專利名稱：：納米級膠態粒子的制作方法
背景技術：
：本發明涉及構造平均直徑小于1000納米(1微米)的“納米級膠態粒子”膠態樣粒子的材料和方法。這些納米級膠態粒子是亞微米級的油基粒子，其中最小的可透過例如標準用于微生物純化的0.2微米濾器。本發明的納米級膠態粒子在水溶液和緩沖液中可形成穩定分散體。由于納米級膠態粒子的尺寸小，它們具有各種用途。例如脂質體、非磷脂脂膜泡和微膠囊等其它合成粒子，通常為1微米或更大。相比之下，形成直徑小于100納米的本發明納米級膠態粒子是可能的。與脂膜泡不同，其中的一些可設計成帶一種油的，例如見Wallach的美國專利No.4911928，在本發明粒子的制備中需要至少一種油、一種穩定劑/表面活性劑、一種引發劑和水或另一種稀釋劑。但是既不用膽甾醇，也不用磷脂。實際上，這些納米級粒子可由適于人使用的食品級，USP或NF級材料制成。如果這些納米級膠態粒子用于將一種材料局部轉運至血流中，這一點便尤其重要。此類系列的一個特定用途是例如雌二醇等天然或合成激素的輸送。這些材料通常有溶解性問題，例如，它們通常只溶解于難以滲入穩定的顆粒系列，例如乙醇這樣的材料中。納米級膠態粒子的獨特之處在于，它們使溶于水、油或引發劑(即乙醇或甲醇)中任一種的物質滲入到平均直徑約30～1000納米的穩定粒子中。大多數制品的粒子直徑約30～500納米，可在水中混合，并且可濾過0.2或0.45微米的濾器，可在-20～25℃下貯存。利用所述材料和方法，便可生產行使以下功能的納米級膠態粒子1.將可溶于乙醇或甲醇的藥物滲入到粒子中。2.將可溶于乙醇或甲醇的農藥滲入到粒子中。3.將輔劑滲入粒子中。4.將蛋白質滲入粒子中。5.將含完整核酸的全病毒滲入粒子中，但必須指出，本發明的這些較小粒子與許多病毒的大小相同。6.將乙醇提取的香精滲入粒子中。7.將揮發油(香精和香料)滲入粒子中。8.將一種電荷滲入粒子中。9.產生有色粒子。局部轉運藥物的能力尤其重要。多年來已經知道，小粒子，例如那些直徑小于1微米的，能比大粒子更容易穿過皮膚界面，但是因小粒子轉運的藥物的量少通常限制了它們的使用。此外，大多數粒子只能轉運有限的材料類別。因此，本發明的一個目的是為了生產能轉運不同材料類別的亞微米粒子。本發明的另一個目的是為了生產能轉運溶于甲醇或乙醇，而在水溶液和油系統中溶解度有限或不溶解的材料的亞微米粒子。本發明的進一步目的是為了生產能用于藥物轉運的直徑小于100納米的粒子。本發明還有的一個目的是為了生產用于局部轉運例如雌二醇等激素的粒子。本發明的這些和其它目的及特點將在說明書和權利要求中可見。發明概述本發明描述了納米級膠態粒子和制備它們的方法。這些納米級膠態粒子作為藥物轉運載體具有特殊應用，特定應用于溶于甲醇或乙醇的材料的局部轉運。但是這些納米級膠態粒子還可用于轉運許多不同類的藥物和其它材料。納米級膠態粒子的小尺寸及其與組織的共容性使其可廣泛使用。本發明的納米級膠態粒子直徑約10-1000納米，其中大多數粒子直徑小于100納米。這種小粒子尺寸可使其通過0.2微米的濾器。納米級粒子由包括油、穩定劑(或表面活性劑)的親油相和例如甲醇或乙醇的引發劑制成。此親油相經過例如水或緩沖液的水溶液水合。優選的穩定劑是非磷脂表面活性劑，尤其表面活性劑中的吐溫類(脫水山梨醇脂肪酸酯的聚氧乙烯衍生物)和壬基酚聚乙烯乙二醇醚。最優選的表面活性劑為吐溫60(聚氧乙烯20脫水山梨醇單硬脂酸酯)和吐溫80(聚氧乙烯20脫水山梨醇單油酸酯)，和TergitolNP-40(聚(氧-1，2-乙二基)，α-(4-壬基酚)-ω-羥基，分支的〔平均分子量1980〕)和TergitolNP-70(一種混合表面活性劑，AQ＝70％)。這些表面活性劑的高分子量在制備方面及所得的納米級膠態粒子穩定性方面表現出具有優點。