專利名稱：：克隆的犬科動物及其生產方法
技術領域：
：本發明涉及克隆的犬科動物及其生產方法。更具體地說，本發明涉及生產克隆的犬科動物的方法和用該方法生產的克隆的犬科動物，所述生產克隆的犬科動物的方法包括將犬科動物的成熟的卵母細胞的細胞核去除掉以制備去核的受體卵母細胞，在優化的條件下采用犬科動物的體細胞作為核供體細胞將核移植到去核的卵母細胞中以制備核移植胚胎，然后將該核移植胚胎移植到代孕母體的輸卵管中。
背景技術：
：隨著最新的通過細胞融合或胞質內細胞注射進行體細胞移植技術的發展，已經可以制備克隆的動物了。體細胞核移植技術是使將要出生的活體后代不經歷在生殖過程中通常存在的減數分裂及形成單倍體生殖細胞的方法，該方法通過將成年動物的二倍體體細胞移植到去核的細胞中形成胚胎并在體內移植該胚胎形成新的個體。一般地，在體細胞核移植技術中，在體外人工培養到減速分裂的中期II以后，使用待移植的受體卵母細胞和體細胞供體細胞核。然后，為了防止因體細胞核移植導致的染色體變異，在移植體細胞前，必須除去成熟的卵母細胞的細胞核。在將體細胞注射到成熟的卵母細胞的卵周隙或細胞質中后，用電刺激使去核的卵細胞和體細胞相互融合。用電剌激或化學物質激活融合體，并將該融合體移植到代孕母體中以生產活體后代。在本領域可以廣泛地采用這種體細胞核移植技術，例如，優良動物的繁殖，稀有動物或瀕危動物的保護、某種營養素的生產、治療用的生物材料的生產、用于器官移植的動物的生產、具有某種疾病或癥狀的動物的生產、用作替代如細胞和基因的治療在內的器官移植的具有藥用價值的動物的生產。動物克隆技術首先由英國RoslinInstitute的Wilmut博士實現的，Wilmut博士通過取出六歲的綿羊的乳腺細胞并將該細胞移植到去核的卵母細胞中以制備核移植胚胎，然后在體內移植該胚胎，從而得到克隆動物多莉(Dolly)。自那以后，通過使用成年動物的體細胞進行核移植得到了克隆奶牛、克隆小鼠、克隆山羊、克隆豬和克隆兔(WO9937143A2，EP930009A1,WO9934669Al，WO9901164A1和US5,945,577)。與此同時，不僅僅是工業動物如奶牛和豬，寵物如狗的克隆也引起了許多人的興趣。最近，在寵物中，貓首先被克隆出來，并且克隆狗的研究也在進行。然而，還沒有報道表明通過體細胞移植技術己經成功地克隆了犬科動
發明內容因此，本發明的發明人進行了克隆犬科動物的生產方法的研究，結果，本發明的發明人首先用體細胞移植方法在優化的電融合條件、核移植胚胎激活條件和胚胎移植到代孕母體的條件下生產了克隆的犬科動物，從而完成了本發明。因此，本發明的一個目的是提供一種采用體細胞核移植技術生產犬科動物的核移植胚胎的方法。本發明的另一個目的是提供一種采用所述方法制備的犬科動物的核移植胚胎。本發明的另一個目的是提供一種生產克隆的犬科動物的方法，該方法包括將所述核移植胚胎移植到代孕母體中以生產活體后代的步驟。本發明的另一個目的是提供一種采用所述方法生產的克隆的犬科動物。為了實現上述目的，一方面，本發明提供了一種采用體細胞核移植技術制備犬科動物的核移植胚胎的方法。另一方面，本發明提供一種采用所述方法制備的犬科動物的核移植胚胎。另一方面，本發明提供一種生產克隆的犬科動物的方法，該方法包括將所述核移植胚胎移植到代孕母體中以生產活體后代的步驟。另一方面，本發明提供一種采用所述方法生產的克隆犬科動物。在下文中，將詳細描述本發明。術語定義本文中使用的術語"核移植"是指通過人工地將一個去核的細胞和一個具有核DNA的細胞合并，以獲得具有相同特征形式和性質的基因操作技術。本文中使用的術語"核移植胚胎"是指注入或融合有核供體細胞的胚胎。本文中使用的術語"克隆"是指制備具有與另一個體單位相同的基因組的新個體單位的基因操作技術。在本發明中，該術語尤其是指一個細胞、胚胎細胞、胎兒細胞、和/或動物細胞具有與另一個細胞、胚胎細胞、胎兒細胞、和/或動物細胞基本相似或相同的核DNA序列的事實。