一種軟組織工程多孔支架及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種軟組織工程多孔支架及其制備方法，由羧甲基纖維素鈉、殼聚糖和聚乙烯基吡咯烷酮復合制得，其中羧甲基纖維素鈉與聚乙烯基吡咯烷酮的質量比為1:50～1:0.1，羧甲基纖維素鈉與殼聚糖的質量比為1:50～1:0.1，多孔支架厚度為0.8～2.6mm，孔隙率為35.0%～87.0%，拉伸強度為1.4MPa～68.98MPa；該支架的制備方法環保無毒、制備工藝過程簡單、成本低廉，制備得到的支架生物相容性好，能替代人工皮膚，用作皮膚敷料和皮膚組織工程材料，幫助皮膚大面積和深度燒傷的患者，在自體皮不夠的情況下恢復因皮膚創傷喪失的生理功能。
【專利說明】
-種軟組織工程多孔支架及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明設及一種軟組織工程多孔支架及其制備方法，該多孔的軟組織工程支架可 被應用于皮膚組織工程，屬于生物醫學材料領域。
【背景技術】
[0002] 組織工程化皮膚是指由細胞或細胞外基質或由兩者共同結合組成的皮膚產品，是 應用生命科學和工程學的原理與技術將種子細胞與適當的支架材料相結合構建出的用于 修復、維護和改善損傷皮膚組織功能和形態的生物替代物。近年來，伴隨細胞生物學、分子 生物學及生物材料學的迅速發展，組織工程學也取得了巨大的進展，其中皮膚組織工程學 的發展尤為引人注目。部分組織工程化皮膚產品甚至取得美國食品與藥品管理局(FDA)的 許可而應用于臨床，在外構建組織工程化皮膚的過程中，種子細胞所賴W存在的支架材料 一直是研究的熱點之一。傳統的支架制造方法包括相分離法、致孔劑析孔法和發泡法等。但 運些工藝可控性差，難W構建結構復雜、供多細胞生長的支架微觀結構。
[0003] 殼聚糖(CS)是一種天然高分子聚合物，化學性質穩定，易成膜，有良好的生物相容 性，無毒，具有抗凝血等多種生物活性和優良的抗菌性，同時還具有防止傷口感染，促進肉 芽生長和皮膚再生，但是純的殼聚糖膜降解性差、在實際應用中存在著力學性能差、脆性大 W及不適用于酸性環境等問題。
[0004] 簇甲基纖維素鋼(CMC)作為含有多徑基及簇基的高分子多糖，對皮膚及粘膜無刺 激性，在體內不會產生免疫抗原反應及熱源反應，無致突變性，可降解，是一種組織相容性 良好的體內植入生物材料，其本身就具有一定的吸水吸濕能力。
[0005] 聚乙締基化咯燒酬(PVP)是由聚合度可變化的線型NVP基團組成的聚合物，是N- 締控聚合體中性質最好和使用最廣泛的聚合物，它具有生物適配性、低毒、易成膜及可粘 性等特點，又具有很好的復配能力，對鹽、酸和熱溶液保持一定的惰性。

【發明內容】

[0006] 本發明提供一種軟組織工程多孔支架，由簇甲基纖維素鋼、殼聚糖、聚乙締基化咯 燒酬復合制得，簇甲基纖維素鋼與聚乙締基化咯燒酬的質量比為1:50~1:0.1，簇甲基纖維 素鋼與殼聚糖的質量比為1:50~1:0.1，多孔支架的厚度為0.8~2.6mm，孔隙率為35.0%~ 87.0%，拉伸強度為 1.4MPa ~68.98MPa。
