專利名稱：神經酰胺產生促進劑的制造方法
技術領域：
本發明涉及能夠促進皮膚產生神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺的神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法。
背景技術：
皮膚具有產生神經酰胺(ceramide)和葡萄糖神經酰胺(glucosylceramide)的能力。在皮膚中、特別是表皮角質層中聚集著由表皮細胞合成分泌得到的神經酰胺，它是細胞間脂質的主要成分。而由表皮細胞合成得到的神經酰胺暫時以葡萄糖神經酰胺或者神經鞘磷脂(sphingomyelin)的形式被儲存起來；之后被排出至細胞外，在葡糖腦苷酯酶 (glucocerebrosidase)和神經磷脂酶(sphingomyelinase)的作用下，再次形成神經酰胺， 從而發揮作為細胞間脂質的功能。皮膚中的神經酰胺和葡萄糖神經酰胺具有提高皮膚的保濕功能和皮膚的屏障功能等的生理作用。但是，近來由于環境、氣候等的影響，皮膚容易變得干燥，因此由皮膚自身產生神經酰胺等來改善皮膚的保濕功能就顯得不足夠。因而人們嘗試了從外部向皮膚補充神經酰胺的方法。例如，在專利文獻1中記載了培養假絲酵母(Candida)屬的微生物來制造葡萄糖神經酰胺的方法，通過將該葡萄糖神經酰胺涂布在人體的干燥性皮膚上能夠改善皮膚的保濕功能。該方法是直接從培養后的菌體中獲取大量存在的葡萄糖神經酰胺，因此所合成的葡萄糖神經酰胺的神經酰胺骨架與人體中存在的神經酰胺類的神經酰胺骨架不同，其在兩處具有碳碳雙鍵且具有支鏈。因此，將這種從微生物中直接提取得到的葡萄糖神經酰胺涂布在人體皮膚上的話，有可能不能與人體皮膚相適應而產生使用安全性方面的問題。另外，專利文獻6中報道了從芽孢桿菌屬的醋酸菌中獲得醋酸菌型神經酰胺的方法。但這種方法所獲得的神經酰胺也存在上述的不能與人體皮膚相適應的問題。并且這樣的方法需要從菌體中進行提取來獲得神經酰胺等的操作，工序復雜且成本高。另外，從外部向皮膚補充神經酰胺的方法與以往使用的保濕劑等同樣有保濕效果的持續性不夠的問題，而且有些狀態的皮膚對從外界補給的神經酰胺等的吸收不充分，從而導致不能充分發揮保濕效果。而另一方面，如果能夠增強或促進皮膚本身的神經酰胺或葡萄糖神經酰胺的產生能力，則無需從外部補充神經酰胺或葡萄糖神經酰胺，而能夠通過促進皮膚自身產生神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺來提高皮膚的屏障功能和保濕功能。這樣，由于是由皮膚自身產生神經酰胺或葡萄糖神經酰胺，所合成的是皮膚所具有的常規結構的神經酰胺等，因而其不存在與皮膚的適應性不好等的安全性問題。因此最近關于在皮膚角質層中產生促進表皮神經酰胺等的生成的物質的研究相當熱門。其中，作為能夠促進神經酰胺生成的物質，已報道的有以靈芝、蜂花粉(Bee Pollen)、川芎等的提取物為有效成分的神經酰胺產生促進劑(專利文獻2 4)。然而，由于這些神經酰胺產生促進劑全都是從植物原料提取得到，其提取操作耗費時間長，且在天
3然資源的可利用性方面有限制，因而其制造成本高。另外，在專利文獻5中，公開了一種能夠活化皮膚表層內部的表皮細胞自身的神經酰胺合成的神經酰胺合成促進劑，其以含有煙酸和/或煙酰胺的菌培養物為有效成分， 該菌培養物可以是乳酸菌培養物、雙歧桿菌培養物、香菇菌體培養物或者酵母菌培養物。但是，該促進劑的制備過程中使用的培養基實質上以煙酸和/或煙酰胺作為有效成分，因此這種神經酰胺合成促進劑的制備成本較高。另外，明串珠菌屬(Leuconostoc)的微生物廣泛分布于植物、乳制品和其他食品中。腸膜明串珠菌是明串珠菌屬的重要菌種。研究證實，腸膜明串珠菌能發酵糖類產生多種酸和醇，具有高產酸能力、抗氧化能力和拮抗致病菌等能力。目前腸膜明串珠菌已被廣泛應用于風味劑、血漿代用品、微生態制劑等中。但是，目前還沒有利用明串珠菌屬的微生物來制備神經酰胺產生促進劑或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的報道。專利文獻1 日本特開2010-22217號公報專利文獻2 日本特開2005-194240號公報專利文獻3 日本特開2010-70499號公報專利文獻4 日本特開2010-150237號公報專利文獻5 日本特開平9-194383號公報專利文獻6 日本特開2006-345796號公報

發明內容