在本發明中優選的引發劑是乙醇或甲醇，但在某些情況下，其它短鏈醇和/或氨基酸也可使用。盡管純乙醇或甲醇為優選，但這兩者的混合物和含至少50％乙醇的混合或未混合材料均可使用。這類引發劑可包括加味引發劑，例如象薄荷、檸檬、橙子及諸如此類香味的醇提物。除了引發劑和穩定劑的表面活性劑以外，通過選擇合適的油，可調整或定做膠態粒子。盡管大多數油看上去可起作用，但優選的油是從蔬菜油、堅果油、魚油、豬由、礦物油、角鯊烷、三辛精及它們的混合物中選擇出來的。許多其它物質可以加到納米級膠態粒子中以改制粒子。除了形成粒子的其它油外，揮發油，例如揮發香味油，可用來替代一些油或者加入其中。也可使用著色劑，例如食品著色劑，優選地將它加至引發劑中。引發劑或油還可運載摻到最終粒子懸浮液中的活性物質。這些活性物質在液體中可溶解或懸浮。一種優選的添加劑是類固醇或激素例如雌二醇，它們溶于乙醇引發劑，并可摻到粒子中。因為雌二醇在水溶液中沉淀，水相的加入會使雌二醇沉淀，然后雌二醇會在局部制劑中釋放。出現的一個有趣現象是，用本發明方法形成的結晶類型在形狀上與雌二醇的標準水溶液沉淀物的有所不同。用于水合親油相的水溶液優選地為一種例如水或緩沖液等生理相容溶液，例如磷酸鹽緩沖液鹽水。水溶液可以具有溶解于或懸浮于其中以供摻入的活性物質。制備納米級膠態粒子的基本步驟是將油、穩定劑/表面活性劑和引發劑混合以形成親油相，并且優選地以約4∶1的比例將過量的親油相與水稀釋溶液混合。用穿過孔徑1/18000英寸的產生相對速度約50m/s的設備，來優選完成親油相與水相的混合或水合。這種剪切使粒子在優選的大小范圍，而小的剪切值會產生較大尺寸的粒子，例如用較大外徑或較低速度。此外，這里所述的所有不同材料和過程可調整或選擇，以控制所得納米級膠態粒子的性質。活性物質可載于油中、引發劑中或用于摻入粒子的水相中。雖然粒子是膠態的，它們仍可以是反膠態的形式而不改變本發明的范圍。通過以下詳述和附圖將對本發明進一步闡述。附圖簡述圖1a和1b是本發明納米級膠態粒子在兩個不同放大倍數時的電子顯微圖；圖2是用三種不同型的載體，給予1mg雌二醇后，卵巢切除的Rhesus猴的血清雌二醇水平圖。發明詳述本發明涉及納米級膠態粒子和它們的制備方法。與微膠囊和脂質體系統不同，本發明納米級膠態粒子具有大量直徑100納米以下的粒子，而仍載大量活性成分。這些納米級膠態粒子作為局部藥物轉運載體尤其有用，因為它們顆粒小并具有允許快速皮下滲透的其它特點。納米級膠態粒子還具有極多功能，用于能夠運載包括那些懸浮或溶解于油、水稀釋液或優選引發劑的任一種活性材料。這些特性使此系統得以使用難于在其它轉運系統中使用的活性物質。首先將至少一種油，優選選自表1的一種油、一種穩定劑(表面活性劑)，優選選自表2的一種表面活性劑，和一種引發劑，優選甲醇或乙醇，混合而制成納米級膠態粒子。最優選的穩定劑是吐溫60、吐溫80、TergitolNP-40和TergitolNP-70。其余可能的引發劑見于表3(醇和有關化合物)和表4(醇加香的提取物)。如果使用表4中任一小于50％乙醇的醇加香的提取物，則用乙醇和提取物的1∶1混合物以保證至少使用50％乙醇。揮發油也可加至這些化學組分(表5)中，色素可加到油-穩定劑引發劑混合物中。通過將油加至油-穩定劑-引發劑中，可引入負電荷。預先混合這些材料后，將水或例如顯示于表7的合適的緩沖液，在高速度下注入此混合物中。油∶穩定劑∶引發劑的優選比例分別為25∶3∶5，以體積比為基準。預先混合的含油相與水的優選比例為4∶1。用往復式注射裝置、連續流動裝置、或高速混合儀可生產出納米級粒子。在4∶1比例時所得粒子的直徑為30-500納米。這些水混溶粒子然后既可通過0.2、又可通過0.45微米濾器過濾。生產出較大的膠態粒子的方法是通過簡單增加水含量，降低油-穩定劑-引發劑含量或改變形成粒子時的剪切力。