本文中使用的術語"核供體細胞"是指被轉移到受體卵母細胞的作為核受體的細胞或細胞核。本文中使用的術語"受體卵母細胞"是指在去除核后接受核供體細胞的細胞核移植的卵母細胞。本文中使用的術語"成熟卵母細胞"是指處于減速分裂中期II的卵母細胞。本文中使用的術語"去核的卵母細胞"是指去除了細胞核的卵母細胞。本文中使用的術語"融合"是指核供體和受體卵母細胞的類脂膜的合并。例如，類脂膜可以是細胞質膜或細胞核膜。可以在將核供體和受體卵母細胞相互接近時或將核供體放置于受體卵母細胞的卵周隙空間時進行電刺激融合。本文中使用的術語"激活"是指在核移植步驟之前、之中或之后刺激細胞使細胞分裂。本文中使用的術語"活體后代"是指從子宮出來后存活的動物。"活體后代"的動物可以是從母體出來后存活了至少一秒鐘、一分鐘、一天、一周、一個月、六個月或超過一年的動物。"活體后代"的動物可以不需要在子宮環境的循環系統中生存。本文中使用的術語"犬科動物"包括狗、狼、狐(fox)、豺、叢林狼(coyotes)、韓國狼和貍(mccoondogs)，優選包括狗或狼。眾所周知狗是由野生的狼馴養得到的，因此，狗和狼具有相同的染色體數并表現出相似的懷孕周期及性激素的變化(SealUS等，BiologyReproduction1979，21:1057-1066)。本發明的特征是首次通過體細胞核移植技術成功地克隆了犬科動物，所述體細胞核移植技術是在優化的電融合條件下制備犬科動物的核移植胚胎，然后激活核移植胚胎并將核移植胚胎移植到代孕母體的輸卵管中生產活體后代。本發明制備犬科動物的核移植胚胎的方法包括以下步驟(a)將犬科動物的成熟卵母細胞的細胞核去除掉，以制備去核的受體卵母細胞；(b)從供體犬科動物的組織中分離體細胞，以制備核供體細胞；(c)將步驟(b)制備的核供體細胞微注射到步驟(a)制備的去核的卵母細胞中，并在3,0-3.5KV/cm的電壓下對供體細胞和去核的卵母細胞進行電融合；(d)激活步驟(c)制備的融合的卵母細胞。在下文中將詳細描述本發明的犬科動物的核移植胚胎的制備方法的各步驟。步驟l:受體卵母細胞的去核對于用作受體卵母細胞，從犬科動物收集的未成熟的卵母細胞可以在體外成熟或收集在體內成熟的卵母細胞。一般地，哺乳動物(如，牛、豬和綿羊)的卵母細胞排出成熟的卵母細胞，即減速分裂中期II的卵母細胞，然而與其它動物不同，犬科動物排出的卵母細胞處于減速分裂中期I并在輸卵管中停留48-72小時的期間內成熟。由于犬科動物的卵母細胞核的成熟速度非常慢并且犬科動物的排卵時間和生殖生理學與其它動物不同，因此，作為受體卵母細胞使用的犬科動物的卵母細胞優選在體內成熟。更尤其是，從犬科動物收集成熟的卵母細胞優選在對犬科動物進行誘導排卵后48-72小時，且更優選在72小時后進行。對于犬科動物排卵的具體時間可以通過本領域已知的任何方法確定。對于確定犬科動物排卵的具體時間的實例包括但不限于陰道涂片試驗、血清性激素水平的檢測和使用超聲記錄診斷系統。動情期的開始可以通過外陰漲大和血漿血液的(serosanguionous)排放來確定。在本發明的一個實施例中，進行了陰道涂片試驗和血清中的孕酮濃度的分析；非角質化的上皮細胞超過80。/^且血清中的孕酮濃度達到約4.0-7.5ng/ml的那天被認為是排卵時間。根據這種排卵時間的確定方法，在排卵后48-72小時并優選在72小時收集卵母細胞。并且，從犬科動物排出的卵母細胞的成熟時間為排卵后的48-72小時；本發明的發明人分析了排卵后48小時、60小時和72小時收集的卵母細胞，結果表明在排卵后約72小時收集的卵母細胞與減速分裂中期II的成熟卵母細胞相對應。另外，實際上本發明中成功的生產了克隆狗的卵母細胞就是在排卵后72小時收集的卵母細胞。這提示最優選在排卵后72小時收集犬科動物的成熟卵母細胞。