[0007] 本發明的另一目的在于提供所述軟組織工程多孔支架的制備方法，具體包括W下 步驟： (1) 將簇甲基纖維素鋼和聚乙締基化咯燒酬按照質量比為1:50~1:0.1的比例混勻后， 加水，充分攬拌，得溶液A，其中水的加入量與簇甲基纖維素鋼粉體和聚乙締基化咯燒酬粉 體的總質量的比例為5~30mL/g; (2) 按照簇甲基纖維素鋼與殼聚糖的質量比為1:50~1:0.1的比例，將殼聚糖加入到10 ~30mL濃度為0.5~5mol/L酸溶液中，攬拌均勻，得到溶液B; (3) 將溶液A緩慢加入到溶液B中，并不斷攬拌，待出現白色片狀時，加入1~2mL濃度為1 ~6mo 1/L的鹽酸溶液，充分攬拌，至白色片狀消失之后，加入1~10血甘油溶液，繼續攬拌至 液體均勻穩定； (4) 將步驟(3)得到的溶液進行過濾，濾餅脫泡、流延成膜； 巧)將步驟(4)得到的產物在-30~-50°C的條件下冷凍15~25小時，再在-10~-50°C干 燥10~20小時； (6) 將步驟巧)得到的產物進行交聯； (7) 將步驟(6)得到的交聯產物進行清洗、冷凍干燥，即得到多孔軟組織工程支架。
[0008] 優選的，步驟(2)中所述酸溶液為乙酸溶液、乳酸溶液、蘋果酸溶液、巧樣酸溶液中 的一種或任意比例的幾種混合。
[0009] 優選的，步驟(3)所述甘油溶液為甘油與水按照體積比為1:100~1:10混合，攬拌 均勻得到。
[0010] 優選的，步驟(4)所述脫泡在400~500毫米隸柱的負壓下進行。
[0011] 優選的，步驟(6)所述交聯劑為質量分數1%~15%的憐酸Ξ苯醋或質量分數1%~ 15%的氨氧化鋼，交聯時間為2~20小時。
[001 ^ 優選的，步驟(7)所述冷凍干燥溫度為-40~-10°C，7令凍干燥時間為10~20小時。
[0013] 本發明支架生物相容性好，能替代人工皮膚，用作皮膚敷料和皮膚組織工程支架 材料，幫助皮膚大面積和深度燒傷的患者，在自體皮不夠的情況下恢復因皮膚創傷喪失的 生理功能;本發明所述支架的制備方法環保無毒、制備工藝過程簡單、成本低廉。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發明實施例1得到的多孔支架的掃描電鏡圖； 圖2為本發明實施例6得到的多孔支架的掃描電鏡圖。
[0015] 具體的實施方式 W下是結合實施例和附圖對本發明作進一步說明。
[0016] 實施例1 本實施例所述軟組織工程多孔支架，由簇甲基纖維素鋼、殼聚糖和聚乙締基化咯燒酬 復合制得，簇甲基纖維素鋼與聚乙締基化咯燒酬的質量比為1:3,簇甲基纖維素鋼與殼聚糖 的質量比為1:1。
[0017] 本實施例所述軟組織工程多孔支架的制備方法，具體包括W下步驟： (1) 按照簇甲基纖維素鋼和聚乙締基化咯燒酬按照1:3的質量比例，稱取Ig簇甲基纖維 素鋼粉體和3g聚乙締基化咯燒酬粉體混勻后，加入20mL水攬拌20分鐘混合均勻，得到溶液 A； (2) 按照簇甲基纖維素鋼和殼聚糖1:1的質量比例，稱取Ig殼聚糖粉體加入到lOmL濃度 為0.5mol/L的乙酸溶液中，在常溫下攬拌10分鐘，得到溶液B; (3) 將溶液A緩慢加入到溶液B中，并不斷攬拌，待液體中出現白色片狀時，加入ImL濃度 為Imol/L鹽酸，充分攬拌，至白色片狀消失之后，加入ImL甘油溶液，繼續攬拌至液體均勻穩 定，得到溶膠溶液，其中甘油溶液為甘油與水按照體積比例為1:80混合； (4) 將步驟(3)得到的產物200目過濾，置于400毫米隸柱的負壓下脫泡，流延成膜； 巧)將步驟(4)得到的產物在-40°C下冷凍2化后，在-10°C冷凍干燥15小時； (6) 將步驟巧)得到的產物使用4%的NaOH溶液進行交聯，交聯10小時； (7) 將步驟(6)得到的交聯產物放入水浴鍋中，溫度為55°C，每1.5小時進行一次換水處 理，重復3次，取出后用去離子水清洗，再進行-10°C冷凍干燥20小時，即得軟組織工程多孔 支架。
