本發(fā)明屬于疫苗制備領(lǐng)域，具體涉及一種基于幽門(mén)螺桿菌外膜囊泡的納米疫苗及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、幽門(mén)螺桿菌是一種單極多鞭毛、呈螺旋狀彎曲、革蘭氏陰性的微需氧細(xì)菌，能在胃黏液層中運(yùn)動(dòng)，能分泌尿素酶分解尿素產(chǎn)生氨，適應(yīng)胃酸性環(huán)境。大多數(shù)幽門(mén)螺桿菌感染通常是無(wú)癥狀的，但這種情況會(huì)作為慢性感染持續(xù)存在，并增加消化性潰瘍、慢性胃炎和胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。目前，抗生素治療是治療幽門(mén)螺桿菌感染最常用的方案，臨床上，一般采用三聯(lián)或四聯(lián)療法。但隨著抗生素治療的普及，抗生素耐藥性已成為另一個(gè)臨床突出問(wèn)題。研制安全高效的疫苗已成為預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的一個(gè)重要措施。

2、外膜囊泡（omv）是革蘭氏陰性細(xì)菌分泌的一種直徑介于20～250nm的球形納米結(jié)構(gòu)，包含蛋白質(zhì)、dna、rna、脂多糖（lps）、酶和肽聚糖等細(xì)菌成分。omv能夠有效引起機(jī)體對(duì)細(xì)菌感染的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，使得其成為潛在的新型疫苗候選者。omv不能自我復(fù)制，解決了傳統(tǒng)滅活全細(xì)菌疫苗應(yīng)用中的主要安全問(wèn)題，其納米尺寸有利于抗原呈遞細(xì)胞攝取。

3、現(xiàn)已有越來(lái)越多的研究集中在使用納米材料來(lái)治療耐藥細(xì)菌感染。與純抗原疫苗相比，納米材料疫苗的優(yōu)勢(shì)主要包括：（1）納米載體可以避免抗原的快速降解，提高疫苗制備的穩(wěn)定性；（2）提供良好的佐劑性能，促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞活化；（3）納米尺度增強(qiáng)了抗原在淋巴結(jié)的蓄積，進(jìn)一步增強(qiáng)了其免疫應(yīng)答能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點(diǎn)，本發(fā)明的首要目的在于提供一種基于幽門(mén)螺桿菌外膜囊泡的納米疫苗的制備方法，該方法以幽門(mén)螺桿菌外膜囊泡（omv）作為抗原，以脂多糖（lps）作為佐劑，以樹(shù)枝狀介孔有機(jī)二氧化硅（dmon）為載體，利用靜電相互作用使dmon吸附lps小分子；最后利用脂質(zhì)體擠出器將omv均勻包裹在dmon納米材料表面，得到基于幽門(mén)螺桿菌外膜囊泡的納米疫苗。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的基于幽門(mén)螺桿菌外膜囊泡的納米疫苗，該納米疫苗夠被巨噬細(xì)胞攝取，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，顯著提高巨噬細(xì)胞分泌各種免疫細(xì)胞因子的水平，能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)高水平的抗原特異性體液免疫、黏膜免疫以及th1/th2/th17型細(xì)胞免疫應(yīng)答。

3、本發(fā)明的再一目的在于提供上述基于幽門(mén)螺桿菌外膜囊泡的納米疫苗的應(yīng)用。

4、本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

5、一種基于幽門(mén)螺桿菌外膜囊泡的納米疫苗的制備方法，包括以下步驟：

6、（1）分離純化omv

7、取幽門(mén)螺桿菌細(xì)菌懸液，8000-10000rpm低速離心，分別獲得上清液和沉淀；上清液過(guò)濾，取濾液；濾液100000-300000g超速離心，棄上清液，沉淀重懸，得到omv溶液；

8、（2）提取lps

9、取步驟（1）中低速離心獲得的沉淀，參照常規(guī)方法提取lps，得到lps溶液；

10、（3）合成dmon

11、采用陽(yáng)離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（ctab）和水楊酸鈉（nasal）作為模板劑，正硅酸乙酯（teos）和1,2-二(三乙氧基硅基)乙烷（btee）作為二氧化硅源，三乙醇胺（tea）作為催化劑，通過(guò)一鍋法制備得到dmon；

12、（4）制備dmon-nh2

13、將步驟（3）制得的dmon和乙醇混合，得到dmon乙醇溶液；將dmon乙醇溶液與3-氨丙基三乙氧基硅烷（aptes）混合，進(jìn)行氨基化反應(yīng)，反應(yīng)完成后對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化、干燥，得到dmon-nh2；

