基于血紅蛋白衍生肽的新型藥物組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及包含至少一種Toll樣受體（TLR)活化兩親性脂質和至少一種血紅蛋 白衍生肽以及任選的藥學可接受的載體的藥物組合物。本發明還涉及用于預防和/或治療 腫瘤、預防和/或治療感染、預防和/或治療變態反應、預防和/或治療年齡相關性免疫失 衡、刺激先天性和適應性免疫系統和/或減輕輻照的不良副作用的根據本發明的藥物組合 物。此外，本發明還涉及血紅蛋白衍生肽以及其在治療細菌感染中的用途。
[0002] 在本說明書中，引用了許多文件包括專利申請和制造商的手冊。這些文件的公開 內容雖然不視為與本發明的專利性有關，但整體通過引用并入本文。更具體而言，所有提及 的文件均通過引用并入本文，其程度與每個個別文本特別且個別指出通過引用并入相同。
【背景技術】
[0003] 在過去，胎兒器官、組織或細胞的轉移已作為針對疾病例如癌癥或嚴重感染以及 針對衰老過程的預防或治療措施傳播。胎兒組織的提取物因此看起來具有有利的醫學效 應，并且有時在癌癥和某些感染的治療或預防中特別推薦。盡管本領域中相當大的興趣，但 這些胎兒組織提取物中的醫學有效原理通常是難以捉摸的。此類組合物的注冊問題是不言 而喻的。
[0004] 另外，自一個多世紀以來，通過注射活的和/或熱殺死的細菌的癌癥治療得到傳 播（Coley，W.B. :Am.J· Med. Sci 105,487-511(1893))。約 50 年前，顯示此類治療的腫瘤壞 死效應是由于細菌內毒素。內毒素也稱為脂多糖（LPS)，是革蘭氏陰性菌的細胞壁的組成 成分。內毒素活化先天性免疫系統且促成適應性免疫系統的活化。在嚴重革蘭氏陰性感染 期間，內毒素在膿毒性休克的發展中起關鍵作用（Rietschel等人1994)。然而，低濃度的 LPS以及LPS部分結構例如單磷酰脂質A(MPLA)，顯示出對于宿主有利的效應。這些效應包 括由于其驚人的免疫刺激和免疫調節活性，對感染的抗性增強和針對惡性腫瘤的保護（Fox 等人2010)。有害以及有利的宿主應答并非被LPS直接誘導，而是由免疫調節劑分子介導， 所述免疫調節劑分子例如腫瘤壞死因子（TNF)、白細胞介素家族成員（IL-1、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-12)、干擾素、還原氧種類和脂質。這些介質主要由單核細胞/巨噬細胞釋放， 而且還由其他細胞類型如血管細胞、上皮細胞、多形核細胞和肥大細胞釋放（Galanos等人 (1992)，Loppnow(1994) ;Supajatura等人（2001))。先前，T細胞也已顯示參與針對LPS的 應答（Mattern 等人（1994))。
[0005] 綿羊或人起源的胎兒血紅蛋白（HbF)已發現在體外在來自鼠巨噬細胞和人外周 血單核細胞的細胞因子誘導中與LPS和脂質A協同作用。另外，在體內觀察到LPS誘導的 通過HbF的先天性和適應性免疫應答的調節（Gorczynski等人（2006) ;Howe等人（2008a); TO 2004/073728A2)。這種協同活性可以顯示主要位于胎兒HbF的γ鏈（Hby)中。關于 Hb γ和脂質A之間的合作效應的一種解釋是Hb誘導的脂質A的構象變化，這導致增強的生 物活性。生物物理學分析顯示Hb以及Hb鏈導致脂質A成為更圓錐形的內毒素構象，其中 Hb嵌入內毒素聚集體內，隨后為崩解過程（Howe等人（2008a) !Brandenburg等人（2003); Howe等人（2007) ;Howe等人（2008b))。近來，已顯示Hb的Hb α -亞基和Hb β -亞基具有 LPS結合位點。這些結合位點的特征在于得自Hb α -亞基和Hb β -亞基序列的獨特合成肽， 其能夠中和而不是協同LPS的內毒素活性（Bahl等人（2011))。
[0006] 盡管這些發展，但全長胎兒血紅蛋白或其單鏈的使用具有下述缺點：所述全長蛋 白質必須借助于純化或經由重組或（半）合成方式由組織提供，所有這些方式均為昂貴和 耗時的。
[0007] 相應地，仍存在提供可以更有利地用于抵抗疾病例如腫瘤或嚴重感染或者衰老中 的手段的需要，所述手段易于制備并且與上文討論的缺點無關。