[001引本實施例所制備的多孔支架的厚度分布在0.9mm~2.3mm之間，符合皮膚膜的基本 特性;通過拉伸實驗測的多孔支架的拉伸強度為1.4MPa，力學性能良好;如圖1所示為本實 施例所制備的多孔支架的掃描電鏡圖片，從圖中可知支架表面有孔;通過BET測得孔隙率為 35.0%，吸水率為 224.780/0。
[0019] 本實施例所制備的多孔支架進行細胞毒性實驗，結果如下表1所示，結合國家標準 GB/T14233.3-2005相關規定：（1)濃度在0.05-0.3g/mL時，細胞增殖度(RGR)均在90-110之 間，細胞毒性為0或1級；（2)濃度在0.05-0.2g/mL時，細胞增殖度(RGR)均在100-112之間，細 胞毒性為0級;濃度在0.2-0.4g/mL時，細胞增殖度均在75-100之間，細胞毒性為1級；（3)支 架濃度在0.05-0.2g/mL時，細胞增殖度(RGR)均在75-95之間，細胞毒性為1級;濃度在0.2~ 0.4g/mL時，細胞增殖度(RGR)均在95-120之間，細胞毒性為0級或1級。結合上表1可W得出 實施例1所得的多孔支架無細胞毒性。
[0020] 表1多孔軟組織工程支架材料的細胞實驗
[0021] 實施例2 本實施例所述軟組織工程多孔支架，由簇甲基纖維素鋼、殼聚糖和聚乙締基化咯燒酬 復合制得，簇甲基纖維素鋼與聚乙締基化咯燒酬的質量比為1:0.1，簇甲基纖維素鋼與殼聚 糖的質量比為1:1.25。
[0022] 本實施例所述軟組織工程多孔支架的制備方法，具體包括W下步驟： (1) 將簇甲基纖維素鋼和聚乙締基化咯燒酬按照1:0.1的質量比例，稱取Ig簇甲基纖維 素鋼粉體和O.lg聚乙締基化咯燒酬粉體混勻后，加入33mL水攬拌25分鐘混合均勻，得到溶 液A; (2) 按照簇甲基纖維素鋼與殼聚糖的質量比為1:1.25,稱取1.25g殼聚糖粉體加入到 20mL濃度為3mol/L的乳酸溶液中，在常溫下攬拌30分鐘，得到溶液B; (3) 將溶液A緩慢加入到溶液B中，并不斷攬拌，待液體中出現白色片狀時，加入2mL濃度 為4mo 1/L的鹽酸，充分攬拌，至白色片狀消失之后，加入5mL甘油溶液，繼續攬拌至液體均勻 穩定，甘油溶液為甘油與水按照體積比例為1:10混合； (4) 將步驟(3)得到的產物200目過濾，置于450毫米隸柱的負壓下脫泡，流延成膜； (5) 將步驟(4)得到的產物在-30°C下冷凍20h后，在-20°C冷凍干燥10小時； (6) 將步驟巧)得到的產物使用1%的NaO田容液進行交聯，交聯2小時； (7) 將步驟(6)得到的交聯產物放入水浴鍋中，溫度為55°C，每1.5小時進行一次換水處 理，重復6次，取出后用去離子水清洗，再進行-30°C冷凍干燥15小時，即得軟組織工程多孔 支架。
[0023] 本實施例所制備的多孔支架的厚度分布在0.8mm~1.6mm之間，符合皮膚膜的一個 基本特性;通過拉伸實驗測的多孔支架的拉伸強度為15MPa，力學性能良好;通過BET檢測測 得孔隙率為50%，吸水率為394.29%。
[0024] 實施例3 本實施例所述軟組織工程多孔支架，由簇甲基纖維素鋼、殼聚糖和聚乙締基化咯燒酬 復合制得，簇甲基纖維素鋼與聚乙締基化咯燒酬的質量比為1:50,簇甲基纖維素鋼與殼聚 糖質量比為1:0.1。