14、（5）制備lps@dmon@omv

15、將步驟（4）制得的dmon-nh2和水混合，得到dmon-nh2溶液；將步驟（2）制得的lps溶液和dmon-nh2溶液混合，攪拌反應(yīng)；反應(yīng)完成后，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化并用緩沖溶液重懸，得到lps@dmon溶液；將lps@dmon溶液和步驟（1）制得的omv溶液混勻后采用脂質(zhì)體擠出器擠壓10-20次，最后離心去除未負(fù)載的omv，得到基于幽門(mén)螺桿菌外膜囊泡的納米疫苗；

16、步驟（1）中所述的幽門(mén)螺桿菌細(xì)菌懸液，優(yōu)選通過(guò)如下方法制備得到：

17、將凍存的幽門(mén)螺桿菌ss1菌株置于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃、微氧環(huán)境中培養(yǎng)48-72h，然后收取菌落加入液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h；

18、所述的微氧環(huán)境的具體條件優(yōu)選為5%o2、10%co2、85%n2；

19、步驟（1）中所述的幽門(mén)螺桿菌細(xì)菌懸液的od600nm優(yōu)選為1-2；

20、步驟（1）中所述的低速離心的條件優(yōu)選為：4℃、8000-10000rpm低速離心2-3次，每次10-20min，每次離心后取上清液，上清液再次離心；最后一次離心獲得的上清液用于后續(xù)過(guò)濾，每次離心后的沉淀合并后用于后續(xù)提取lps；

21、步驟（1）中所述的過(guò)濾優(yōu)選采用0.22μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾2-3次；

22、步驟（1）中所述的超速離心的條件優(yōu)選為4℃、100000-300000g超速離心1.5-2.5h；

23、步驟（1）中所述的重懸優(yōu)選采用pbs緩沖溶液重懸；

24、步驟（3）中所述的dmon的制備方法，具體包含如下步驟：

25、①在攪拌條件下，將tea加入到水中，70-90℃油浴攪拌0.3-0.7h；向上述溶液中加入ctab和nasal，70-90℃油浴繼續(xù)攪拌0.8-1.2h，使ctab和nasal充分溶解并形成穩(wěn)定的模板結(jié)構(gòu)；

26、②將teos和btee混合后加入到步驟（1）中的體系中，70-90℃油浴中繼續(xù)攪拌0.5-1.5h；反應(yīng)完成后反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化、干燥，得到dmon；

27、步驟①中所述的tea、ctab和nasal的質(zhì)量比優(yōu)選為（60-80）：（350-400）：（150-180）；

28、步驟②中所述的teos和btee的體積比優(yōu)選為（1.5-2.5）：（1.4-1.8）；

29、步驟①中所述的tea和步驟②中所述的teos的質(zhì)量體積比mg：ml優(yōu)選為（60-80）：（1.5-2.5）；

30、步驟②中所述的純化的具體操作優(yōu)選為：

31、將步驟②制得的反應(yīng)產(chǎn)物采用鹽酸和甲醇的混合溶液進(jìn)行回流提取；所述的鹽酸和甲醇的體積比為（1:8）-（1:10）；所述的回流提取的條件優(yōu)選為：溫度55-65℃，重復(fù)提取2-4次，每次提取時(shí)間5-7h，以確保模板劑（結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑）等完全去除；

32、步驟②中所述的干燥的條件優(yōu)選為真空干燥12-24h；

33、步驟（4）中所述的dmon乙醇溶液中的dmon與aptes質(zhì)量體積比mg：μl為10:1，所述的dmon乙醇溶液的濃度優(yōu)選為5-20mg/ml；

34、步驟（4）中所述的氨基化反應(yīng)的條件優(yōu)選為300-600rpm攪拌12-24h，以確保反應(yīng)充分進(jìn)行；

35、步驟（4）中所述的純化、干燥的具體操作優(yōu)選為：

36、反應(yīng)完成后，固液分離，用乙醇或水洗滌，以去除未反應(yīng)的aptes，洗滌后的產(chǎn)物真空干燥12-24h，得到dmon-nh2；

37、步驟（5）中所述的lps溶液中的lps、omv溶液中的omv、dmon-nh2溶液中的dmon-nh2的質(zhì)量比為優(yōu)選為0.75:（20-40）:200；