[0008] 這種需要通過提供在權利要求中表征的實施方案得到解決。

【發明內容】

[0009] 相應地，本發明涉及包含至少一種Toll樣受體（TLR)活化兩親性脂質和至少一種 血紅蛋白衍生肽以及任選的藥學可接受的載體的藥物組合物，其中所述血紅蛋白衍生肽由 下述組成：
[0010] (a)由式I的序列組成的氨基酸序列：
[0011] A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19(式 I)，
[0012] 其中
[0013] Al選自蘇氨酸、半胱氨酸和絲氨酸；
[0014] A2選自纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和異亮氨酸；
[0015] A3選自亮氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸；
[0016] A4選自丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸；
[0017] A5選自異亮氨酸、組氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸；
[0018] A6選自組氨酸、精氨酸和亮氨酸；
[0019] A7選自苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；
[0020] A8選自甘氨酸和丙氨酸；
[0021] A9選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸；
[0022] AlO選自谷氨酸和天冬氨酸；
[0023] All選自苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；
[0024] A12選自蘇氨酸和絲氨酸；
[0025] A13選自脯氨酸和甘氨酸；
[0026] A14選自谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸；
[0027] A15選自纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和異亮氨酸；
[0028] A16選自谷氨酰胺和天冬酰胺；
[0029] A17選自丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸；
[0030] A18選自絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸；和
[0031] A19選自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；
[0032] 和
[0033] (b)位于（a)的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列和/或位于（a)的氨基酸序列 的C末端的氨基酸序列，
[0034] 其中
[0035] (b-i)位于（a)的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列選自：
[0036] NI ：V ；
[0037] N2 ：LV ；
[0038] N3 ：VLV ；
[0039] N4 ：NVLV(SEQ ID NO: 108)；
[0040] N5 ：GNVLV(SEQ ID NO: 109)；
[0041] N6 ：LGNVLV (SEQ ID NO :4)；
[0042] N7 ：LLGNVLV(SEQ ID NO: HO)；
[0043] N8 ：KLLGNVLV(SEQ ID NO:111)；
[0044] N9 ：FKLLGNVLV(SEQ ID NO:112)；
[0045] NlO ：NFKLLGNVLV(SEQ ID NO:113)；
[0046] Nil ：ENFKLLGNVLV(SEQ ID NO:114)；
[0047] N12 ：PENFKLLGNVLV(SEQ ID NO:115)；