[0025] 本實施例所述軟組織工程多孔支架的制備方法，具體包括W下步驟： (1) 將簇甲基纖維素鋼與聚乙締基化咯燒酬按照1:50的質量比例，稱取Ig簇甲基纖維 素鋼粉體和50g聚乙締基化咯燒酬粉體混勻后，加入255mL水攬拌30分鐘混合均勻，得到溶 液A; (2) 按照簇甲基纖維素鋼和殼聚糖1:0.1的質量比例，稱取O.lg殼聚糖粉體加入到15mL 濃度為2mol/L的巧樣酸溶液中，在常溫下攬拌30分鐘，得到溶液B; (3) 將溶液A緩慢加入到溶液B中，并不斷攬拌，待液體中出現白色片狀時，加入1.5mL濃 度為6mol/L的鹽酸，充分攬拌，至白色片狀消失之后，加入lOmL甘油溶液，繼續攬拌至液體 均勻穩定，得到溶膠溶液，其中甘油溶液為甘油與水按照體積比例為1:50混合； (4) 將步驟(3)得到的產物200目過濾，置于420毫米隸柱的負壓下脫泡，流延成膜； 巧)將步驟(4)得到的產物在-50°C下冷凍1化后，在-40°C冷凍干燥20小時； (6) 將步驟巧)得到的產物使用15%的NaOH溶液進行交聯，交聯20小時； (7) 將步驟(6)得到的交聯產物放入水浴鍋中，溫度為55°C，每1.5小時進行一次換水處 理，重復6次，取出后用去離子水清洗，再進行-20°C冷凍干燥10小時，即得軟組織工程多孔 支架。
[0026] 本實施例所制備的多孔支架的厚度主要分布在0.8mm~2.4mm之間，符合皮膚膜的 一個基本特性;通過拉伸實驗測的多孔支架的拉伸強度為28MPa，力學性能良好;通過多孔 支架的掃描電鏡圖片可知支架表面有孔;通過BET檢測測得孔隙率為65%，吸水率為吸水率 為 358.9^)。
[0027] 實施例4 本實施例所述軟組織工程多孔支架，由簇甲基纖維素鋼、殼聚糖和聚乙締基化咯燒酬 復合制得，簇甲基纖維素鋼與聚乙締基化咯燒酬的質量比為1:0.5,簇甲基纖維素鋼與殼聚 糖質量比為1:50。
[0028] 本實施例所述軟組織工程多孔支架的制備方法，具體包括W下步驟： (1) 將簇甲基纖維素鋼與聚乙締基化咯燒酬按照1:0.5的質量比例，稱取Ig簇甲基纖維 素鋼粉體和0.5g聚乙締基化咯燒酬粉體混勻后，加入30mL水攬拌20分鐘混合均勻，得到溶 液A; (2) 按照簇甲基纖維素鋼和殼聚糖1:50的質量比例，稱取50g殼聚糖粉體加入到30mL濃 度為5mol/L的蘋果酸溶液中，在常溫下攬拌30分鐘，得到溶液B; (3) 將溶液A緩慢加入到溶液B中，并不斷攬拌，待液體中出現白色片狀時，加入1.8mL濃 度為5mol/L的鹽酸，充分攬拌，至白色片狀消失之后，加入6血甘油溶液，繼續攬拌至液體均 勻穩定，得到溶膠溶液，其中甘油溶液為甘油與水按照體積比例為1:100混合； (4) 將步驟(3)得到的產物200目過濾，置于500毫米隸柱的負壓下脫泡，流延成膜； (5) 將步驟(4)得到的產物在-45°C下冷凍16h后，在-30°C冷凍干燥18小時； (6) 將步驟巧)得到的產物使用15%的憐酸Ξ苯醋溶液進行交聯，交聯10小時； (7) 將步驟(6)得到的交聯產物放入水浴鍋中，溫度為55°C，每1.5小時進行一次換水處 理，重復4次，取出后用去離子水清洗，再進行-40°C冷凍干燥12小時，即得軟組織工程多孔 支架。
[0029] 本實施例所制備的多孔支架的厚度主要分布在1.0mm~2.6mm之間，符合皮膚膜的 一個基本特性;通過拉伸實驗測的多孔支架的拉伸強度為68.9MPa，力學性能良好;通過多 孔支架的掃描電鏡圖片可知支架表面有孔;通過實驗測得孔隙率為87%，吸水率為657.34%。
