專利名稱：一種從石榴皮提取石榴皮多酚的方法
技術領域：
本發明屬于植物提取領域，具體涉及ー種從石榴皮提取石榴皮多酚的方法。
背景技術：
石槽皮(Pomegranate Peel)是石槽干燥后的果皮,它性酸、味道發潘，具有止血、澀腸、殺蟲的效用，是臨床常用中藥。石榴皮多酚是ー類具有多酚羥基化合物的總稱，包括沒食子單寧、鞣花單寧、鞣花酸、綠原酸、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、花色素、阿魏酸和櫟精等多種化合物，主要存在于石榴皮中，含量約為其干重的10 20%。
0003]近年來，大量研究表明，石榴皮多酚具有抗自由基、抗誘變、抗老化、抑菌、預防心血管疾病、改善婦女更年期綜合癥等多種功能，在醫藥、日用品以及食品等領域都有廣泛的作用。近年來，對石榴皮多酚進行研究并申請專利的有王超萍等(專利申請號CN201010613907)公開了ー種從石榴皮中提取石榴皮堿的方法，將酶合超聲破壁處理與醇合超聲浸提有效結合，從石榴皮中提取石榴皮堿。郭長江等(專利申請號CN200810153555)公開了ー種新鮮石榴皮抗氧化物的提取方法，將新鮮石榴皮浸泡在混合溶劑中，浸泡提取
0.I 2小時，減壓濃縮干燥，得到石榴皮抗氧化物。其體外對超氧陰離子、羥自由基、脂質自由基的清除能力和對低密度脂蛋白氧化的保護作用均強于石榴果肉提取物。陽明福等(專利申請號CN 200810306391)公開了ー種同時從石榴皮提取安石榴苷和鞣花酸的方法。石榴皮先以25 35%こ醇提取，提取液濃縮后以大孔樹脂進行吸附，解吸附后濃縮洗脫液即得安石榴苷提取物；再將提取了安石榴苷的石榴皮以70 90%こ醇滲漉提取，提取液濃縮除醇后加入NaOH進行水解，水解后加入HC1，產生沉淀，分離，所得沉淀即為鞣花酸提取物。上述制備方法多以有機溶劑作為提取介質，尚未見以水為提取介質的相關報道。

發明內容
本發明所解決的技術問題是提供ー種全新的從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，該方法具有操作簡便、提取效率高的優點。本發明從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在干以水為溶劑，采用微波提取得到石榴皮多酚粗提物，然后經過大孔樹脂分離，減壓濃縮、真空凍干后得到石榴皮多酚。其中，所得石榴皮多酚粗提物中總多酚含量30-55% ;所得石榴皮多酚中總多酚含量為65-80%。具體的，本發明從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，包括如下步驟A、粉碎石榴皮；優選的，石榴皮粉碎至>40目，進ー步優選粉碎至80-100目；B、提取溶劑為水，采用微波提取，干燥提取液，得石榴皮多酚粗提物；其中，微波提取條件為微波功率200-800W，溫度60-95°C、液料比15:1_40:1，提取時間60-180S ;優選微波提取條件為 溫度75°C、液料比30:1，提取時間140S ；
C、純化石榴皮多酚粗提物加水配制成4-12mg/mL的溶液，過D101、D140或AB-8大孔樹脂，速度為0. 5-5. 5BV/h ;采用用量大于5BV的水清洗；采用用量為1_6. 5BV、濃度大于60%v/v/的こ醇洗脫；收集洗脫液，干燥，得石榴皮多酚；進ー步的，優選純化條件為石榴皮多酚粗提物加水配制成10mg/mL的溶液；大孔樹脂樹脂采用DlOl大孔樹脂；石榴皮多酚粗提物加水配制的溶液過大孔樹脂的速度為2BV/h ;采用用量5BV的水清洗；采用濃度大于70%v/v/的こ醇，用量為5. 5BV洗脫。綜上，本發明提取方法以水為溶劑，利用微波從石榴皮中可有效提取石榴皮多酚，所得石榴皮多酚粗提物與石榴皮多酚中總多酚含量較高，粗提物收率達40-50%，為獲得石榴皮多酚提供了一種新的選擇。


圖I各溶劑總多酚提取率
圖2石榴皮多酚濃度選擇圖3純化洗脫劑濃度選擇圖4多酚的動態吸附圖5洗脫液用量的選擇
具體實施例方式以下通過對本發明具體實施方式
