專利名稱：保健組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種組合物，它具有出色的藥理和保健的效果，更具體地說，涉及由冬蟲夏草得到的藥物型的和/或飲食品型的組合物。
現有技術冬蟲夏草是子囊菌類(Ascomycota)、核菌綱(Pyrenomycetes)、麥角菌目(Clavicipitales)、麥角菌科(Clavicipitaceae或Hypocreacea)、冬蟲夏草屬(Cordyceps)的微生物，它們經過完全變態過程和不完全變態過程。
冬蟲夏草的子實體在古代就被評價為對永葆青春和延年益壽有奇特功效或營養、滋補類的藥品。迄今為止被認為特別有效的中藥的植物性黃蜂的子實體被廣泛地制成粉末并使用。
根據本發明，培養特殊的冬蟲夏草的菌絲體并將培養好的菌絲體用熱水提取。眾所周知，從該菌絲體提取的這樣的提取物具有強心和抗疲勞的功效。
本發明要解決的問題本發明的目的是為了開發新的具有強心、降低血壓、鎮咳和抗疲勞功效的藥物或具有相同功效的食品和飲料，出于安全性考慮，本發明也是為了開發可以長期施用的天然物質。
解決這些問題的方法為了達到上述目標而進行了各種調查之后，我們，本發明的發明者已經特別地注意到中藥和植物性黃蜂，尤其是那些冬蟲夏草，在對它們進行了進一步的研究之后，結果發現通過培養得到的菌絲體，尤其是用熱水提取培養的菌絲體得到的產物具有適度的強心和抗疲勞的功效。在此發現的基礎上，我們進行了進一步的研究，最終獲得了本發明。本發明在下文被詳細描述。
附圖的描述

圖1表明了冬蟲夏草MF-20008菌絲體的熱水提取物對鼠右心房肌肉收縮力的影響。
圖2表明了冬蟲夏草MF-20008菌絲體的熱水提取物對鼠右心房肌肉收縮間隔時間的影響。
圖3表明了在施用冬蟲夏草MF-20008菌絲體的熱水提取物之后，鼠胃腺中形成的潰瘍的潰瘍指數(cm)。
圖4-1表明了鼠肝細胞初期培養物中3H-胸苷的攝取情況；圖4-2表明了上述條件下3C-纈氨酸的攝取情況。
圖5表明了冬蟲夏草MF-20008菌絲體的熱水提取物對鼠胃酸分泌的抑制效果。
為了實施本發明，有必要培養冬蟲夏草的菌絲體，并收集培養的菌絲體。冬蟲夏草的所有微生物都可被用于本發明，并被指稱為本發明的微生物。例如，冬蟲夏草MF-20008是有用的，該菌株以FERM BP-5149保藏于工業技術院生命工學工業技術研究所。
根據本發明，冬蟲夏草的菌絲體是培養的。
它們被培養于包含麥芽提取物、酵母提取物、蛋白胨、馬鈴薯肉湯、葡萄糖、維生素、氨基酸、核酸、蛋白質和可選的宿主成分(例如昆蟲等)的介質，經過液體或固體培養，菌絲體可在其中充分地繁殖。
液體培養，尤其是通氣的攪拌培養是培養大量菌絲體的優選方法，培養在pH值4至7和15至32℃的條件下進行，同時以大約50至500rpm，優選的是100至300rpm的速度輕輕攪拌介質，培養3至10天。
培養之后，培養的菌絲體用熱水提取。將水加于菌絲體，然后，可選地在被研磨之后，加熱至60至100℃，優選的是從85至100℃，更優選的是從90至95℃，之后用熱水提取，可選地攪拌。加入的水的量并未被嚴格限定，但優選的是每克干菌絲體1毫升至1升。
從獲得的熱水提取物中除去殘留物質，所得的液體提取物被直接或在進一步加工之后用作本發明的活性成分。通過加工液體提取物獲得的產物廣泛地包含該液體提取物的濃縮產物、糊狀產物、干制產物和/或稀釋產物。根據具體情況，熱水提取物或其加工后的產物可以不用從中除去殘留物質而被直接使用，例如作為食品或飲料。