[0030] 實施例5 本實施例所述軟組織工程多孔支架，由簇甲基纖維素鋼、殼聚糖和聚乙締基化咯燒酬 復合制得，簇甲基纖維素鋼與聚乙締基化咯燒酬的質量比為1:20,簇甲基纖維素鋼與殼聚 糖質量比為1:10。
[0031] 本實施例所述軟組織工程多孔支架的制備方法，具體包括W下步驟： (1) 將簇甲基纖維素鋼與聚乙締基化咯燒酬按照1:20的質量比例，稱取Ig簇甲基纖維 素鋼粉體和20g聚乙締基化咯燒酬粉體混勻后，加入210mL水攬拌20分鐘混合均勻，得到溶 液A; (2) 按照簇甲基纖維素鋼和殼聚糖1:10的質量比例，稱取lOg殼聚糖粉體加入到20mL濃 度為Imol/L的蘋果酸和Imol/L的巧樣酸W質量比1:1混合的混合溶液中，在常溫下攬拌30 分鐘，得到溶液B; (3) 將溶液A緩慢加入到溶液B中，并不斷攬拌，待液體中出現白色片狀時，加入1.5mL濃 度為2mol/L的鹽酸，充分攬拌，至白色片狀消失之后，加入3mL甘油溶液，繼續攬拌至液體均 勻穩定，得到溶膠溶液，其中甘油溶液為甘油與水按照體積比例為1:20混合； (4) 將步驟(3)得到的產物200目過濾，置于480毫米隸柱的負壓下脫泡，流延成膜； (5) 將步驟(4)得到的產物在-35°C下冷凍1她后，在-50°C冷凍干燥12小時； (6) 將步驟巧)得到的產物使用10%的憐酸Ξ苯醋溶液進行交聯，交聯2小時； (7) 將步驟(6)得到的交聯產物放入水浴鍋中，溫度為55°C，每1.5小時進行一次換水處 理，重復4次，取出后用去離子水清洗，再進行-35°C冷凍干燥14小時，即得軟組織工程多孔 支架。
[0032] 本實施例所制備的多孔支架的厚度分布在0.8mm~1.6mm之間，符合皮膚膜的一個 基本特性;通過拉伸實驗測的多孔支架的拉伸強度為49MPa，力學性能良好;通過多孔支架 的掃描電鏡圖片可知支架表面有孔;通過BET實驗測得孔隙率為70%，吸水率為650.70%。
[0033] 實施例6 本實施例所述軟組織工程多孔支架，由簇甲基纖維素鋼、殼聚糖和聚乙締基化咯燒酬 復合制得，簇甲基纖維素鋼與聚乙締基化咯燒酬的質量比為1:10,簇甲基纖維素鋼與殼聚 糖質量比為1:30。
[0034] 本實施例所述軟組織工程多孔支架的制備方法，具體包括W下步驟： (1)將簇甲基纖維素鋼與聚乙締基化咯燒酬按照1:10的質量比例，稱取Ig簇甲基纖維 素鋼粉體和lOg聚乙締基化咯燒酬粉體混勻后，加入220mL水攬拌20-30分鐘混合均勻，得到 溶液A; (2) 按照簇甲基纖維素鋼和殼聚糖1:30的質量比例，稱取30g殼聚糖粉體加入到25mL濃 度為4mol/L的乙酸和4mol/L的乳酸W質量比1:2混合后的混合溶液中，在常溫下攬拌5-30 分鐘，得到溶液B; (3) 將溶液A緩慢加入到溶液B中，并不斷攬拌，待液體中出現白色片狀時，加入1.2mL濃 度為3mol/L的鹽酸，充分攬拌，至白色片狀消失之后，加入7血甘油溶液，繼續攬拌至液體均 勻穩定，得到溶膠溶液，其中甘油溶液為甘油與水按照體積比例為1:40混合； (4) 將步驟(3)得到的產物200目過濾，置于430毫米隸柱的負壓下脫泡，流延成膜； (5) 將步驟(4)得到的產物在-35°C下冷凍22h后，在-35°C冷凍干燥16小時； (6) 將步驟巧)得到的產物使用1%的憐酸Ξ苯醋溶液進行交聯，交聯18小時； (7) 將步驟(6)得到的交聯產物放入水浴鍋中，溫度為55°C，每1.5小時進行一次換水處 理，重復5次，取出后用去離子水清洗，再進行-15°C冷凍干燥18小時，即得軟組織工程多孔 支架。
