專利名稱：人胎盤干細胞提取物凍干粉及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種凍干粉，特別涉及一種人胎盤干細胞提取物凍干粉及其制備方法
與應用。
背景技術：
人胎盤干細胞提取物，是人胎盤干細胞經過特殊培養后分泌出的多種生命活性物質，包括蛋白質、多肽、細胞生長因子和生物活性因子等多種成分，經過特殊的分離提取工藝和加工手段，將其中的多種有效活性成分濃縮制成的凍干粉狀物。人胎盤干細胞提取物中的多種生命活性成分具有復雜的生理作用，每種成分都可以對許多組織器官產生影響， 同時每種形式生理機能的提高也不是單一因子的作用，而是需要多種因子的相互協調作用，因此人胎盤干細胞提取物比單一的細胞因子具有更好的抗衰老、活化機體功能的功效。 長期使用胎盤干細胞提取物具有美容、抗衰老、活化機體機能、細胞新生、紫外損傷修復及提高肌膚免疫力等功效。

發明內容
為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種人胎盤干細胞提取物凍干粉的制備方法。本發明的另一目的在于提供通過上述制備方法得到的人胎盤干細胞提取物凍干粉。本發明的再一目的在于提供所述的人胎盤干細胞提取物凍干粉的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種人胎盤干細胞提取物凍干粉的制備方法，包含以下步驟(I)使用pH值7. O 7. 4、含血清的細胞培養基培養人胎盤間充質干細胞至70 90%融合時，棄其原含血清培養液，使用平衡鹽溶液洗滌細胞；(2)去除平衡鹽溶液，使用細胞培養基繼續培養人胎盤間充質干細胞，培養至細胞培養基變色，收集上清；(3)過濾上清，濃縮上清；再將得到的濃縮上清除菌，得到人胎盤干細胞提取物原溶液；(4)在人胎盤干細胞提取物原溶液加入凍干賦形劑和水，過濾除菌，分裝凍干，得到人胎盤干細胞提取物凍干粉；所述的細胞培養基優選為DMEM/F12培養基；步驟⑴中所述的血清優選為胎牛血清；所述的胎牛血清在所述的細胞培養基中的終濃度優選為體積百分比10% ；步驟(I)中所述的pH值7. O 7. 4、含血清的細胞培養基優選還含有抗細菌抗生素；所述的抗細菌抗生素優選為青霉素或鏈霉素中的一種或兩種；
所述的青霉素在所述的細胞培養基中的終濃度優選為200U/ml ；所述的鏈霉素在所述的細胞培養基中的終濃度優選為200U/ml ；步驟⑴中所述的人胎盤間充質干細胞優選為傳代次數為第7 8代的人胎盤間充質干細胞；
步驟(I)中所述的平衡鹽溶液優選為Hank’ s液；
步驟(3)中所述的過濾優選為使用孔徑為O. 45 μ m的濾膜過濾；
步驟(3)中所述的濃縮優選為采用截留分子量為3KD的過濾膜進行超濾濃縮； 步驟(3)中所述的濃縮程度優選為濃縮至原體積(即步驟(2)得到的上清)的 ,10 ；
步驟(3)中所述的除菌優選為使用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過濾除菌；
步驟(4)中所述的凍干賦形劑優選為甘露醇、葡萄糖、海藻糖、蔗糖或乳糖中的至
步驟(4)中所述的凍干賦形劑的用量優選為相當于所述的人胎盤干細胞提取物
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少一種
原溶液的最終重量的5 10% ;步驟(4)中所述的水優選為去離子水或超純水；步驟(4)中所述的過濾除菌優選為使用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過濾除菌；步驟⑷所述的凍干的條件優選為于-20 -35°C、50 200Pa凍干24 36小時；一種人胎盤干細胞提取物凍干粉，通過上述制備方法制備得到；所述的人胎盤干細胞提取物凍干粉在化妝品和/或保健品中的應用。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果(I)本發明所提供的人胎盤干細胞凍干粉含有多種生命活性物質，對機體細胞分裂與增殖有極高的激發作用，對老化的機體有全面調節、恢復年輕之功效。