我們將平均直徑小于1000納米(1微米)的粒子命名為“納米級膠態粒子”。表1用于制備納米級膠態粒子的油杏仁油，甜的杏種子油琉璃苣油Canolaoil椰子油玉米油棉籽油魚油加州希蒙得木豆油豬油亞麻子油，煮沸的macadamia果仁油礦物油橄欖油花生油紅花油芝麻油大豆油角鯊烷向日葵籽油三辛酸甘油酯(1，2，3三辛酰基甘油)麥胚油表2用于制備納米級膠態粒子的穩定劑/表面活性劑吐溫60吐溫80壬基酚聚乙二醇醚(烷基酚-羥基聚氧乙烯)1.聚(氧-1，2-ethanediyl)，α-(4-壬基酚)-Ω-羥基-，分支的(即TergitolNP-40表面活性劑)通式C95H185O40MW(平均)＝19802.壬基酚聚乙二醇醚混合物(即TergitolNP-70(70％AQ)表面活性劑)通式及MW無法得知(混合物)表3用于制備納米級膠態粒子的引發劑乙醇甲醇表4用于制備納米級膠態粒子的加香味引發劑(加香提取物*)純茴香提取物(73％乙醇)人造的香蕉提取物(40％乙醇)人造的櫻桃提取物(24％乙醇)巧克力提取物(23％乙醇)純檸檬提取物(84％乙醇)純橙子提取物(80％乙醇)純薄荷提取物(89％乙醇)人造菠蘿提取物(42％乙醇)人造甜油提取物(35％乙醇)人造草莓提取物(30％乙醇)純香草提取物(35％乙醇)*所用的提取物為食品級材料(McCormick)其它來源的材料可以代用。表5用于制備納米級膠態粒子的揮發油或香料滇荊芥油月桂油香檸檬油雪松木油櫻桃油肉桂油丁子香油牛至油薄荷油表6用于制備納米級膠態粒子的食用色素綠黃紅蘭*所用的食用色素為食品級材料(McCormick)其它來源的材料可以代用。表7用于制備納米級膠態粒子的稀釋劑注射用水磷酸鹽緩沖鹽以下實例將更清楚地闡明本發明及其用途。實例1-不帶電荷的納米級膠態粒子的生產表8含有用于生產納米級膠態粒子的材料，其中水作稀釋劑。用CoulterL130激光分級儀的分級參數見表9。表8用水作稀釋劑的納米級膠態粒子的制備化學組分量大豆油(油)25ml聚失水山梨酸酯80(吐溫80)(穩定劑)3ml乙醇(引發劑)5ml將以上油-穩定劑-引發劑組合物混合60秒，用往復式注射儀將1ml水注入4ml混合物中。此儀器具有通過一個不銹鋼Leurlok連結管與一個1/18000英寸小孔連在一起的兩個5ml注射器，溶液通過連結管在注射器之間推注約100秒。生成的粒子在EM柵板上干燥，用乙酸雙氧鈾著色，并且進行電子顯微圖研究。圖1a顯示了在60000×放大倍數下此制備的電子顯微圖，而圖1b顯示了在150000×放大倍數下的相同制備。納米級膠態粒子的生產方法簡述于下列各表之后。表9-用水作稀釋劑的納米級膠態粒子的分級制劑LS-130LS-130平均直徑范圍(納米)(納米)納米級膠態粒子312193-455(SBO/Tw80/E/WFI)使用LS-130分級儀的一個問題在于，它不能準確將直徑小于200納米的粒子分級。用圖1a和1b，可證實，大多數粒子直徑在70-90納米，只有5％的粒子直徑大于90納米。20-30納米的粒子在表1b中的較高放大倍數下可見。實例2-將雌二醇摻入納米級膠態粒子中表10和12含有用于生產兩份將雌二醇以兩種不同濃度摻入其中的不帶電荷的納米級膠態粒子材料。每種制劑以水為稀釋劑而制成。雌二醇濃度較高的材料用于下面實例3所述的rhesus猴的研究。將50或100mg雌二醇溶于納米級膠態粒子形成前的制劑的引發劑中(乙醇組分)，這一點很重要，因為雌二醇在有水存在時會沉淀。實際上，試劑級乙醇中少量的水足以沉淀雌二醇，因為用這里所述的材料和過程而形成的膠態粒子顯示出其中含有雌二醇結晶。但是，這些結晶呈片狀而不是標準發現于水中的針狀沉淀。表10含雌二醇的納米級膠態粒子的制備化學組分量大豆油(油)25ml聚失水山梨酸酯80(吐溫80)(穩定劑)3ml乙醇(引發劑)5ml雌二醇50mg用與實例1中所述基本相同的過程制得納米級膠態粒子，除了在引發劑與其它組分混合之前將雌二醇溶解(或懸浮)于乙醇引發劑中。