本發明就是為了解決上述現有技術中存在的技術問題而做出的，目的在于提供一種低成本且高效地制造神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的方法。本發明人為了解決上述技術問題進行了專心研究，結果發現在含有豆渣和糖類的培養基中培養明串珠菌屬(Leuconostoc)的微生物，能夠高效地獲得神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑；從而完成了本發明。本發明提供一種神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中，在含有豆渣和糖類的培養基中培養明串珠菌屬(Leuconostoc)的微生物，從其上清液中獲得神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。根據本發明的制造方法，能夠使用特定的微生物并利用豆渣這樣的容易獲得的物質作為培養基的主要原料，從而能夠廉價且高效地獲得神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑，該促進劑能夠有效提高皮膚所具有的產生神經酰胺/葡萄糖神經酰胺的能力，從而有效提高皮膚的保濕能力。
具體實施例方式本發明的制造方法是在含有豆渣和糖類的培養基中培養明串珠菌屬 (Leuconostoc)的微生物，并從其上清液中獲得神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。作為在本發明中使用的明串珠菌屬(Leuconostoc)的微生物，可以列舉出腸膜狀明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、冷明串珠菌(Leuconostoc gelidum)、肉明串珠菌(Leuconostoc carnosum)、欺詐明串珠菌 (Leuconostoc fallax)、嗜檸檬酸明串珠菌(Leuconostoc citreum)、阿根廷明串珠菌 (Leuconostoc argentinum)、禾口假腸膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)等。其中，從所獲得的產品具有更高的神經酰胺產生促進效果和/或葡萄糖神經酰胺產生促進效果的觀點考慮，優選腸膜狀明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) 0本發明所涉及的明串珠菌屬(Leuconostoc)的微生物都可以從中國普通微生物保藏管理中心(CGMCC)、中國典型培養物保藏中心(CCTCC)、江南大學工業微生物資源和信息中心(CICIM)等商業渠道購買得到。在本發明的制造方法中，可以單獨使用1種上述微生物，也可以組合2種以上的上述微生物進行使用。本發明中使用的培養基是含有豆渣和糖類的培養基。豆渣和糖類都是容易獲得的物質，因而，本發明的培養基具有成本低的優點。并且，除此之外，也可以適當添加例如的蛋白胨、0.5%的酵母粉等。其中，豆渣是指，將大豆浸泡在水中使其充分吸收水分后粉碎、再經過濾、除水、浙干而得到的物質。也可以使用食品產業中壓榨豆漿等的豆制品制造工序中殘留的大豆殘渣。糖類可以是葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等，它們可以任意單獨使用或混合使用。而從提高神經酰胺產生促進效果和葡萄糖神經酰胺產生促進效果的觀點考慮，其中優選葡萄糖。從提高神經酰胺產生促進效果和葡萄糖神經酰胺產生促進效果的觀點考慮，本發明的培養基優選由豆渣、葡萄糖和水構成，進一步優選培養基中豆渣的含量為5 20w/
、更優選8 12w/v%，葡萄糖的含量為0. 2 2w/v%、更優選0. 8 1. 2w/v%。從明串珠菌屬(Leuconostoc)微生物的生理特性、以及提高神經酰胺產生促進效果和葡萄糖神經酰胺產生促進效果的觀點考慮，優選在27 35°C下進行上述培養。從明串珠菌屬(Leuconostoc)微生物的生理特性、以及提高神經酰胺產生促進效果和葡萄糖神經酰胺產生促進效果的觀點考慮，上述培養時間優選為1 7天，更優選為 48 96小時，更優選為68 76小時。從得到更純的產品的觀點出發，優選將通過所述培養獲得的培養物進一步進行精制從而得到上清液。作為精制的方法，可以根據需要適當組合使用過濾、離心分離、離子交換或吸附色譜、溶劑提取、結晶化等的常用的操作來進行。優選通過離心分離獲得上清液， 該離心分離的速度優選為2000 4000rpm、更優選為2500 3500rpm，離心時間優選為O 20分鐘，更優選為5 15分鐘。可以在離心后獲得的上述上清液中加入乙醇，用來進行滅菌，并將加入了乙醇的上清液作為神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。也可以通過離心分離從培養液中除去菌體，再超聲波處理，離心分離，回收上清液。接著，再將回收后的上清液過濾除去雜質等，真空下干燥處理后作為本發明的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。通過培養本發明的明串珠菌屬(Leuconostoc)微生物并從培養上清液中得到的大豆殘渣發酵提取物，能夠起到在正常人體的角化細胞中使神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺的量增加的作用。