它能大幅度提高機體代謝水平，增強生理機能，提高機體免疫力，延長青春期，美化肌膚，增長壽命，延緩衰老。(2)取材方便，原料來源充足。胎盤的采集簡便易行，不會引起母親和新生兒任何不適的感覺或產生任何不良的影響。過去胎盤通常作為廢物丟棄，現在通過一定的科技手段從胎盤中提取胎盤間充質干細胞并經特殊傳代培養，再通過一定的科技手段提取人胎盤干細胞凍干粉不僅技術可行，更是寶貴的生命資源再利用。(3)安全性。試驗結果顯示，人胎盤干細胞凍干粉性質穩定、功效顯著，不易突變， 動物實驗證明無毒無致瘤性、致畸性，使用安全可靠。(4)數量充足，使用方便。人胎盤間充質干細胞增殖能力強，培養后數目可達10億以上，由此提取的人胎盤干細胞提取物數量充足，可以供多人多次使用。經特殊工藝制成的胎盤干細胞提取物凍干粉儲存期長，不易降解，使用方便。


圖I是人胎盤間充質干細胞的流式細胞儀檢測圖。圖2是人胎盤間充質干細胞的流式細胞儀檢測圖。圖3是人胎盤干細胞提取物SDS-PAGE結果圖，其中
泳道I為Marker ;泳道2為胎盤干細胞提取物。圖4是人胎盤干細胞提取物對HDF細胞存活率的影響圖。圖5是人胎盤干細胞提取物對HDF細胞形態的影響圖。圖6是不同處理方式小鼠皮膚組織中羥脯氨酸含量/正常對照組小鼠皮膚組織中羥脯氨酸含量對比結果圖，其中**表示P彡O. 01，*表示P彡O. 05 ;1-陰性對照；2_模型組；3_人胎盤干細胞提取物高劑量組(lOOyg/ml) ;4-胎盤干細胞提取物低劑量組(lyg/ml) ;5_VitC高劑量組 (100 μ g/ml) ；6-VitC 低劑量組(I μ g/ml)。圖7是不同處理方式小鼠皮膚組織中I型膠原纖維含量/正常對照組小鼠皮膚組織中I型膠原纖維含量對比結果圖，其中**表示P彡O. 01，*表示P彡O. 05 ;1-陰性對照；2_模型組；3_人胎盤干細胞提取物高劑量組(100 μ g/ml) ;4-胎盤干細胞提取物低劑量組(I μ g/ml) ;5_VitC高劑量組 (100 μ g/ml) ；6-VitC 低劑量組(I μ g/ml)。圖8是不同處理方式小鼠全血中總抗氧化能力/正常對照組小鼠全血中總抗氧化能力對比結果圖，其中**表示P彡O. 01，*表示P彡O. 05 ;1-陰性對照；2_模型組；3_人胎盤干細胞提取物高劑量組(100 μ g/ml) ;4-胎盤干細胞提取物低劑量組(I μ g/ml) ;5_VitC高劑量組 (100 μ g/ml) ；6-VitC 低劑量組(I μ g/ml)。圖9是不同處理方式小鼠血漿中T-SOD酶活性/正常對照組小鼠血漿中T-SOD酶活性對比結果圖，其中**表示P彡O. 01，*表示P彡O. 05 ;1-陰性對照；2_模型組；3_人胎盤干細胞提取物高劑量組(100 μ g/ml) ;4-胎盤干細胞提取物低劑量組(I μ g/ml) ;5_VitC高劑量組 (100 μ g/ml) ；6-VitC 低劑量組(I μ /ml)。
具體實施例方式下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例I(一)人胎盤間充質干細胞(humanplacenta-derived mesenchymal stem cells, hPMSCs)的原代分離、培養、傳代及鑒定(I)人胎盤間充質干細胞的原代分離、培養，傳代從廣東省廣州市三甲醫院婦產科手術臺獲得足月、剖宮產、健康母體胎盤，經檢驗檢疫合格后(證實無HIV、HBV等傳染性疾病)，在無菌條件下剝除母體蛻膜，剪取小塊胚胎蛻膜側胎盤組織，放入含抗生素的D-Hank' s液(青霉素200U/ml，鏈霉素200U/ml，pH7. 2) 中,洗盡血液,剔除血管,并剪成I. O 2. 0mm3小塊，將組織塊按適當密度接種于培養皿，加入含有體積分數15% FBS的DMEM/F12培養液(青霉素200U/ml，鏈霉素200U/ml，pH7. 2)， 放置于37°C、體積分數5%的CO2飽和濕度培養箱內培養，每3d補加新鮮培養液。當顯微鏡下觀察到組織塊周圍有呈集落生長的成纖維狀細胞時，去除組織塊，添加培養液繼續培養。