[0035] 本實施例所制備的多孔支架的厚度分布在0.9mm~1.8mm之間，符合皮膚膜的一個 基本特性;通過拉伸實驗測的多孔支架的拉伸強度為37MPa，力學性能良好;如圖2所示為本 實施例制備的多孔支架的掃描電鏡圖片，由圖中可知支架表面有孔;通過BET實驗測得孔隙 率為58%，吸水率為394.29%。
[0036] W上所述僅為本發明的實施方式，并不用W限制本發明，凡在本發明的精神和原 則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種軟組織工程多孔支架，其特征在于，由羧甲基纖維素鈉、殼聚糖、聚乙烯基吡咯 烷酮復合制得，羧甲基纖維素鈉與聚乙烯基吡咯烷酮的質量比為1:50~1:0.1，羧甲基纖維 素鈉與殼聚糖的質量比為1:50~1:0.1。2. 權利要求1所述軟組織工程多孔支架的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟： (1) 將羧甲基纖維素鈉與聚乙烯基吡咯烷酮按照質量比為1:50~1:0.1的比例混勻后， 加水，充分攪拌，得溶液A，其中水的加入量與羧甲基纖維素鈉和聚乙烯基吡咯烷酮的總質 量的比例為5~30mL/g; (2) 按照羧甲基纖維素鈉與殼聚糖的質量比為1:50~1:0.1的比例，將殼聚糖加入到10 ~30mL濃度為0.5~5mol/L酸溶液中，攪拌均勻，得到溶液B; (3) 將溶液A緩慢加入到溶液B中，并不斷攪拌，待出現白色片狀時，加入1~2mL濃度為1 ~6mol/L的鹽酸溶液，充分攪拌，至白色片狀消失之后，加入1~IOmL甘油溶液，繼續攪拌至 液體均勻穩定； (4) 將步驟(3)得到的溶液進行過濾，濾餅脫泡、流延成膜； (5) 將步驟(4)得到的產物在-30~-50 °C的條件下冷凍15~25小時，再在-10~-50°C干 燥10~20小時； (6) 將步驟(5)得到的產物進行交聯； (7) 將步驟(6)得到的交聯產物進行清洗、冷凍干燥，即得到軟組織工程多孔支架。3. 根據權利要求2所述軟組織工程多孔支架的制備方法，其特征在于，步驟(2)中的酸 溶液為乙酸溶液、乳酸溶液、蘋果酸溶液、檸檬酸溶液中的一種或任意比例的幾種混合。4. 根據權利要求2所述軟組織工程多孔支架的制備方法，其特征在于，步驟(3)甘油溶 液為甘油與水按照體積比1:100~1:10混合。5. 根據權利要求2所述軟組織工程多孔支架的制備方法，其特征在于，步驟(4)脫泡在 400~500毫米汞柱的負壓下進行。6. 根據權利要求2所述軟組織工程多孔支架的制備方法，其特征在于，步驟(6)的交聯 劑為質量分數為1%~15%的磷酸三苯酯溶液或質量分數為1%~15%的氫氧化鈉溶液，交聯時 間為2~20小時。7. 根據權利要求2所述軟組織工程多孔支架的制備方法，其特征在于，步驟(7)冷凍干 燥溫度為-40~-10°C，時間為10~20小時。
【文檔編號】A61L27/56GK105920680SQ201610385542
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月3日
【發明人】冷崇燕, 王立麗, 賴大春
【申請人】昆明理工大學