因此，通過培養本發明的明串珠菌屬(Leuconostoc)微生物而從培養上清液中得到的大豆殘渣發酵提取物，可以用于促進神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生的治療目的或非治療目的的使用，也可以作為治療目的或非治療目的的神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑使用。非治療目的的使用是以美容為目的的使用，或為維持健康狀態的使用等。并且，所述治療目的的使用和非治療目的的使用是可以完全區分地進行的。通過培養本發明的明串珠菌屬(Leuconostoc)微生物而從培養上清液中得到的大豆殘渣發酵提取物，也可以用于制造神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。本發明的神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑可以作為使角質層中的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺增加并恢復和提高皮膚的屏障功能和保濕功能的醫藥品、準醫藥品、化妝品等使用。另外，本發明的神經酰胺產生促進劑或葡萄糖神經酰胺產生促進劑也可以作為以神經酰胺產生促進或葡萄糖神經酰胺產生促進為概念的、并根據需要標明該概念的準醫藥品、化妝品使用。作為本發明的神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的使用形態，可以是用于向培養細胞中添加的添加劑，也可以是配合到皮膚洗凈劑、化妝品等皮膚外用劑中使用。例如，可以列舉化妝水、乳液、凝膠、霜、軟膏等各種形態。而作為外用劑的基劑，只要是公知的外用基劑即可，沒有特別限制。在配制各種皮膚外用劑時，可以單獨地使用本發明的神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑，或與在皮膚洗凈劑和化妝品等皮膚外用劑中通常配合的油性成分、保濕劑、粉體、色素、乳化劑、增溶劑、紫外線吸收劑、增稠劑、藥效成分、香料、防菌防霉劑、植物提取物、醇類等適當組合來使用。將本發明的神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑添加到培養的表皮細胞中來促進神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺的情況下，作為該促進劑的干燥物的添加量優選為0. 0001 10w/v%，更優選為0. 001 5w/v%。當添加量為0. 0001w/v%& 上時，能得到充分的促進效果；而當添加量為10w/V%以下時，對表皮細胞的刺激性更小。將本發明的神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑配合在皮膚外用劑使用時，從有效促進神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺的產生、從而有效提高皮膚的保濕能力、而且不易顯示出培養物的顏色和氣味的觀點出發，其配合量優選為皮膚外用劑總量的0. 01 20w/v%，更優選為0. 1 10w/v%。實施例下面，基于實施例對本發明進行更詳細的說明，但本發明并不限定于此。實施例1<神經酰胺/葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制備>首先，按照以下方法制備培養基將大豆放入水中浸泡12小時，使大豆充分吸收水分，然后將吸收了水分的大豆研磨破碎，將其過濾并除去液體成分，剩余殘渣浙干，得到豆渣。將該豆渣與葡萄糖以及水相混合，并使豆渣和葡萄糖在混合物中的濃度分別達到 1(^八％和，將該混合物作為培養基。然后，將IOOml的上述培養基加至三角燒瓶中，接種一定量的腸膜狀明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)(保藏于江南大學工業微生物資源和信息中心CICIM，編號 CICIM B1254)，在 30°C下培養 3 天。