約20d后細胞生長達約80 %融合時，用含質量百分比O. 25 %的胰蛋白酶和質量百分比O.02% EDTA的消化液消化，按I X IO4ceIVcm2傳代培養，培養液換為體積分數10% FBS的 DMEM/F12培養基(青霉素200U/ml，鏈霉素200U/ml，pH7. 2)，細胞代數記為Pl代，待細胞達到80 90%融合后，消化，按I X IO4ceIVcm2傳代培養，細胞代數記為P2代，以后均按照以上方法傳代培養，通過不斷傳代檢測其增殖能力。(2)人胎盤間充質干細胞的鑒定收集P3代細胞，通過流式細胞儀鑒定細胞表面抗原，檢測得到細胞能夠表達 ⑶29、⑶44、⑶59等干細胞特征性表面抗原(圖I)，未表達⑶28、⑶31、⑶34、⑶45等細胞表面抗原(圖2)，這與文獻報告的間充質干細胞特征一致，說明所分離培養細胞為人胎盤間充質干細胞。( 二)人胎盤干細胞提取物凍干粉的制備流程(I)人胎盤間充質干細胞培養無血清上清的收集鑒定正確無誤的人胎盤間充質干細胞用T-75培養瓶傳代擴增，直至第7 8代 (P7 P8)，培養液為含10% (v/v)FBS (胎牛血清)的DMEM/F12培養基(青霉素200U/ml、 鏈霉素200U/ml，pH7. 2)。每代當細胞增殖至約80%左右融合時，棄其原含血清培養液， Hank’ s液洗2遍，每次5ml。盡量將洗滌的Hank’ s液用吸管吸盡，然后添加無血清、無抗生素的DMEM/F12，培養72h后收集其上清，4°C保存。使用胰酶消化液(0.25% (w/w)胰蛋白酶+0.02% (w/w)EDTA)消化細胞，按I : 2比例傳代。當細胞增殖至約80%左右融合時， 繼續無血清條件培養收集其上清并傳代，直至細胞因無血清培養而增殖明顯放慢且形態出現明顯變化時，停止其無血清培養。各個批次傳代細胞的無血清上清分批收集完畢后，置于-20°C保存，待處理。(2)人胎盤干細胞提取物溶液的制備將多次收集的人胎盤間充質干細胞無血清上清(約1000ml)從_20°C取出，置于室溫解凍。O. 45 μ m濾器過濾人胎盤間充質干細胞無血清上清。然后采用截留分子量為3KD 的過濾膜進行人胎盤間充質干細胞無血清上清的濃縮，直至剩余回流液體積約為100 200ml為止。最后將回流液用無菌的O. 22 μ m濾膜過濾除菌后，即為所得的人胎盤干細胞提取物原溶液。(三)人胎盤干細胞提取物凍干粉的制備測胎盤干細胞提取物蛋白原液濃度，根據測得的人胎盤干細胞提取物蛋白原液濃度，按需凍干溶液的最終重量計加入5 10%凍干賦形劑甘露醇和50 60°C的去離子水混勻并調節蛋白質濃度至終濃度為50.0±0.5118/1111，過濾除菌，按11111量/支分裝凍干(凍干溫度為-20 -35°C，真空度為50 200Pa，凍干時間為24 36小時)，即制得人胎盤干細胞提取物凍干粉。最終得到的人胎盤干細胞提取物凍干粉蛋白的含量為 50.0±0.5yg/支。(四)人胎盤干細胞提取物凍干粉質量標準⑴外觀肉眼觀察人胎盤干細胞提取物凍干粉產品為白色、粉末狀。按標示量用Iml去離子水溶解后為澄清、透明的淡紅色溶液。⑵pH值的測定采用精密pH測試儀檢測樣品的pH值。首先對pH測試儀進行校正，再對人胎盤干細胞提取物凍干粉水溶液進行檢測。人胎盤干細胞提取物水溶液的產品PH值在6. 5 7. 5 之間。(3)蛋白質電泳分析人胎盤干細胞提取物配制12% Tricine-SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠。然后取按標示量配制好的人胎盤干細胞提取物凍干粉水溶液20 μ I加入2 X上樣緩沖液，80°C加熱40min。加入處理好的樣品，每孔20μ l，8mA電流穩流進行電泳約6h，得出的結果如圖3所示，人胎盤干細胞提取物的分子量大約為40KD。(4)人胎盤干細胞提取物凍干粉蛋白質含量為50. O ±O. 5 μ g/支。蛋白含量測定方法①標準BSA蛋白溶液取牛血清白蛋白(BSA)標準品，準確稀釋至lmg/mL(含質量百分比O. 02%置氣納)，為標準蛋白質備液。使用時取標準蛋白質貯備液，準確稀釋至O. 25g/L，為標準蛋白質工作液(工作液室溫24小時內穩定)，即用現配。②取6支管作為標準管繪制標準曲線(concentration/OD值)，按表加入