的描述說明但不限制本發明。本發明從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于以水為溶剤，采用微波提取得到石榴皮多酚粗提物，然后經過大孔樹脂分離，減壓濃縮、真空凍干后得到石榴皮多酚。一、提取步驟的選擇I、發明人曾嘗試用現有水煎煮提取法石榴皮用水煎煮提取，100°C、料液比為1:30、提取15min，提取2次，提取液比較粘稠，而且難以進行抽濾，提取液中可溶性蛋白質、果膠及可溶性糖類含量較多，總多酚含量為13. 18g/100g。該水提物對DPPH -,-OH, -O2^的半清除濃度和抑制脂質過氧化物半抑制濃度分別為28. 46mg/L、79. 31mg/L、375. 69mg/L、60. 56mg/L。采用直接水提的方式，鑒于其雜質含量高，其抗氧化能力也相對較低。2、其后，發明人還嘗試了以下三種提取方法。超聲波輔助提取40%的こ醇溶液、I 30的料液比、60°C提取30分鐘、提取3次、36kHz的超聲工作頻率，濃縮、冷凍干燥，總多酚提取率為25. 86g/100g。熱回流法こ醇濃度為70%、提取溫度為89°C、料液比為I :26，提取2. 5h、提取2此，濃縮、冷凍干燥，總多酚提取率為21. 46g/100g。微波輔助提取法提取溫度為75V，提取時間為140S，料液比為I :30，以水為提取溶劑，提取2次，濃縮、冷凍干燥，總多酚提取率為22. 06g/100g。由此可見微波輔助提取法，以水為提取溶劑，沒有毒害，成本低，節約時間，而且提取率與常用的超聲波輔助提取和熱回流法相當。3、提取溶劑的篩選取石榴皮10g、80_100目、溫度70°C、料液比為1:30、微波輔助提取時間21^11，分別用甲醇、こ醇、水為溶劑進行浸提，結果見圖I。其中，甲醇的提取率為20. 32%、こ醇的提取率為19. 22%、水的提取率為19. 39%，提取率都比較接近，從經濟和安全的角度考慮，所以實驗選擇水為溶剤。經過上述3項的考察，最終確定本發明提取步驟為微波輔助提取法以水為溶剤，采用微波提取，干燥提取液，得石榴皮多酚粗提物；微波提取條件為微波功率200-800W，溫度60-95°C、液料比15:1-40:1，提取時間60-180S。優選微波提取條件為溫度75°C、液料比30:1，提取時間140S。
ニ、純化步驟的選擇I、大孔樹脂的選擇石榴皮采用提取步驟優化得到的微波輔助提取法獲得石榴皮多酚粗提物，然后加水配制成9mg/mL的溶液，采用表I中各類型大孔樹脂吸附后。然后測定上清液的多酚濃度Pe (mg/mL),接著濾去三角瓶中溶液,蒸懼水洗漆兩次，然后加入無水こ醇相同條件處理3小時，測其解吸液的多酚濃度Pd(mg/mL)。分別按如下公式計算吸附率、吸附量、解吸率、回收率以及解吸物的多酚質量分數。吸附量(mg/g干樹脂)=(Po-Pe) X Vo/m吸附率(％)=(Po-Pe) X 100/Po解吸率(％)=Pd*100/ (Po-Pe)回收率(％)=Pd*100/Po解吸物多酚質量分數(％) =Pd*VdX 100/Md以上各式中Po為石榴皮提取物中多酚的質量濃度(mg/mL)，Vo為石榴皮提取物溶液體積(mL)，Vd為解吸液體積(mL)，M為樹脂質量(g)，Md為解吸液中固形物的質量(mg)。結果各大孔樹脂對石榴皮多酚的靜態飽和吸附與解吸參數見表1，結果顯示DlOU D140或AB-8吸附率最大和解吸率相對較高，可作為本發明純化步驟所用的大孔樹月旨。而優選采用DlOl樹脂。表I各大孔樹脂對石榴皮多酚的靜態飽和吸附與解吸參數
H樹脂吸附率/% 樹脂解吸率/%靜態吸附能力/mg-ぎ1
DlO 丨73.1381.3381.14
D14071.4376.3979.25
AB-871.6178.1179.45
1)]6069.1772.0676.74
HPD72263.2682.1670.192、石榴皮多酚濃度選擇考察石榴皮多酚濃度的不同對其樹脂吸附作用的影響，實驗結果見圖2。從圖2可知，隨石榴皮多酚濃度不斷地加大，樹脂的吸附有下降的趨勢，4-10mg/mL的差異不大,而大于10mg/mL有較大差異,鑒于節約用時的考慮,這里選擇10mg/mL的濃度為上柱濃度。3、洗脫劑こ醇的濃度選擇考察こ醇洗脫劑不同濃度對樹脂對石榴皮多酚吸附的影響，實驗結果圖3。
從圖3可知，解脫劑的濃度變化對DlOl樹脂吸附石榴皮多酚的影響較大，隨解析劑的濃度加大，解吸率也有上升的趨勢，當こ醇解吸劑濃度達到70%v/v以后，解析率趨于平穩，故可選擇濃度大于60%v/v即可，而從經濟的角度考慮選擇70%v/v的濃度比較適宜。4、大孔樹脂對石榴皮多酚的動態吸附與解吸實驗I)大孔樹脂對多酚動態吸附性能通過不同階段流出液的測定，得出樹脂的動態吸附曲線，實驗結果圖4。由圖4可知，隨進柱量的増大，流出液的多酚含量也在増大，這表明進柱量越大，而樹脂的吸附效果越差，這是由于樹脂的吸附接近平衡的緣故。在此種條件下，進柱量大于4BV時，流出液中多酚含量停止加大，這是證明樹脂的吸附已經達到平衡。2)樹脂清洗用水量實驗結果 石榴皮提取物中有一定的多糖存在，可以采取大孔樹脂對它和石榴皮多酚的吸附差異來將兩者分開，將石榴皮提取物溶液按一定的條件進柱后，等樹脂充分吸附，用水清洗樹脂，將多余的多糖除去，多糖反應與多酚丟失率見表2。表2多糖反應試驗
