專利名稱：脫細(xì)胞肌腱或韌帶膠原纖維材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物纖維材料領(lǐng)域，具體涉及一種新的天然生物材料一脫細(xì)胞肌腱/ 韌帶膠原纖維材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)前肌腱和韌帶替代物主要包括自體移植物、異體或異種移植物及合成材料移植 物，但均有其不可回避的缺點(diǎn)。雖然自體韌帶移植為最有效的修復(fù)重建方法，但康復(fù)時(shí)間 長(zhǎng)，功能恢復(fù)不滿意而不能廣泛應(yīng)用于臨床。異體或異種肌腱抗原性強(qiáng)是其最大的缺點(diǎn)。人 工合成材料如碳纖維、聚酯材料等非降解材料，短期內(nèi)能提供足夠的力學(xué)強(qiáng)度，但其不能再 生，長(zhǎng)期使用易引起磨損斷裂。近年來(lái)組織工程韌帶開(kāi)始進(jìn)入眾多研究者的視線，支架材料 的選擇問(wèn)題是組織工程韌帶面臨的最大問(wèn)題之一。聚羥基乙酸(PGA)等可降解人工合成支 架材料，因其不具備細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)良好的細(xì)胞親和性及生物力學(xué)性能不理想，而限制 其在肌腱和韌帶損傷修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用。天然材料如膠原、蠶絲等具有良好的生物相容性，但 在生物力學(xué)性能、構(gòu)建仿生三維結(jié)構(gòu)、表面修飾及降解的調(diào)節(jié)等多方面還有待于進(jìn)一步研 究。脫細(xì)胞基質(zhì)具有組織器官ECM的固有特點(diǎn)，異體和異種肌腱脫細(xì)胞后ECM抗原性大大 降低，具備良好的組織相容性。但脫細(xì)胞基質(zhì)與種子細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞很難滲透到脫細(xì) 胞基質(zhì)內(nèi)部對(duì)其進(jìn)行重塑。現(xiàn)有的脫細(xì)胞方法足以脫除肌腱內(nèi)細(xì)胞成分，但脫細(xì)胞去污劑 能破壞細(xì)胞外基質(zhì)和影響細(xì)胞粘附和增殖，另外完整的肌腱是致密的結(jié)締組織，纖維束的 包膜結(jié)構(gòu)阻礙了細(xì)胞成分脫除和細(xì)胞植入。這些因素限制了脫細(xì)胞在組織工程韌帶領(lǐng)域的 應(yīng)用。理想的生物替代材料應(yīng)該具備良好的生物力學(xué)特性和生物相容性。肌腱/韌帶脫 細(xì)胞膠原纖維材料為一種新型的生物材料，保留有肌腱/韌帶ECM固有的力學(xué)結(jié)構(gòu)單位和 細(xì)胞附著結(jié)構(gòu)，去除了細(xì)胞成分，具有良好的力學(xué)性能和生物相容性。肌腱/韌帶脫細(xì)胞膠 原纖維材料有別于合成膠原纖維材料。雖然都取材于動(dòng)物(如來(lái)源于牛跟腱)，但合成膠原 纖維是將動(dòng)物膠原(如肌腱和韌帶膠原)溶解提純的膠原分子，在體外聚合成原纖維，其提 純膠原分子的過(guò)程完全破壞了其ECM的空間結(jié)構(gòu)和成分。如何再將其制備成具有肌腱和韌 帶ECM結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的替代物或組織工程支架一直未得到滿意的解決。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種克服上述缺點(diǎn)的新的天然生物材料一脫細(xì)胞肌腱/ 韌帶膠原纖維材料及其制備方法。肌腱/韌帶膠原纖維或纖維束主要成分是膠原蛋白，傳統(tǒng)的纖維分離提取技術(shù) 中，化學(xué)方法溶解膠原是其重要步驟，因此不適用于肌腱/韌帶膠原纖維的分離。本發(fā)明人 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，低溫干燥的肌腱纖維是可以機(jī)械分離的(圖1)，分離的纖維保留一定的力學(xué) 強(qiáng)度，通過(guò)物理開(kāi)松和梳理的方法，選出可膠原纖維和纖維束，為制備肌腱脫細(xì)胞膠原纖維 提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞過(guò)程中，肌腱/韌帶完整的腱膜/外膜阻礙了細(xì)胞成分的脫除，切開(kāi)肌腱纖維束膜后脫除細(xì)胞成分過(guò)程較完整的肌腱明顯簡(jiǎn)便有效，而且ECM 的基質(zhì)結(jié)構(gòu)和成分無(wú)明顯改變，具有良好的力學(xué)特性和生物相容性。