然后將所得到的培養物離心分離(3000rpm，10分鐘)。剩余上清液加入2. 5倍的無水乙醇稀釋，取Iml混合液作為本發明的神經酰胺/葡萄糖神經酰胺產生促進劑的樣品 A，存于4°C冰箱中以備用作細胞培養用添加物。對上述無水乙醇稀釋后的混合液進行超聲處理10分鐘，離心(3000rpm) 10分鐘， 收集上清液(約70ml)，上清液以濾紙過濾得濾液，濾液于真空干燥機中干燥至恒重，將此干燥品作為本發明的神經酰胺/葡萄糖神經酰胺產生促進劑的樣品B、C，將樣品B、C分別以50%乙醇溶解而配制成1%、0. 濃度的溶液，存于4°C冰箱中作為細胞培養用添加物。<神經酰胺/葡萄糖神經酰胺產生促進劑的評價>(細胞培養)首先，取正常人的活化角質化細胞(Cascade Co.，Ltd)作為原代細胞，于75cm2培養瓶中(含有生長因子的培養基anl)，370C XO2濃度為5%的條件下培養細胞至80 90% 濃度。進行傳代，傳代細胞至175cm2方瓶中繼續培養細胞至80 90%濃度。然后將傳代后的人體表皮細胞接種到12孔板中，每孔容積為anl，細胞濃度為1 X IO5個細胞/ml，繼續培養細胞至80 90%濃度。然后，在上述12孔板中更換不含有生長因子的培養基，將樣品A、B、C和對照品 (濃度為50v/v%的乙醇水溶液)分別加入上述12孔板中(η = 2)，相同培養條件下培養3天。3天培養后，棄去上清培養液，以aiil PBS (磷酸鹽緩沖液)對細胞進行2次清洗， 再加入Iml的PBS至板孔中，以細胞收集器(細胞鏟)收集細胞至試管中，以備后續神經酰胺和蛋白質分析。(神經酰胺產生促進效果的確認)在回收得到的含有細胞的PBS溶液中加入甲醇氯仿=2. 5ml 1. 25ml的溶劑， 進行振動20分鐘，進行離心(3000rpm，5分鐘)分離，從而得到上清液a和沉淀b。將上清液a用于神經酰胺量的分析，將沉淀b用于蛋白質含量的分析。(1)神經酰胺量的分析在由此得到的上清液a中加入PBS 氯仿=1. 25ml 1. 25ml的溶劑，進行振動 20分鐘，進行離心(3000rpm，5分鐘)分離，得到上下兩相。回收下相，并在30°C、氮氣保護下進行干燥40分鐘。在得到的干燥品中加入100 μ 1的氯仿甲醇=^iil Iml的溶劑進行溶解，并用下述薄板層析(TLC)法對其進行神經酰胺的量的解析。將神經酰胺標準品與樣品溶液點至干燥TLC板上，以 CHCl3 CH30H CH3C00H(190 :9:1 ν/ν/ν)為展層劑進行薄板層析， 待展層劑行至薄板頂端，以吹風機吹干展層劑；重復以上步驟一次。然后以 CHCl3 CH30H C3H60(76 20 4 ν/ν/ν)為展層劑進行薄板層析，待展層劑行至距薄板底端2. 5cm處，停止展層，以吹風機吹干。噴以硫酸銅磷酸溶液，吹干，將層析板放置于 180°C烘烤板上烘烤7分鐘顯色。掃描顯色TLC板并進行神經酰胺量(記為Cer，單位為 μ g/ml)的分析。(2)蛋白質含量的分析為了表征細胞中的神經酰胺/葡萄糖神經酰胺量，進行蛋白質含量分析。在上述沉淀b中加入90 μ 1的SDS (十二烷基磺酸鈉)溶液并進行混合，在60°C下加熱2小時使蛋白質變性降解，冷卻后在其中添加100 μ 1的2N的HCl溶液，按照BCA Kit (蛋白質定量分析試劑盒)法測定其中蛋白質的量(記為ftx)，單位為yg/ml)。(3)分析結果對于本發明品和對照品的樣品，分別測定Cer/ftx)(見下式)。以對照品的Cer/ Pro為1，在表1中表示本發明品的Cer/ftx)的相對值。另外，以對照品每孔中的蛋白質的量為100，求出本發明品的每孔中的蛋白質的量的相對值(ftx). (%))，并據此求出每孔的神經酰胺的量(相對于對照品的相對量)，即，Cer/Well =Cer/Pr0Xftx). (% ) 0 一并表示在表1中。如果Cer/ftx)(或Cer/Well)大于1 (對照品的值)，則表明該樣品具有神經酰胺產生促進效果。如表1所示，確認了實施例1的樣品A、B、C具有神經酰胺產生促進效果。實施例2在實施例1的神經酰胺/葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制備過程中，作為明串珠菌屬(Leuconostoc)的微生物，使用腸膜狀明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)(保藏于江南大學工業微生物資源和信息中心CICIM，編號CICIM B1364)，除此以外，與實施例1 同樣進行培養。然后將所得到的培養物離心分離(3000rpm，10分鐘)。剩余上清液加入2. 5倍的無水乙醇稀釋，取Iml混合液作為本發明的神經酰胺/葡萄糖神經酰胺產生促進劑的樣品 D，存于4°C冰箱中以備用作細胞培養用添加物。對上述無水乙醇稀釋后的混合液進行超聲處理10分鐘，離心(3000rpm) 10分鐘， 收集上清液(約70ml)，上清液以濾紙過濾得濾液，濾液于真空干燥機中干燥至恒重，將此干燥品作為本發明的神經酰胺/葡萄糖神經酰胺產生促進劑的樣品E、F，將樣品E、F分別以50%乙醇溶解而配制成1%、0. 濃度的溶液，存于4°C冰箱中作為細胞培養用添加物。按照與實施例1同樣的方法評價樣品D、E、F的神經酰胺產生促進效果，結果一并表示在表1中。如表1所示，確認了實施例2的樣品D、E、F具有神經酰胺產生促進效果。表 權利要求