清洗水量/B V多酚丟失率/%多糖反應情況
10.76+
22.34+3296+
43.21+
53.67-
63.86-注+為多糖的陽性反應；_為多糖的陰性反應由表2可以得知，當洗脫水大于5BV吋，多糖呈陰性反應，這樣表明除去了大量的雜質，但隨洗脫水量的加大，其中多酚的流失率也不斷在増大，所以綜合考慮，最終決定選擇用5BV的清洗水用量。3)こ醇洗脫劑用量確定大孔樹脂對石榴皮多酚解吸實驗曲線見圖5。由圖5可以得知，當解吸劑的用量為5. 5BV時，石榴皮多酚的解吸程度基本達到極限，此時こ醇解吸液中多酚含量為0. 5mg/mL，大部分的多酚已經在解脫劑用量為5BV時解脫下來，考慮到效率和經濟的因素，這里選擇こ醇解脫劑用量為5. 5BV。5、石榴皮多酚純化后的測定結果取經過DlOl型大孔樹脂純化處理后的石榴皮多酚，將其配制成濃度為0. lmg/mL的溶液，空白管為蒸餾水，將其在吸光度283nm處測值，平行做5此，帶入多酚回歸方程，計算其結果，數據如表3表所示。表3多酚純化物含量測定實驗序號吸光度多酚含量/%
10.74871.66
20.74571.31
30.75171.92
40.74170.93
50.75672.39從上面實驗結果可以看出，大孔樹脂的純化后的石榴皮多酚含量可達 71. 64%±0. 56 (RSD=O. 78%)，較以前未純化時49. 31%的石榴皮多酚含量增加了 22. 33%，這說明此方法有一定的純化效果，可以用于石榴皮多酚的純化分離。經過上述5項的考察，最終確定本發明純化步驟為石榴皮多酚粗提物加水配制成4-12mg/mL的溶液，過D101、D140或AB-8大孔樹脂，速度為0. 5-5. 5BV/h ;清洗用水為1-6BV，濃度大于60%v/v/的こ醇洗脫劑，使用量為1-6. 5BV，收集、干燥，得石榴皮多酚。優選純化條件為石榴皮多酚粗提物加水配制成lOmg/mL的溶液，過DlOl大孔樹脂，速度為2BV/h ;清洗用水為5BV，70%こ醇洗脫劑，使用量為5. 5BV，收集、干燥，得石榴皮多酚。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作進ー步的詳細說明。實施例I制備石榴皮多酚I、粉碎、過篩石榴皮(購買自成都中藥飲品有限公司)，烘干、粉碎，過篩，80-100目。2、粗多酚提取采用微波萃取儀(上海新儀微波化學科技有限公司)進行輔助提取，優化提取參數為提取溫度75°C、液料比30: I、提取時間140S，以80-100目的石榴皮粉提取多酚類物質，粗提物中總多酚含量為22. 06%，經減壓濃縮和真空凍干后，總多酚含量為49. 31%。3、分離、純化采用DlOl大孔樹脂，速度為2BV/h，進柱濃度為10mg/mL，清洗用水為5BV，70%乙醇洗脫劑，使用量為5. 5BV，得到石榴皮多酚，經減壓濃縮和真空凍干后，得石榴皮多酚，總多酚含量為71. 64%。實施例2本發明所得石榴皮多酚活性成分分析本發明所得石榴皮多酚中主要活性成分為安石榴苷、鞣花酸、綠原酸、表兒茶素、槲皮素，采用RC-HPLC分析。安石槽苷色譜條件色譜柱為Hypersil 0DS2 (250nmX4. 6nm, 5 u m大連依利特公司)，流動相為甲醇_2%冰醋酸(7 93)，體積流量為I. OmL/min,檢測波長為232nm，柱溫250C，理論塔板數按鞣花酸計大于8000，分離度大于I. 5。鞣花酸、綠原酸、表兒茶素和槲皮素混標色譜條件色譜柱為Hypersil0DS2 (250nmX4. 6nm, 5um大連依利特公司)，流動相為こ腈-0. 4%磷酸(17:83)，流速為
I.OmL/min，檢測波長310nm，柱溫為30°C，理論塔板數按鞣花酸計大于8000，鞣花酸(保留時間為8. 681min)、槲皮素(保留時間為17. 238min)、綠原酸(保留時間為4. 392min)、表兒茶素(保留時間為5. 463min)的分離度大于I. 5。