物理方法分離的膠原 纖維或纖維束無(wú)完整的腱膜或外膜包繞，脫細(xì)胞方法簡(jiǎn)便。本發(fā)明提供了一種脫細(xì)胞肌腱或韌帶膠原纖維材料的制備方法，由以下步驟組 成1)取動(dòng)物肌腱或韌帶，清除動(dòng)物肌腱或韌帶表面的外膜和滑膜組織；2)將動(dòng)物肌腱或韌帶低溫干燥；3)通過(guò)物理開(kāi)松的方法(如擠壓、錘擊、真空反爆氣流沖擊等)將低溫干燥的肌腱 或韌帶結(jié)構(gòu)松散；4)物理除雜、梳理等工序分離肌腱或韌帶膠原纖維或膠原纖維束；5)將分離的膠原纖維或膠原纖維束進(jìn)行脫細(xì)胞；6)將脫細(xì)胞的膠原纖維或膠原纖維束低溫干燥。本發(fā)明還提供了根據(jù)上述脫細(xì)胞肌腱或韌帶膠原纖維材料的制備方法制得的脫 細(xì)胞肌腱或韌帶膠原纖維材料。本發(fā)明采用低溫干燥，溫度以-80°C -40°C為宜，優(yōu)選_56°C，對(duì)肌腱/韌帶細(xì)胞外 結(jié)構(gòu)影響小，可以減小其抗原性，并且便于物理開(kāi)松、梳理的方法分離膠原纖維或纖維束。 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，無(wú)腱膜包繞的膠原纖維或纖維束，通過(guò)低滲液漂洗可以脫除粘附于膠原纖維表 面的細(xì)胞成分，并對(duì)其生物力學(xué)和組織相容性無(wú)明顯影響。本發(fā)明的肌腱/韌帶脫細(xì)胞膠原纖維材料，直接從動(dòng)物肌腱/韌帶分離，進(jìn)行脫細(xì) 胞后獲得，具備保留有肌腱/韌帶ECM固有的力學(xué)結(jié)構(gòu)單位和細(xì)胞附著結(jié)構(gòu)，且去除了細(xì)胞 成分。本發(fā)明的制備方法取材豐富，成本低廉，豬、牛等哺乳動(dòng)物的肌腱/韌帶均可作為 材料來(lái)源。本發(fā)明的生物材料不含細(xì)胞成分，具備良好的生物力學(xué)特性、ECM空間結(jié)構(gòu)、生 物相容性和實(shí)用性。本發(fā)明的肌腱/韌帶脫細(xì)胞膠原纖維材料肌腱/韌帶脫細(xì)胞膠原纖維 材料除可以應(yīng)用于韌帶、肌腱修復(fù)重建外，因其具有纖維材料的特性，還可以廣泛應(yīng)用于其 他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，社會(huì)需求量大。


圖1是低溫干燥牛韌帶或肌腱膠原纖維或纖維束實(shí)物圖。圖2是牛肌腱脫細(xì)胞膠原纖維或纖維束的組織HE染色切片圖(100倍)。其中A是正常肌腱纖維束；B是脫細(xì)胞肌腱纖維束。圖3是牛脫細(xì)胞膠原纖維與兔髕韌帶成纖維細(xì)胞體外復(fù)合培養(yǎng)1周后，組織冰凍 切片HE染色圖(100倍)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。實(shí)施例1 牛肌腱脫細(xì)胞膠原纖維或纖維束的制備1)取新鮮牛肌腱，清除肌腱帶表面的外膜和滑膜組織。
2)將肌腱置于_56°C真空凍干儀(美國(guó)VirTis BENCHT0P)，12h。3)通過(guò)擠壓、錘擊將低溫干燥的肌腱結(jié)構(gòu)松散。4)將松散的肌腱進(jìn)一步梳理分離肌腱膠原纖維或膠原纖維束。5)將分離的膠原纖維或纖維束脫細(xì)胞用IOmM的低滲tris緩沖液+絲氨酸蛋白酶抑制劑(0. 05%苯甲基磺酰氟化物乙 醇溶劑，35ml/L 50ml乙醇+25mgPMSF)，持續(xù)96h，每隔24h換液一次。根據(jù)纖維束粗細(xì)，在 脫細(xì)胞過(guò)程中可酌情加用少量去污劑(如TritonX-100、三磷酸丁酯等)和胰酶等。所有步 驟均在室溫、搖床(150RPM)進(jìn)行，均加5ml/L青霉素/鏈霉素溶液(10000U/ml IOOOOmg/ ml)溶液預(yù)防污染，完成每一步驟均使用PBS沖洗3邊。6)將脫細(xì)胞的膠原纖維或纖維束用干燥無(wú)菌紗布汲干表面水分，置于_56°C真空 凍干儀，3h后干燥保存待用。實(shí)施例2 牛韌帶脫細(xì)胞膠原纖維或纖維束的制備
以牛韌帶替換牛肌腱，其余同實(shí)施例1。實(shí)施例3 牛肌腱脫細(xì)胞膠原纖維或纖維束的組織學(xué)檢查取脫細(xì)胞前、后的膠原纖維或纖維束給予石蠟包埋，切片(5 μ m)、HE染色觀察。觀 察細(xì)胞核成分(蘇木素染色)，膠原排列形態(tài)(伊紅染色)，圖2中A脫細(xì)胞前的膠原纖維 束；B脫細(xì)胞后的膠原纖維或纖維束見(jiàn)細(xì)胞成分完全脫除。實(shí)施例4 牛肌腱脫細(xì)胞膠原纖維或纖維束的體外異種細(xì)胞相容性評(píng)價(jià)1)異種細(xì)胞培養(yǎng)髕韌帶成纖維細(xì)胞的分離新西蘭大白兔(3月，第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提 供)戊巴比妥鈉靜脈麻醉后，在無(wú)菌操作下取髕韌帶，PBS沖洗，并徹底清除髕韌帶滑膜 及周圍軟組織。