菌絲體的熱水提取物(包括其加工后的產物)具有適度的強心、降低血壓、鎮咳和抗疲勞的功效，并且包含該物質的本發明的組合物可以被用作具有相同功效的食品和飲料、為特殊保健目的的食品和飲料、保健飲料、保健食品、營養食品，以及其它各種類型的食品和飲料，也可以用作藥品，例如強心劑、降壓劑、鎮咳劑、滋補藥等。
對于食品-飲料型組合物，熱水提取物活性成分(或其加工后的產品)可以直接使用或與其它食品或食品組分通過普通方法混合。包含活性成分的本發明的組合物可以以固體(粉末、顆粒等)、糊劑、液體和懸液中的任何一種形式存在，并且它適合于與甜味劑、酸味劑、維生素和其它各種用于普通飲料的添加劑共同配制成保健飲料。
對于藥物型組合物，活性成分可以以不同形式施用。所述的形式是各種口服組合物，包括如片劑、膠囊、顆粒劑、粉劑、糖漿等。這些不同的制劑可以用本技術領域配制藥物通常所使用的已知的輔助添加劑，例如賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、調味劑、助溶劑、懸浮劑、包衣劑等，用普通的方法配制而成。用的活性成分的劑量隨病情、受施者的年齡和體重，以及施用途徑和制劑的形式等的不同而不同，但是一般每次施用從0.1mg/成人至1,000mg/成人。
本發明的活性成分是從天然原料得到的，它們已經被當作中藥使用了許多年了，并且完全無毒或僅有輕微毒性。因此，它們是安全的。將它們以500mg/天的劑量讓鼠口服，結果沒有任何劇烈的毒性。因此，對任何預防疾病、保健和日常食用等應用并不特別限定加入食品-飲料型組合物的活性成分的量。對藥品，加入的活性成分的量可以根據患者的情況在上述范圍內限定。由于本發明的活性成分即使大量服用時仍沒有顯示出毒性，因此，如果需要，施用劑量可以超出上述范圍而不會有任何問題。
本發明通過如下的制造例和實施例詳細描述。
制造例11升的M20Y2培養基(1升中包含20g錐形的麥芽提取物(Oxoid)和2g的酵母提取物(Difco)，pH值為5.5)被分別注入46個3升的錐形瓶，然后在高壓釜中121℃滅菌15分鐘。
一個冬蟲夏草MF-20008菌絲體(FERM BP-5149)的鉑環(從中國福建三明真菌研究所獲得)，用M20Y2瓊脂斜面培養基預培養，接入每個滅過菌的培養基中，并于25℃以180rpm搖動培養5天。于是，在這46個燒瓶里得到了46升的培養液。
將46升的培養液離心，分離出的菌絲體被冰凍干燥，得到323.6g的干菌絲體。將干菌絲體放入一個潔凈的容器中，加入7升水，然后用polytoron研磨，之后在攪拌的情況下90-95℃加熱2小時并抽提。抽提后，殘留物質通過過濾除去，所得的濾液冰凍干燥，獲得130g的淡黃色粉末。
制造例2用與制造例1中相同的方法，將150毫升的M20Y2培養基加入一個500毫升的錐形瓶中并用高壓釜滅菌，1毫升的凍干冬蟲夏草MF-2008接種到其中并在25℃以180rpm搖動培養的5天。它被用作種子培養基，并在150毫升的下述培養基里用下面的方法培養。