38、步驟（5）中所述的lps溶液與dmon-nh2溶液的體積比優(yōu)選為（1:4）-（1:5）；

39、步驟（5）中所述的lps溶液中的lps與dmon-nh2溶液中的dmon-nh2的質(zhì)量比優(yōu)選為0.075:20；

40、步驟（5）中所述的lps溶液的濃度優(yōu)選為150?μg/ml；

41、步驟（5）中所述的lps@dmon溶液與omv溶液的體積比優(yōu)選為1:1；

42、步驟（5）中所述的lps@dmon溶液中dmon-nh2與omv溶液中的omv的質(zhì)量比優(yōu)選為5:0.5；

43、步驟（5）中所述的omv溶液的濃度優(yōu)選為1mg/ml；

44、步驟（5）中所述的反應(yīng)的條件優(yōu)選為300-600rpm攪拌12-24h；

45、步驟（5）中所述的純化的條件優(yōu)選為：

46、反應(yīng)完成后，固液分離，用水洗滌，以去除未反應(yīng)的lps，洗滌后的產(chǎn)物用pbs緩沖溶液重懸；

47、步驟（5）中所述的lps@dmon溶液與omv溶液混合、擠壓時(shí)優(yōu)選在4℃下進(jìn)行；

48、步驟（5）中所述的離心的條件優(yōu)選為4℃、7000-10000rpm離心10-20min；

49、一種基于幽門(mén)螺桿菌外膜囊泡的納米疫苗，通過(guò)上述制備方法制備得到；

50、所述的基于幽門(mén)螺桿菌外膜囊泡的納米疫苗在制備防治消化性潰瘍、慢性胃炎和胃癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

51、本發(fā)明的技術(shù)原理：

52、本發(fā)明提供了一種基于幽門(mén)螺桿菌外膜囊泡的納米疫苗，該疫苗以幽門(mén)螺桿菌omv作為抗原，以lps作為佐劑，以dmon為載體；其中，lps作為佐劑可提高omv的免疫原性，增強(qiáng)免疫效果；dmon具有多級(jí)納米孔和樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)，使得其具有更大的比表面積展示抗原和吸附佐劑小分子。

53、由于lps和dmon帶負(fù)電，本發(fā)明先采用aptes（3-氨丙基三乙氧基硅烷）對(duì)dmon進(jìn)行氨基化修飾，使其帶正電；然后dmon-nh2通過(guò)靜電相互作用負(fù)載屬于小分子結(jié)構(gòu)的lps，使其吸附到dmon的孔隙和表面，形成lps@dmon；然后再進(jìn)一步將抗原omv和lps@dmon混合擠出，抗原omv會(huì)包裹lps@dmon，形成穩(wěn)定的圓形納米顆粒疫苗；如果先將omv和dmon混合，omv會(huì)包裹dmon，在其表面形成一層膜，那么lps就無(wú)法負(fù)載到整個(gè)納米顆粒上，而是分散在溶液中，后續(xù)離心，最終獲得的產(chǎn)物中并不包含lps；此外，本發(fā)明選擇omv包裹lps@dmon，也是因?yàn)閛mv具有一定的天然生物相容性和靶向性，容易被抗原提呈細(xì)胞主動(dòng)攝取，故將其他組分包裹進(jìn)omv中。

54、此外，lps、omv與dmon的用量關(guān)系十分重要，本發(fā)明提供的配比可以得到相對(duì)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)和lps負(fù)載比。lps用量過(guò)多會(huì)增加毒性，過(guò)少效果不夠；omv用量過(guò)多浪費(fèi)，過(guò)少蛋白濃度低；dmon用量過(guò)多不好過(guò)擠出機(jī)。適當(dāng)?shù)挠昧勘饶芴岣甙踩?，避免浪費(fèi)原料。

55、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

56、（1）多組分協(xié)同增效，突破單一抗原免疫原性不足的局限。本發(fā)明以幽門(mén)螺桿菌天然omv為核心抗原，保留了病原體的多抗原表位（如外膜蛋白、脂蛋白等），相比傳統(tǒng)單一重組蛋白抗原，可誘導(dǎo)更全面的體液免疫和細(xì)胞免疫。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本疫苗免疫后血清特異性igg抗體滴度能達(dá)到1:12800，且顯著激活th1/th2/th17混合型免疫應(yīng)答。

57、（2）本發(fā)明利用幽門(mén)螺桿菌同源脂多糖（lps）作為天然佐劑，避免了外源性佐劑（如鋁鹽、cpg等）的毒性風(fēng)險(xiǎn)。

58、（3）本發(fā)明制備工藝簡(jiǎn)單，適于規(guī)?；a(chǎn)，避免了傳統(tǒng)疫苗復(fù)雜的化學(xué)交聯(lián)或基因工程修飾步驟。