用膠原酶處理15min(37°C )，PBS沖洗3邊后將髕韌帶剪成Imm3組織塊，間 隔3mm鋪在培養(yǎng)皿(IOXlOcm2)上，加少量10%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液。組織塊貼壁后(4h) 加10%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液覆蓋組織塊，培養(yǎng)液沒(méi)3-4天更換一次。分離的第三代成纖維 細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。2)肌腱脫細(xì)胞纖維消毒將脫細(xì)胞纖維初步成束(直徑約2mm，也可根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)編織成不同直徑的樣本) 支架密封包裝，使用使用Y射線(15KGray)消毒，將消毒的脫細(xì)胞韌帶加入10%胎牛血清 細(xì)胞培養(yǎng)液24h后未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)。3)體外復(fù)合培養(yǎng)將韌帶成纖維細(xì)胞消化離心懸液(細(xì)胞濃度106/ml)，滴在脫細(xì)胞纖維束表面，培 養(yǎng)4小時(shí)后移入培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)3天。4)組織學(xué)檢查將培養(yǎng)3天肌腱脫細(xì)胞膠原纖維束，在室溫下OCT膠浸潤(rùn)，而后至于-20°C 30min, 冰凍切片(ΙΟμπι)，行HE染色。如圖3所示，見(jiàn)韌帶成纖維細(xì)胞貼附在膠原纖維表面，生長(zhǎng) 形態(tài)(細(xì)胞核呈梭形)良好，說(shuō)明牛肌腱/韌帶膠原纖維材料對(duì)異種細(xì)胞組織相容性好。
權(quán)利要求
一種脫細(xì)胞肌腱或韌帶膠原纖維材料的制備方法，其特征在于該方法是由以下步驟組成A)取動(dòng)物肌腱或韌帶，清除動(dòng)物肌腱或韌帶表面的外膜和滑膜組織；B)將動(dòng)物肌腱或韌帶于-80℃至-40℃低溫干燥；C)通過(guò)物理開(kāi)松的方法將低溫干燥的肌腱或韌帶結(jié)構(gòu)松散；D)物理除雜、梳理工序分離肌腱或韌帶膠原纖維或膠原纖維束；E)將分離的膠原纖維或膠原纖維束進(jìn)行脫細(xì)胞處理；F)將脫細(xì)胞的膠原纖維或膠原纖維束汲干表面水分后于-80℃至-40℃低溫干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脫細(xì)胞肌腱或韌帶膠原纖維材料的制備方法，其特征在 于該方法中低溫干燥的溫度是_56°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種脫細(xì)胞肌腱或韌帶膠原纖維材料的制備方法，其特 征在于該方法中物理開(kāi)松的方法是擠壓、錘擊或真空反爆氣流沖擊。
4.根據(jù)1-3所述的脫細(xì)胞肌腱或韌帶膠原纖維材料的制備方法制得的脫細(xì)胞肌腱或 韌帶膠原纖維材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物纖維材料領(lǐng)域，當(dāng)前肌腱和韌帶替代物主要包括自體移植物、異體或異種移植物及合成材料移植物，但均有其不可回避的缺點(diǎn)。本發(fā)明的目的在于提供了一種具備良好的生物力學(xué)特性和生物相容性的天然生物材料-脫細(xì)胞肌腱/韌帶膠原纖維材料及其制備方法。本發(fā)明保留有肌腱/韌帶膠原纖維或纖維束固有的力學(xué)結(jié)構(gòu)單位和細(xì)胞附著結(jié)構(gòu)，采用低溫干燥的方法處理肌腱/韌帶纖維，分離的纖維保留一定的力學(xué)強(qiáng)度，通過(guò)物理開(kāi)松和梳理的方法，選出可膠原纖維和纖維束，再進(jìn)行脫細(xì)胞處理。本發(fā)明肌腱/韌帶脫細(xì)胞膠原纖維或纖維束材料來(lái)源廣泛，量大并廉價(jià)，除可用于韌帶、肌腱修復(fù)重建外，因其具有纖維材料的特性，還可廣泛應(yīng)用于其他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)D01F4/00GK101831724SQ20101014979
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者周盛源, 朱巍, 陳雄生 申請(qǐng)人:陳雄生;朱巍;周盛源