用手混合油-穩定劑-引發劑/雌二醇組合物或用渦流混合器混合60秒。用例如實例1中所述的往復式注射儀將1ml水注入到4ml生成的混合物中。表11含納米級膠態粒子(50mg)的雌二醇分級數據制劑LS-130LS-130平均直徑范圍(納米)(納米)納米級膠態粒子289174-459(SBO/Tw80/Etoh-雌二醇/WFI)用CoulterLS130激光分級儀測定的這些制劑的分級數據分別見表11和13。LS130分級儀不能準確將直徑小于200納米的粒子分級。這些材料還在EM柵板上干燥，用乙酸雙氧鈾著色，并且進行電子顯微圖研究。電子顯微圖顯示出大多數粒子小于200納米，20-30納米的粒子可見。在較大的膠態粒子中，易見結晶的雌二醇。在任何范圍內無游離藥物結晶，表明藥物完全摻至膠態粒子中。表12含雌二醇的納米級膠態粒子的制備化學組分量大豆油(油)25ml聚失水山梨酸酯80(吐溫90)(穩定劑)3ml乙醇(引發劑)5ml雌二醇100mg表13含納米級膠態粒子的雌二醇分級數據制劑LS-130LS-130平均直徑范圍(納米)(納米)納米級膠態粒子217151-291(SBO/Tw80/Etoh雌二醇/WFI)實例3-含雌二醇制劑的Rhesus猴檢測用標準雌二醇的乙醇制劑來檢測實例2的100mg雌二醇制劑，以表明其效力。將乙醇(表14)或納米級膠態粒子(表15)中的1mg雌二醇應用于四只卵巢切除的Rhesus猴的表皮，其后32天記錄系列血樣，并且確定血清雌二醇水平，血清雌二醇數據圖示于圖2。沒有額外的藥物作用于任何動物表皮，其后觀察動物60天以確定發生時間、周期和陰道出血的嚴重程度(表16)。表14-一次局部給予相當于1mg雌二醇的納米級膠態粒子后卵巢切除雌性猴的血清雌二醇水平</tables>aCDB3988＝2.4mg雌二醇/每mlTween/oil給藥體積為0.42ml。b0＝未檢出，分析的測定限度(ED90)為13.3±2.4pg/ml(平均±血清雌二醇，n＝4)表15-一次局部給予含雌二醇a的1mg乙醇后卵巢切除雌猴的血清雌二醇水平</tables>aCDB100＝2.4mg雌二醇每ml無水乙醇給藥體積為0.42ml。b0＝不可測定，分析的測定限度(ED90)為13.3±2.4pg/ml(平均±血清雌二醇，n＝4)表14和15中的數據及圖2表明，雌激素的治療血清水平存在于一次給藥后1小時的兩組卵巢切除動物的血流中。用乙醇制劑，平均雌二醇水平大于40pg/ml保持7天，用納米級粒子制劑保持6天。當雌激素水平低時(見圖2，和表16)，兩組均發生陰道出血。另外尤其有趣的是圖2中曲線的形狀。乙醇-雌二醇制劑產生一個“尖齒”曲線，顯示有高的開始反應和陡然下降，而納米級膠態粒子制劑以近乎平坦的水平產生許多“平臺”效應數小時。這種“平臺效應”通常為優選，因為可以將一些與峰相伴的問題減到最少。表16-一次局部給予乙醇或納米級膠態粒子的雌二醇后，卵巢切除RHESUS猴的雌激素止血</tables>a出血的平均強度除以出血周期(1＝極微、2＝中等，3＝嚴重)bNovavaxMN懸浮物112942c用方差單側分析和學生Neuman-Keuls多重范圍檢測與乙醇溶液中的雌二醇相比較，有顯著差異(p＜0.01)因此，此實例表明在非人靈長目動物中，本發明的納米級膠態粒子可應用于將雌二醇轉運通過未受損表皮，一次給藥后治療血清雌二醇水平保持6天。此技術在醫療中具有許多治療應用。雌二醇制劑在不同溫度下也是穩定的。表17顯示實例2在-20℃、25℃、65℃時的納米級膠態粒子制劑的熱穩定數據。顯而易見，盡管納米級膠態粒子高溫時不穩定，它們在室溫和低溫時是穩定的。