150毫升的D培養基(1升中包含4.0g的蔗糖，4.0g的磷酸氫二鉀，0.5g的天門冬酸酰胺，2.0g的磷酸氫二銨，2.0g的7水合硫酸鎂，0.25g的碳酸鈣，0.1g的氯化鈣和4.0g的酵母提取物B-2，pH值為5.6)在滅菌和過濾之后，加入一個150升的發酵罐，150毫升的上述種子培養基接種到其中，并控制在25℃、pH值5.5、DO50％的條件下，用157rpm的速度搖動培養3天。培養過程中產生的泡沫通過向發酵罐中加入硅膠消泡劑除去。所得到的150升的培養物用澄清器(clarifier)處理以分離菌絲體。于是，獲得菌絲體的水懸液。在攪拌的情況下90-95℃加熱2小時并抽提。然后，用澄清器分類以分離出上清夜。它通過0.45微米和0.22微米的無菌過濾器過濾，得到80升的淡黃色熱水提取物(固體成分的干重800克)。
實施例1在制造例1中制備的培養的冬蟲夏草MF-2008的菌絲體(干菌絲體)和其熱水提取物(淡黃色粉末)被用于對鼠進行游泳疲勞試驗，在該試驗中，它們是口服的。
試驗動物是雄性ICR鼠(5至7周齡)，它們被分成三組并在下述條件下進行疲勞試驗。用藥方法冬蟲夏草MF-2008菌絲體的熱水提取物或菌絲體本身與粉末狀CRF-1飼料以2.5％或5％的比例混合，所得的粉末飼料混合物給鼠連續服用16天。鼠的分組每組20只(1)對照組只用粉末狀CRF-1飼料喂養。
(2)服用熱水提取物組用包含2.5％熱水提取物的飼料混合物喂養。
(3)服用菌絲體的組用包含5％干菌絲體的飼料混合物喂養。試驗程序在開始服藥后第15天，對鼠進行強迫游泳試驗。第16天，從每只鼠身上收集所有的血液并進行全血分析和血清分析。
(1)游泳疲勞試驗如下一個36升的游泳池(49厘米×33.5厘米×22厘米(深))充滿17℃的水，并加入10毫升的中性清潔劑。鼠被強迫在池中游泳(無負重)，每只鼠的游泳試驗停止于它的鼻子沒入水中5秒鐘時。所得結果列于表1。
表1



上述結果用Aspin-Welch法分析其顯著性。在第一組和第二組之間存在著顯著性差異，試驗的顯著性水平為1％。但是，在第一組和第三組之間沒有顯著性差異，試驗的顯著性水平為5％。
游泳疲勞試驗是基于試驗動物總反應的變化，為評價試驗物質抗疲勞功效而通常采用的試驗之一。因此，上述結果正是科學地驗證了本發明的活性成分在提高運動力量持久能力方面的出色功效，及其出色的抗疲勞功效。
(2)在服藥后第16天，從每只經過上述游泳疲勞試驗的鼠身上收集全血，并分析其血小板的數量(×10,000/平方毫米)、血色素量(克/dl)、紅細胞的數量(×10,000/平方毫米)、白細胞的數量(/平方毫米)，以及血細胞比容(％)。
全血分析的結果列于表2。從這些結果可以明顯看出，對于所有的檢測項目來說，在試驗組和對照組之間沒有顯著性差異，試驗的顯著性水平為5％。(分析全血使用的是Student測試。但是，在第三組中血小板數量計數使用的是Aspin-Welch法。)表2




(3)在試驗過程中，測量每只鼠的體重，試驗鼠的平均體重(克)的差異性列于表3(接受強迫游泳試驗的鼠的重量的差異)。
表3

實施例2根據Tsunoo等人的方法(見Kurokawa M.和Tsunoo A.，《生理學雜志》，第407卷，135-153頁，1988年；Tsunoo A.等，《生理學雜志》，第433卷，163-181頁，1991年)檢測在制造例1中制備的冬蟲夏草MF-20008菌絲體熱水提取物對從SD鼠取出的右心房、右心室乳頭狀肌肉、主動脈和支氣管的影響，并評價提取物的功效。
(1)心肌樣本在對雄性的SD鼠的心肌樣本使用熱水提取物時，測量右心房心肌的收縮力及其收縮間隔時間。