[0048] N13 ：DPENFKLLGNVLV(SEQ ID NO:116)；
[0049] N14 ：VDPENFKLLGNVLV(SEQ ID NO:117)；
[0050] N15 :HVDPENFKLLGNVLV(SEQ ID N0:118);和
[0051] N16 ：LHVDPENFKLLGNVLV(SEQ ID NO:5)；
[0052] 并且其中
[0053] (b-ii)位于（a)的氨基酸序列的C末端的氨基酸序列選自：
[0054] (1)由式II的序列組成的氨基酸序列：
[0055] C1-C2-C3-C4-C5(式 II)，
[0056] 其中
[0057] Cl :選自谷氨酰胺、天冬酰胺和酪氨酸；
[0058] C2 :選自賴氨酸、精氨酸和組氨酸；
[0059] C3 :選自甲硫氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；
[0060] C4 :選自纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和異亮氨酸；和
[0061] C5 :選自蘇氨酸、丙氨酸、絲氨酸和賴氨酸；
[0062] (2)由式III的序列組成的氨基酸序列：
[0063] C1-C2-C3-C4-C5-C6-C7-C8-C9-C10-C11-C12(式 III)，
[0064] 其中
[0065] Cl 至 C5 如（b-ii) (1)中定義；
[0066] C6 :選自丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸；
[0067] C7 :選自纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和異亮氨酸；
[0068] C8 :選自丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸；
[0069] C9 :選自絲氨酸、天冬酰胺和蘇氨酸；
[0070] ClO :選自丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸；
[0071] Cll :選自亮氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸；和
[0072] C12 :是由氨基酸序列SSRYH組成的肽或不存在；和
[0073] (3)由式IV的序列組成的氨基酸序列：
[0074] C1-C2-C3-C4-C5-C6-X(式 IV)，
[0075] 其中
[0076] Cl 至 C5 如（b-ii) (1)中定義；
[0077] C6 :選自丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸；
[0078] X :是由以任何次序的五種氨基酸殘基丙氨酸、纈氨酸、絲氨酸、丙氨酸和亮氨酸組 成的肽，
[0079] 或其擬肽。
[0080] 依照本發明，術語"藥物組合物"指用于施用于患者優選人患者的組合物。本發明 的藥物組合物包含至少一種Toll樣受體（TLR)活化兩親性脂質和至少一種血紅蛋白衍生 肽。本發明的藥物組合物可以任選且另外包含藥學可接受的載體。"藥學可接受的載體"意 指任何類型的無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、賦形劑、封裝材料或制劑助劑。合 適的藥學載體的例子是本領域眾所周知的，并且包括氯化鈉溶液、磷酸鹽緩沖氯化鈉溶液、 水、乳劑例如油/水乳劑、各種類型的濕潤劑、無菌溶液、有機溶劑等。優選地，載體是腸胃 外載體，更優選與接受者的血液等滲的溶液。如本文使用的，術語"腸胃外的"指施用模式， 其包括靜脈內、肌內、腹膜內和皮下注射和輸注。這些施用模式連同肌內、皮內、鼻內、經口、 經頰、舌下、粘膜（例如經由鼻噴霧劑、滴鼻劑或滴眼劑或霜劑以及直腸或陰道（凝膠）制 劑）或支氣管內施用一起，是依照本發明的優選施用模式。依照本發明的最優選的施用模 式是肌內施用或經口應用。載體任選含有少量添加劑，例如增強等滲性和化學穩定性的物 質。