1.一種神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中，在含有豆渣和糖類的培養基中培養明串珠菌屬(Leuconostoc)的微生物，從其上清液中獲得神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。
2.如權利要求1所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 所述明串珠菌屬(Leuconostoc)的微生物是腸膜狀明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。
3.如權利要求1所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 所述糖類是葡萄糖。
4.如權利要求3所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 所述培養基由豆渣、葡萄糖和水構成。
5.如權利要求4所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 所述培養基中所述豆渣的含量為8 12W/v%，所述糖類的含量為0. 8 1. 2W/v%。
6.如權利要求1所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 在27 35 °C下進行所述培養。
7.如權利要求1所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 所述培養時間為1 7天。
8.如權利要求1所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 將通過所述培養獲得的培養物進行離心，從而得到所述上清液。
9.如權利要求8所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中， 在離心后獲得的所述上清液中加入乙醇后，將其作為神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。
10.如權利要求9所述的神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法， 其中，進一步對所述加入了乙醇后得到的物質通過超聲波處理、離心分離、過濾、真空干燥處理進行精制后，得到神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。
11.豆渣的發酵提取物用于促進神經酰胺和/或葡萄糖神經酰胺的產生的非治療目的的用途，所述豆渣的發酵提取物是在含有豆渣的培養基中培養明串珠菌屬(Leuconostoc)的微生物得到的。
12.豆渣的發酵提取物作為神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的非治療目的的用途，所述豆渣的發酵提取物是在含有豆渣的培養基中培養明串珠菌屬(Leuconostoc)的微生物得到的。
13.豆渣的發酵提取物在制造神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑中的用途，所述豆渣的發酵提取物是在含有豆渣的培養基中培養明串珠菌屬(Leuconostoc)的微生物得到的。
14.如權利要求11 13的任一項所述的用途，其中，所述明串珠菌屬(Leuconostoc)的微生物是腸膜狀明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。
全文摘要
本發明提供一種神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑的制造方法，其中，在含有豆渣和糖類的培養基中培養明串珠菌屬(Leuconstoc)的微生物，從其上清液中獲得神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。根據本發明的制造方法，能夠利用容易獲得的物質作為培養基并利用特定的微生物，來廉價而高效地獲得神經酰胺產生促進劑和/或葡萄糖神經酰胺產生促進劑。
文檔編號A61Q19/00GK102559767SQ20101062475
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者孔凡旗 申請人:花王株式會社