權利要求
1.一種人胎盤干細胞提取物凍干粉的制備方法，其特征在于包含以下步驟(1)使用pH值7.O 7. 4、含血清的細胞培養基培養人胎盤間充質干細胞至70 90% 融合時，棄其原含血清培養液，使用平衡鹽溶液洗滌細胞；(2)去除平衡鹽溶液，使用細胞培養基繼續培養人胎盤間充質干細胞，培養至細胞培養基變色，收集上清；(3)過濾上清，濃縮上清；再將得到的濃縮上清除菌，得到人胎盤干細胞提取物原溶液；(4)在人胎盤干細胞提取物原溶液加入凍干賦形劑和水，過濾除菌，分裝凍干，得到人胎盤干細胞提取物凍干粉。
2.根據權利要求I所述的人胎盤干細胞提取物凍干粉的制備方法，其特征在于所述的細胞培養基為DMEM/F12培養基。
3.根據權利要求I所述的人胎盤干細胞提取物凍干粉的制備方法，其特征在于步驟 (I)中所述的血清為胎牛血清；步驟(I)中所述的pH值7. O 7. 4、含血清的細胞培養基含有抗細菌抗生素。
4.根據權利要求3所述的人胎盤干細胞提取物凍干粉的制備方法，其特征在于所述的胎牛血清在所述的細胞培養基中的終濃度為體積百分比10% ；所述的抗細菌抗生素為青霉素或鏈霉素中的一種或兩種。
5.根據權利要求4所述的人胎盤干細胞提取物凍干粉的制備方法，其特征在于所述的青霉素在所述的細胞培養基中的終濃度為200U/ml ；所述的鏈霉素在所述的細胞培養基中的終濃度為200U/ml。
6.根據權利要求I所述的人胎盤干細胞提取物凍干粉的制備方法，其特征在于步驟(I)中所述的人胎盤間充質干細胞為傳代次數為第7 8代的人胎盤間充質干細胞；步驟(I)中所述的平衡鹽溶液為Hank’ s液。
7.根據權利要求I所述的人胎盤干細胞提取物凍干粉的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的過濾為使用孔徑為O.45 μ m的濾膜過濾；步驟(3)中所述的濃縮為采用截留分子量為3KD的過濾膜進行超濾濃縮；步驟(3)中所述的濃縮程度優選為濃縮至即步驟(2)得到的上清體積的1/5 1/10 ； 步驟(3)中所述的除菌為使用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過濾除菌。
8.根據權利要求I所述的人胎盤干細胞提取物凍干粉的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述的凍干賦形劑為甘露醇、葡萄糖、海藻糖、蔗糖或乳糖中的至少一種；步驟(4)中所述的凍干賦形劑的用量為相當于所述的人胎盤干細胞提取物原溶液重量的5 10% ;步驟(4)中所述的水為去離子水或超純水；步驟(4)中所述的過濾除菌為使用孔徑為O. 22 μ m的濾膜過濾除菌；步驟(4)所述的凍干的條件為于-20 -35°C、50 200Pa凍干24 36小時。
9.一種人胎盤干細胞提取物凍干粉，通過權利要求I 8任一項所述的制備方法得到。
10.權利要求9所述的人胎盤干細胞提取物凍干粉在化妝品和/或保健品中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種人胎盤干細胞提取物凍干粉及其制備方法與應用。本發明通過培養人胎盤間充質干細胞，得到其上清，濃縮、凍干，得到人胎盤干細胞提取物凍干粉。該人胎盤干細胞提取物凍干粉性質穩定、功效顯著，不易突變，動物實驗證明無毒無致瘤性、致畸性，使用安全可靠；而且人胎盤間充質干細胞增殖能力強，培養后數目可達10億以上，由此提取的人胎盤干細胞提取物數量充足，經特殊工藝制成的人胎盤干細胞提取物凍干粉儲存期長，不易降解，使用方便。該人胎盤干細胞凍干粉經檢測，能有效在化妝品、保健品等中進行應用。
文檔編號A61Q19/08GK102600057SQ201210072079
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月16日 優先權日2012年3月16日
發明者任哲, 舒輝萍, 趙振嶺, 陳海佳 申請人:廣州賽萊拉生物科技有限公司