此類材料在采用的劑量和濃度時對于接受者是無毒的，并且包括緩沖劑例如磷酸鹽、檸 檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸和其他有機酸或其鹽；抗氧化劑例如抗壞血酸；低分子量（少于約 十個殘基）（多）肽例如聚精氨酸或三肽；蛋白質例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親 水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、二 糖和其他碳水化合物，包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如Η)ΤΑ ; 糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇；抗衡離子例如鈉；和/或非離子表面活性劑例如聚山梨醇 酯、泊洛沙姆或PEG。
[0081] 包含此類載體的組合物可以通過眾所周知的常規方法進行配制。一般地，通過使 藥物組合物的組分均勻且緊密地與液體載體或精細分開的固體載體或兩者接觸來制備制 劑。隨后，需要時，使產物成形為所需制劑。
[0082] 這些藥物組合物可以以合適劑量施用于對象。劑量方案由主治醫師和臨床因素決 定。如醫學領域中眾所周知的，關于任何一個患者的劑量取決于許多因素，包括患者的大 小、體表面積、年齡、待施用的具體化合物、性別、施用時間和途徑、一般健康和其他同時施 用的藥物。關于給定情況的治療有效量將通過例行實驗容易地確定，并且在普通臨床醫生 或醫師的技術和判斷內。藥物組合物可以用于施用一次或經過延長時間段的有規律施用。 一般地，取決于施用途徑，以單一劑量形式的藥物組合物的施用應在例如〇. lng/kg體重至 20 μ g/kg體重的Toll樣受體（TLR)活化兩親性脂質的范圍內，以及例如0. lng/kg體重至 200 μ g/kg體重的本發明的血紅蛋白衍生肽的范圍內。然而，對于單一劑量，活性化合物 各自的更優選劑量可以在〇. 05 - 10 μ g/kg體重的范圍內，并且甚至更優選在0. 1 - 1 μ g/ kg體重的范圍內。更具體而言，對于Toll樣受體（TLR)活化兩親性脂質和血紅蛋白衍生 肽分別地，關于i. V.施用的優選單一劑量可以在〇. I - l〇ng/kg體重的范圍內，對于s. c.、 i. m.或i. d.施用，在5 - 500ng/kg體重（）的范圍內，或對于經口施用最高達20 μ g/kg體 重。在本發明的藥劑與進一步的藥學活性化合物例如本文其他地方描述的那些組合的情況 下，這些劑量的調整在普通臨床醫生或醫師的技術和判斷內。優選地，組分的重量相關在血 紅蛋白衍生肽與Toll樣受體（TLR)活化兩親性脂質1:1至100:1的范圍內。
[0083] 待用于治療施用的藥物組合物的組分必須是無菌的。無菌性通過經由無菌過濾膜 (例如0. 2微米膜）過濾而容易地完成，盡管本發明并不限于這種達到無菌性的示例性方 法。本發明的藥物組合物根據GMP標準依照國家法律和法規要求進行配制。
[0084] 藥物組合物的組分通常作為水溶液或用于重構的凍干制劑，貯存于單位或多劑量 容器中，例如密封安瓿或小瓶。作為凍干制劑的例子，l〇-ml小瓶填充有5ml無菌過濾的1 % (w/v)水溶液，并且所得到的混合物是凍干的。通過使用抑菌注射用水重構一種或多種凍干 化合物，來制備輸注溶液。還可以存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯 合劑和惰性氣體等等。取決于藥物組合物的預期用途，藥物組合物可以包含進一步試劑。
[0085] 如本文使用的，術語"包含"指"由……組成"以及"涵蓋"（即，在其他中）兩者。 就活性成分一種或多種Toll樣受體（TLR)活化兩親性脂質和一種或多種血紅蛋白衍生肽 而言，該術語指僅這兩種化合物作為活性化合物的存在（即由……組成），或這兩類化合物 和另外藥劑的存在（即包含/涵蓋）。此類另外的藥劑可以例如是本領域已知有效治療本 文下文描述的疾病的藥劑，例如用于預防和/或治療腫瘤、預防和/或治療感染、預防和/ 或治療變態反應、預防和/或治療年齡相關性免疫失衡、刺激先天性和適應性免疫系統和/ 或減輕輻照的不良副作用的藥劑。這些疾病在本文下文更詳細地描述。