表17納米級膠態粒子的熱穩定性制劑LS-130LS-130平均直徑范圍(納米)(納米)納米級膠態粒子361168-599(SBO/Tw80/Etoh-雌二醇/WFI)25℃保存納米級膠態粒子312179-510(SBO/Tw80/Etoh-雌二醇/WFI)-20℃保存納米級膠態粒子(SBO/Tw80/Etoh-雌二醇/WFI)不穩定65℃保存此外，本發明的納米級膠態粒子可用水溶液稀釋而不喪失其穩定性，這使得在必要時采用可稀釋的高濃度產物成為可能。本領域的技術人員用常規實驗便可認識或確信，有許多與本發明在此所述的特定實施方案等同的實施方案，這種等同將包含在以下權利要求中。權利要求1.一種直徑約為25～1000nm的納米級膠態粒子，該納米級膠態粒子包括含有油、穩定劑和引發劑的、用合適的水基溶液水合的親油相。2.權利要求1的納米級膠態粒子，其中的穩定劑從吐溫60、吐溫80、壬基酚聚乙二醇醚及其混合物中選擇。3.權利要求1的納米級膠態粒子，其中的引發劑從含甲醇、乙醇及其混合物的醇類材料中選擇。4.權利要求2的納米級膠態粒子，其中的引發劑從含50％或更高的甲醇、乙醇及其混合物的醇類基材料中選擇。5.權利要求1的納米級膠態粒子，其中的油從蔬菜油、堅果油、魚油、豬油、礦物油、角鯊烷、三辛酸甘油酯及其混合物中選擇。6.權利要求1的納米級膠態粒子，其中的水溶液包含生理相容性溶液。7.權利要求9的納米級膠態粒子，其中的水溶液從水和磷酸鹽緩沖溶液中選擇。8.權利要求1的納米級膠態粒子，其中的水相具有溶解或懸浮其中的活性材料。9.權利要求1的納米級膠態粒子，其中的油具有溶解或懸浮其中的活性材料。10.權利要求1的納米級膠態粒子，其中的引發劑具有溶解或懸浮其中的活性材料。11.權利要求10的納米級膠態粒子，其中的活性材料包含雌二醇。12.權利要求1的納米級膠態粒子，其中的納米級膠態粒子在水溶液中可分散。13.權利要求1的納米級膠態粒子，其中的納米級膠態粒子的直徑可通過0.2mm的濾器。14.一種制備納米級膠態粒子的方法，包括以下步驟將過量的油與穩定劑和引發劑混合而形成親油相；制備具有水溶液基的稀釋溶液；并且將過量的該親油相與該稀釋液混合而形成納米級膠態粒子。15.權利要求14的方法，其中的穩定劑選自吐溫60、吐溫80、壬基酚聚乙二醇醚及其混合物。16.權利要求14的方法，其中的引發劑從含甲醇、乙醇及混合物的醇類基材料中選擇。17.權利要求16的方法，其中的引發劑從含50％或更高的乙醇、甲醇及其混合物的醇類基材料中選擇。18.權利要求14的方法，其中的油從蔬菜油、堅果油、魚油、豬油、礦物油、角鯊烷、三辛酸甘油酯及其混合物中選擇。19.權利要求18的方法，其中的水溶液包含生理相容性溶液。20.權利要求19的方法，其中的水溶液從水、磷酸鹽緩沖溶液中選擇。21.權利要求14的方法，其中的水相含有溶解或懸浮其中的活性材料。22.權利要求14的方法，其中的油含有溶解或懸浮其中的活性材料。23.權利要求14的方法，其中的引發劑含有溶解或懸浮其中的活性材料。24.權利要求23的方法，其中的活性材料包含雌二醇。25.權利要求14的方法，其中的親油相與稀釋劑的混合是通過一個1/18,000英寸的孔，用約50m/s的相對速度來完成的。26.權利要求14的方法，其中的親油相與水相的比例約為4∶1。全文摘要本發明涉及納米級膠態粒子及其生產方法。納米級膠態粒子是將一種油、一種穩定劑/表面活性劑和一種含水溶液的乙醇引發劑的混合物水合而成的。這些納米級膠態粒子直徑通常小于100納米。因為尺寸小而易于滲透,它們尤其有利于輸送例如雌二醇等材料局部通過表皮。文檔編號A61K31/565GK1179698SQ96192912公開日1998年4月22日申請日期1996年1月29日優先權日1995年1月31日發明者C·D·賴特申請人:諾瓦瓦克斯有限公司