右心房是在使用工作的起搏器的同時從雄性的SD鼠(380至450克)身上取得。心肌樣本被固定于一個體積為0.8毫升的水平灌注容器，其收縮力被等長記錄。灌注液使用的是已被95％的氧氣和5％二氧化碳平衡的克萊布溶液，或包含140mM氯化鈉、5mM氯化鉀、2.6mM氯化鈣、1.3mM氯化鎂、10mM葡萄糖和5mM的HEPES的充氣的鹽溶液。灌注液被保持在36至37℃，流速為3至4毫升/分鐘。
結果，與對照組相比，菌絲體的熱水提取物(從50至100微克/毫升)使右心房心肌的收縮力增加了9±3％(平均值±標準方差，n＝5)。與對照組相比，由起搏器產生的自動收縮間隔時間被延長了14±10％(n＝4)。圖1和圖2表明了右心房心肌收縮力的基于時間的增加，也表明了收縮間隔時間的基于時間的延長。
在圖1和圖2中，提取液(60微克/毫升)在粗實線表示的期間被用于檢測系統。縱軸表示相對于對照組(在使用提取液之前)標準值為1(一)時的收縮力的相對值。橫軸表示時間，0(零)的意思是提取液加入檢測系統的時刻，負數的意思是使用前的時刻。
從上面可以明顯地看出，熱水提取物對右心房心肌自發收縮的效果被圖中數據所證實。而且，右心室的乳頭狀肌肉被從鼠中取出，按上述方法固定于灌注容器中，通過一根鉑導線施加電刺激(2Hz)，測量提取物對右心室乳頭狀肌肉收縮的有效性，該收縮是由電刺激產生，并非自發收縮。結果，與對照組相比，提取物(從30至100微克/毫升)使電刺激產生的右心室乳頭狀肌肉的拉力增加了13±1％(n＝3)。
(2)主動脈樣本通過將熱水提取物應用于雄性SD鼠的主動脈樣本，測量提取物對主動脈的作用以及由50mM鉀離子對主動脈造成的持續收縮的抑制作用。
主動脈從雄性SD鼠取出，制成螺旋狀切片樣本。樣本在與上述相同的條件下，固定于灌注容器。用來刺激樣本的50mM鉀離子溶液是在容器中以氯化鉀替代氯化鈉制備而成。
結果，菌絲體的熱水提取物(從50至100微克/毫升)在統計意義上對主動脈沒有顯著效果。但是，它緩解了50mM鉀離子造成的主動脈的持續收縮。若50mM鉀離子造成的主動脈的收縮拉力被定為100％，提取物使拉力降低了2至12％(n＝5)。
(3)支氣管樣本通過將熱水提取物應用于雄性SD鼠的支氣管樣本，測量提取物對由電刺激或50mM鉀離子對支氣管造成的收縮的抑制作用。
支氣管從雄性SD鼠取出，制成螺旋狀切片樣本。樣本在與上述相同的條件下，固定于灌注容器。用來刺激樣本的50mM鉀離子溶液按上述方法制備。電刺激通過灌注容器中一根鉑導線以30秒的間隔施加于樣本。
結果，與對照組相比，菌絲體的熱水提取物(從50至100微克/毫升)使電刺激造成的支氣管短暫收縮被抑制了23至65％(n＝3)。它也緩解了由50mM鉀離子造成的支氣管持續收縮。若50mM鉀離子造成的支氣管的收縮拉力被定為100％，提取物使拉力降低了9至13％(n＝3)。它與茶堿(50μM)有相似或更高的緩解效果。
從上述(1)至(3)的結果中可以看出的，菌絲體的熱水提取物具有①在延長心肌收縮間隔時間的同時，對增強心肌的持續收縮力有適度的效果，②在增加系統血液流量的同時，提取物具有舒張血管的作用，以及③由于提取物抑制支氣管的短暫和持續收縮，因此它降低了呼吸的阻力并加強了肺通氣量。因此，從這些科學數據我們可以確認，本發明的組合物具有強心的功效、降低血壓的功效以及鎮咳的功效。
實施例3使用在制造例1中制備的冬蟲夏草菌絲體的熱水提取物(冰凍干燥粉)，進行鼠的浸水的、限定壓力的潰瘍試驗來檢測提取物的抗壓力功效。
試驗動物從日本查爾斯河公司購買的五周齡的雄性的絲普瑞格-道利鼠，預飼養約一周。這樣飼養后的六周齡鼠被用作試驗動物。