[0086] 因為本發明的藥物制劑依賴上述化合物，即與（a) -種或多種血紅蛋白衍生肽組 合的（a) -種或多種Toll樣受體（TLR)活化兩親性脂質，所以優選另外的試劑僅用作補充 物，即以與用作唯一藥物時的推薦劑量相比較的降低劑量，以便例如降低由所述進一步試 劑賦予的副作用。
[0087] 如本文使用的，術語"至少"指具體記載的量，以及指超過具體記載的量或數目。 例如，術語"至少一種TLR活化兩親性脂質"還涵蓋至少兩種、至少三種、至少四種、至少五 種TLR活化兩親性脂質等等。此外，該術語還涵蓋剛好兩種、剛好三種、剛好四種、剛好五種 TLR活化兩未性脂質等等。
[0088] Toll樣受體（TLR)活化兩親性脂質是本領域眾所周知的。Toll樣受體（TLR)最 初通過遺傳手段鑒定為傳感器，其檢測對微生物獨特且在微生物分類群中廣泛表現的分子 標志；參見例如 Blasius 和 Beutler，''Intracellular Toll-like Receptors.''Immunity 32:305-315(2010)。首先 LPS(TLR4)，隨后為 DNA(TLR9)、RNA(TLR3、TLR7、TLR8)、脂肽 (TLR2)，且隨后為鞭毛蛋白（TLR5)顯示為活化Toll樣受體的配體。相應地，能夠活化Toll 樣受體的兩親性脂質例如LPS或脂肽多年來已經是本領域已知的。此外，脂質LPS和脂 肽/脂蛋白視為兩親性脂質的例子的事實也是本領域眾所周知的，參見例如"Properties of Amphiphiles. 〃于：Chemistry and Biological Activities of Bacterial Surface Amphiphiles，編輯 Gerald Shockman 和 Anthony J. fficken, Academic Press，eBook ISBN 9780323151986(2012)，第1-9頁。優選地，TLR活化兩親性脂質選自內毒素，或其內毒素活 性部分，和細菌脂肽。
[0089] 術語"內毒素"（在本文中也稱為脂多糖，LPS)指一般而言由革蘭氏陰性菌產生的 生物活性化合物，并且構成它們可以由其生物學或化學釋放的細菌外膜的主要組分。內毒 素是由親水多糖部分和共價結合的稱為脂質A的疏水脂質組分組成的兩親性分子。一般而 言，脂質A組分包含磷酸化的β -1，6-連接的D葡糖胺二糖，其攜帶最高達七個酰基殘基。 然而，在脂肪酸的長度、位置和數目中存在變動。脂質A已顯示構成LPS的內毒素要素，因 為LPS的生物學效應通過無多糖脂質A再現（Galanos等人（1985))。該發現以后通過使用 完全化學合成的脂質A和相應的脂質A部分結構例如大腸桿菌（E. coli)脂質A得到證實 (Imoto等人（1987))。此外，此類合成化合物是用于研究LPS和脂質A的結構-活性關系 的基礎（Rietschel等人（1987))。相對于細胞因子誘導能力，脂質A生物活性的最低限度 要求是由兩個D-葡萄糖構型的己糖胺殘基、兩個磷酰基和六個脂肪酸組成的分子，如大腸 桿菌脂質A或流感嗜血桿菌（H. influenzae)中存在的（Rietschel等人（1994))。根據關 于結構-活性關系的大量數據，得出結論天然形式的大腸桿菌脂質A代表關于強單核細胞/ 巨噬細胞活化能力的最佳構型。無論是在己糖胺二糖的磷酸化模式還是酰化模式中不同， 大腸桿菌脂質A的所有化學不同的結構或衍生物，在誘導單核因子中活性較小或甚至無活 性。
[0090] 依照本發明應當理解本發明的藥物組合物中采用的內毒素可以衍生自任何革蘭 氏陰性、攜帶內毒素的細菌。優選地，所述內毒素衍生自大腸桿菌。
[0091] 術語內毒素的"內毒素活性部分"指展示天然存在的內毒素的至少50%，優選至少 75%，更優選至少90%例如至少95%，且最優選至少100%的內毒素活性的部分。內毒素的 內毒素活性部分可以例如通過LPS的化學或酶促斷裂或者通過LPS的（生物）化學修飾而 衍生，由此藥學有利部分（基本上）得到維持或改善。此類內毒素活性部分包括通過部分 酶促/水解去糖基化、去磷酸化和脫酰基而產生的片段，或者通過糖基、磷酰基或酰基轉移 酶的作用，或通過已知在哺乳動物組織特別是肝中發生