作用導致的物理捕獲效應，以及席夫堿反應和配位作用介導的化學吸附作用。

17、本發明還提供了一種gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠疫苗，其是由上述gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠交聯mrsa/s.aureus形成；

18、具體的說，所述的gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠疫苗是由下述方法制備得到的：

19、將去離子水預熱至60℃，稱取gavan和cucl2(二者重量比例為30-50：1)，溶解在其中(料液比為31-51mg/ml)，并繼續在60℃下孵育以促進組分的快速溶解，形成前體a溶液；

20、將高碘酸鈉氧化透明質酸hacho溶解在含20％?bsa和2×10^6cfu/ml?mrsa/s.aureus的水溶液中(形成10-30％重量比的溶液)，并在60℃下徹底混合，制備形成前體b溶液；

21、將前體a溶液和前體b溶液按1-3:3-1的體積比混合，制備得到gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠疫苗。

22、本發明還提供了一種用于預防或治療骨髓炎的藥物，其包含gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠及藥學上可接受的載體。

23、本發明還提供了上述gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠的應用，其可用于制備預防或治療骨髓炎或骨損傷的藥物。

24、本發明的創新點和有益的技術效果：

25、本發明所提供的gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠以及gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠疫苗，以甘草酸(ga)為起始原料，ga作為一種從甘草中萃取的天然草藥小分子，具有獨特的結構，包括疏水性的三萜類苷元和親水性的二葡萄糖醛酸單元。研究表明，在cu離子的存在下，ga水凝膠的自組裝過程顯著加速。特別地，銅離子在骨組織修復過程中發揮了重要作用，它通過調節骨髓間充質干細胞(bmsc)的成骨分化以及促進血管生成，進一步促進骨的修復。除此之外，ga還能夠調控wnt/β-連環蛋白信號通路，這一途徑對于促進人源骨髓間充質干細胞(hbmsc)的成骨分化至關重要，從而有效修復骨缺損。

26、因此，本發明提供的gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠，通過結合具有互補特性的兩種不同網絡，不僅增強了水凝膠的機械性能，還具有優異的緩釋特性，因此成為了理想的藥物輸送系統和疫苗載體。

27、本發明所提供的gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠，結合了多種物理-化學交聯網絡，一級網絡由嫁接了萬古霉素(van)的甘草酸與銅離子絡合形成(gacuvan)，而二級網絡則通過改性氧化透明質酸(hacho)的醛基與牛血清白蛋白(bsa)的多個氨基通過希夫堿反應交聯而成(hacho-bsa)，ha基網絡的引入賦予水凝膠疫苗的巨噬細胞靶向能力。

28、此外，本發明提供的gacuvan&hacho-bsa水凝膠的雙網絡結構增強水凝膠的機械性能和穩定性，而且能夠在原位捕獲并吸附多種病原體相關分子，包括細菌成分、細菌抗原、炎癥細胞因子和血清蛋白。這一過程得益于氫鍵、配位相互作用和希夫堿鍵交聯的獨特組合。更進一步，水凝膠疫苗將攜帶的免疫原成分靶向到巨噬細胞，還能夠持續釋放病原相關分子，這一機制增強了免疫系統的活化，還有效促進了細菌的清除。更重要的是，水凝膠疫苗還能夠激活免疫記憶，有效預防骨髓炎的復發。同時，水凝膠疫苗釋放的ga和cu2+具有刺激骨再生的作用，尤其適用于治療骨髓炎中伴隨的骨缺損問題。

29、綜上所述，gacuvan&hacho-bsa雙網絡水凝膠疫苗不僅具有抗菌作用，還兼具免疫調節功能，為骨髓炎的感染控制、骨再生和復發預防提供了一個有前景的和綜合性的治療方案，是骨髓炎骨缺損微創治療的理想選擇。同時，該疫苗釋放ga可促進骨髓炎時骨組織修復并增強免疫調節，而ga的促進骨修復的作用在cu2+的作用下加強。多重功能的水凝膠疫苗提供長期免疫力抵抗細菌，又能促進骨組織再生，從而解決了骨髓炎治療中的幾個關鍵難題。為推動骨髓炎臨床治療和預防提供一種大有前途的前瞻性水凝膠疫苗研究策略。

技術實現思路