施用冬蟲夏草的熱水提取物溶于蒸餾水，配成濃度為50毫克/毫升的注射液，然后被分為若干部分，每部分為一天的劑量。它們被冷凍并貯存于-20℃。使用前，它們在室溫融解。對照組的鼠只注射蒸餾水。提取物溶液或蒸餾水是通過一只鼠的金屬胃探針從口腔施用的。活性成分的劑量、溶液(或蒸餾水)的劑量以及施用時間表列于表4。溶液(或蒸餾水)的劑量的計算是基于每只鼠的最新的體重，通常，施用在上午9至12點時間進行。
表4

(1)對照組的每只鼠的施用是注射4毫升/公斤/日劑量的蒸餾水。
(2)施用開始的那天定為0。
浸水的、限定壓力的潰瘍試驗(在第10-11天過夜加壓)在浸水、限定壓力施加前12小時，停止喂鼠。之后，將鼠放入一個壓力計并進入水中至劍突處。浸水時間限定為15小時。在施加壓力后，鼠被麻醉并被處死，結扎胃上部的賁門和十二指腸，并取出胃。將生理鹽水注入胃中，然后將胃浸入福爾馬林溶液。15分鐘后，剖開胃，測量胃腺中形成的潰瘍的長度。測量后，胃用福爾馬林固定，進行病理解剖檢查，所形成的潰瘍按下述條件評析。
分數0無異常1粘膜上部2粘膜固有層3粘膜肌肉層4漿膜層結果示于圖3和表5。
表5

實施例4作為培養的冬蟲夏草菌絲體的熱水提取物抗疲勞功效的一個指標，我們測量了在鼠的肝細胞原代培養時，提取物促進DNA合成和蛋白質合成的活性。
從牛小腸上皮粘膜獲得的包含肝細胞生長因子的提取物的制備及提取物的特性一種牛小腸上皮粘模細胞的可溶于甲醇的提取物基本上包含如凝膠滲透色譜所測定的小分子物質，它被稱作低分子量部分(LMW)。另一方面，牛小腸上皮粘膜用甲醇提取后，其殘留物經過PBS進一步提取而獲得的提取物，基本上包含蛋白質類的大分子量物質，它被稱作高分子量部分(HMW)。
當LMW加入原代培養的鼠肝細胞后，在細胞中存在胰島素的情況下，它促進了DNA和蛋白質的合成。當加入LMW和HMW的混合物后，與HMW的基本活性相比，DNA和蛋白質的合成被進上步加速了。換句話說，LMW在該檢測系統中顯示了基本的活性，而HMW具有附加的活性。冬蟲夏草的熱水提取物包含基于上述提取方法的低分子量部分。在存在1％HMW和1×10-7M胰島素的情況下，將提取物加入原代培養的鼠的肝細胞中，在這些細胞中，提取物促進DNA和蛋白質合成的功效是通過細胞攝取3H-胸苷和14C-纈氨酸來檢測的。
結果在存在胰島素和HMW的情況下，將冬蟲夏草菌絲體的熱水提取物加入原代培養的鼠肝細胞中后，明顯地促進了DNA和蛋白質在這些細胞中的合成。結果示于圖4-1和圖4-2。但是，在胰島素和HMW不存在時，沒有檢測到提取物的任何顯著的活性。在只存在胰島素時，也沒有檢測到提取物的活性。從這些結果，我們相信提取物在存在胰島素和HMW的情況下，促進了DNA和蛋白質在細胞中的合成。
實施例5在制造例1中制備的冬蟲夏草MF-20008菌絲體的熱水提取物對鼠施用，并檢測提取物對延緩鼠胃酸分泌的功效。
在這個試驗中，使用的是健康的雄性SD鼠(日本查爾斯河公司)；購買5周齡的鼠并預飼養4天，然后用于本試驗。
這些鼠被分成兩組，試驗組和對照組，每組有4只鼠。試驗組的鼠服用的是冬蟲夏草菌絲體的熱水提取物。
冬蟲夏草菌絲體的熱水提取物溶于純水(批號YLE9566，和光純藥工業公司生產)，濃度為100毫克/毫升，以配制成讓鼠服用的試驗材料，并將它們冷凍、保存。
純水或預定濃度的試驗材料每天上午9點通過金屬胃探針從口給鼠服用。第12天，在幽門被結扎后，將其注射進十二指腸。組別動物數施用用 劑量 施用途徑 施用時間(只) 物質 (mg/kg/day) 表對照組4 純水 -口服 第1至11天冬蟲夏草 4 試驗材200 口服 第1至11料天胃液的分泌用下述方法檢測。