經RC-HPLC分析，實施例I所得石榴皮多酚中，安石榴苷、鞣花酸、綠原酸、表兒茶素、槲皮素分別為46. 91%、9. 44%、0. 53%、0. 32%、0. 75%。實施例3體外抗氧化活性測定DPPH > 0H, Of和脂質過氧化物的測定方法I、DPPH 的清除活性準確稱取DPPH標準品20mg，無水こ醇定容至500mL，得濃度為0. 04mg/mL溶液。取此溶液3mL，加入不同濃度的石榴皮提取液lmL，室溫30min，測定吸光度值，空白組以ImL無水こ醇代替試樣，并按下式計算清除率DPPH 清除率=(I-A 試樣 /A 空白)X 100%2、 OH的清除活性采用亞鐵離子催化過氧化氫產生羥自由基(Fonton反應)方法。取0. 75mmol/L鄰ニ氮菲溶液lmL, PBS液2mL和蒸懼水ImL,充分混勻后，加0. 75mmol/L硫酸亞鐵ImL,混勻，加0. 01%的過氧化氫lmL,37°C溫育60min, 536nm處測其吸光度，其值為AP。用ImL蒸餾水代替ImL過氧化氫，測得吸光度為AB。用試樣ImL代替ImL蒸餾水，測得吸光度為As。
OH清除率(d%)計算公式
權利要求
1.從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于以水為溶劑，采用微波提取得到石榴皮多酚粗提物，然后經過大孔樹脂分離，減壓濃縮、真空凍干后得到石榴皮多酚。
2.根據權利要求I所述的從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于 A、粉碎石榴皮； B、提取溶劑為水，采用微波提取，干燥提取液，得石榴皮多酚粗提物； 其中，微波提取條件為溫度60-95°C、液料比15:1-40:1，提取時間60-180S ； C、純化石榴皮多酚粗提物加水配制成4-12mg/mL的溶液，過D101、D140或AB-8大孔樹脂，速度為0. 5-5. 5BV/h ;采用用量大于5BV的水清洗；采用用量為1_6. 5BV、濃度大于60%v/v/的乙醇洗脫；收集洗脫液，干燥，得石榴皮多酚。
3.根據權利要求2所述的從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步驟B優選微波提取條件為 溫度75°C、液料比30:1，提取時間140S。
4.根據權利要求2所述的從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步驟C純化條件中石榴皮多酚粗提物加水配制成10mg/mL的溶液。
5.根據權利要求2所述的從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步驟C純化條件中大孔樹脂樹脂采用DlOl大孔樹脂。
6.根據權利要求2所述的從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步驟C純化條件中石榴皮多酚粗提物加水配制的溶液過大孔樹脂的速度為2BV/h。
7.根據權利要求2所述的從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步驟C純化條件中采用用量5BV的水清洗。
8.根據權利要求2所述的從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步驟C純化條件中采用濃度大于70%v/v/的乙醇，用量為5. 5BV洗脫。
9.根據權利要求2所述的從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步驟A粉碎石榴皮粒度至>40目。
10.根據權利要求I所述的從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，其特征在于步驟A粉碎石榴皮粒度至80-100目。
全文摘要
本發明屬于植物提取領域，具體涉及一種從石榴皮提取石榴皮多酚的方法，該方法具有操作簡便、提取效率高的優點。具體的，該方法是以水為溶劑，采用微波提取得到石榴皮多酚粗提物，然后經過大孔樹脂分離，減壓濃縮、真空凍干后得到石榴皮多酚。所得石榴皮多酚粗提物與石榴皮多酚中總多酚含量較高，粗提物收率達40-50%，為獲得石榴皮多酚提供了一種新的選擇。
文檔編號A61Q19/00GK102755360SQ201210256750
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月24日 優先權日2012年7月24日
發明者馮慧, 劉佳, 唐遠謀, 唐鵬程, 焦士蓉 申請人:西華大學