鼠被停止喂食17小時。之后，當它們被麻醉時，剖開腹腔并結扎幽門。4小時后，用頸椎脫位處死鼠，取出它們的胃，收集殘留其中的胃液。這樣收集的胃液用3,000rpm的速度離心5分鐘。檢測胃液的體積(毫升/鼠)、胃液的酸度(mEq/升)及其pH值。最高至pH7.0的酸度用一個使用0.01N的氫氧化鈉的pH計測量。從這樣測量出的胃液的體積和其酸度計算每小時釋放的酸量(μEq/小時)。結扎幽門后立即向十二指腸注射試驗材料。
結果示于圖5。
實施例6將水加入100克從制造例1中獲得的熱水提取物粉末、150克糖、15克蜂蜜、1克抗壞血酸、0.5克檸檬酸和適量的香味劑配制成總共1公斤的溶液。將其在95℃滅菌20分鐘，然后在無菌條件下分裝到小瓶中，每瓶100毫升。這樣，飲食品型的保健飲料就制備好了。
實施例7將去離子水加入200克從制造例1中獲得的熱水提取物粉末的20％液體溶液、5克生育酚乙酯、10克硝酸硫胺、20克尼克酰胺、50克無水咖啡因以及適量的安息香酸和香味劑配制成總共30升的溶液。
滅菌后，在無菌條件下分裝到小瓶中，每瓶30毫升。于是，藥品型的保健飲料就制備好了。
實施例8(1)制造例1中制備的物質 50克(2)乳酸90克(3)玉米淀粉29克(4)硬脂酸鎂1克(1)、(2)和(3)(17克)與(3)(7克)配制成的膏體混合并?；?。(3)(5克)和(4)加入這樣獲得的顆粒并充分混合，用壓片機將所得的混合物在壓力下壓成片，得到1000片，每片包含活性成分(1)50毫克。
本發明的優點本發明提供了一種從天然物質得到的組合物，它極其穩定，并具有適度的強心、降低血壓、鎮咳和抗疲勞的功效。雖然它是從天然物質獲得的，但是仍然有可能通過培養法穩定地、工業化地提供該組合物。
在條例13-2下保藏微生物的參考1.MF-20008a.保藏該微生物的授權機構的名稱和地址名稱通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所地址 305日本茨城縣つくぼ市東1丁目1番3號b.a中機構的保藏日期1994年6月29日c.a中機構給出的保藏號FERM BP-5149
權利要求
1.含有冬蟲夏草的培養菌絲體熱水提取物的組合物。
2.權利要求1中的組合物，其特征在于所使用的是冬蟲夏草MF-20008。
3.權利要求1或2中的組合物，其特征在于熱水提取物是通過用85至100℃，優選的是從90至95℃的熱水提取培養菌絲體獲得的。
4.權利要求1至3中任一權項中的組合物，其特征在于熱水提取物包含熱水提取物本身、從提取物中除去提取殘留物所獲得的液體部分、它(它們)的濃縮物、糊狀物、稀釋物和/或干燥物。
5.權利要求1至4中任一權項中的組合物，該組合物是藥品型的和/或飲食品型的。
6.權利要求5中的藥品型的組合物，該組合物是強心劑、降壓劑、鎮咳劑或抗疲勞劑。
7.權利要求5中的飲食品型的組合物，該組合物是保健飲料。
全文摘要
一種包含培養的冬蟲夏草菌絲體熱水提取物的保健組合物。它是一種非常安全的口服保健組合物，并具有出色的強心、降低血壓和抗疲勞的功效。
文檔編號A61P37/00GK1151699SQ9519389
公開日1997年6月11日 申請日期1995年6月29日 優先權日1994年6月30日
發明者竹友直生, 角尾彰信, 伊藤裕之 申請人:明治乳業株式會社