作為一種收集在體內成熟的卵母細胞的方法，可以使用一種外科的方法，該方法包括麻醉動物以及隨后進行的剖腹手術。更具體地說，在體內成熟的卵細胞的收集可以采用本領域中任何已知的方法進行輸卵管切除術實現。輸卵管切除術是一種用卵母細胞收集培養基對通過外科手術切除得到的輸卵管進行向下沖洗，然后從沖洗物中收集卵母細胞的方法。在另一種方法中，在體內成熟的卵母細胞可以通過在輸卵管的粘膜皺襞分支(fimbriatedend)插入一個導管，用針型留置導管向子宮輸卵管結合處注射沖洗物而收集得到。這種方法的優點是不損害輸卵管，因此，在卵母細胞供體動物的下一個動情周期到來時還可以使用該動物。因此，在體內成熟的卵母細胞的收集方法優選為包括采用不會損害輸卵管的導管的方法。并且，為了提高包括使用導管的卵母細胞的收集方法的速度，本發明的發明人開發了一種具有圓形前端的、易于插入到輸卵管的入口處的卵母細胞收集(retrieval)針(參見圖1)。更具體地說，使用本發明的發明人開發的針的收集卵母細胞的方法包括將具有圓形前端的卵母細胞收集針插入并扎結在輸卵管中，然后用卵母細胞收集培養基向下沖洗子宮輸卵管結合處以使沖洗物流入卵母細胞收集針中，并用顯微鏡觀察沖洗物以選取成熟卵母細胞。在收集到成熟的卵母細胞后，除去卵母細胞的單倍核。卵母細胞的去核可以釆用本領域中任何已知的方法進行(見美國專利No.4994384;美國專利No.5057420;美國專利No.5945577;歐洲專利No駕0009Al;韓國專利342437;Kanda等，J.Vet.Med.Sci.，57(4):641-646，1995;Willadsen，Nature,320:63-65，1986;Nagashima等，Mol.Reprod.Dev.48:339-3431997;;Nagashima等，J.Reprod.Dev.38:37-78,1992;Pmther等，Biol.Repord41:414-418,1989,;Prather等，J.Exp.Zool.255;355-358,19卯；Saito等AssisReprodTechAndro,259:257-266,1992;Theriogenology37:309,1992)。優選情況下，受體卵母細胞的去核可以通過下述兩種方法中任意一種方法進行，一種方法包括除去成熟受體卵母細胞的卵丘細胞；用微針切除受體卵母細胞一部分的透明帶產生一個切口；和通過該切口除去第一極體、細胞核和附近的細胞質(盡可能少的量)。另一種方法包括除去受體卵母細胞的卵丘細胞；將卵母細胞染色；和用抽吸吸液管除去卵母細胞的第一極體和細胞核。對于卵母細胞的去核，更優選使用吸氣的方法，因為通過目測評價發現釆用抽吸方法能夠使受體卵母細胞的存活率高，而采用形成缺口的方法，受體卵母細胞的存活率低。步驟2:核供體細胞的制備作為核供體細胞，可以使用犬科動物的體細胞。具體地說，在本發明中使用的體細胞可以是犬科動物的胚胎細胞、胎兒細胞、少年細胞或成年細胞，體細胞優選來源于卵丘、皮膚或口黏膜、血液、骨髓、肝、腎、肌肉和生殖道等，可以從成年細胞獲得。可以用在本發明的體細胞的實例包括但不限于卵丘細胞、上皮細胞、成纖維細胞、神經細胞、表皮細胞、角化細胞、造血細胞、黑素細胞、軟骨細胞、紅細胞、巨噬細胞、單核細胞、肌肉細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、胚胎干細胞和胚胎生殖細胞。可以用在本發明的體細胞更優選包括胎兒成纖維細胞、成年成纖維細胞和卵丘細胞。此外，可用于本發明的供體細胞可以是通過用某種基因采用基因轉移方法或基因尋靶方法將野生型體細胞轉型而獲得的那些細胞。本領域任何技術人員可以容易地操作所述基因轉移方法或基因尋靶方法，因為這些技術在本領域是公知的。作為核供體細胞使用的體細胞可以通過制備外科樣品或活組織檢查樣品的方法獲得，并且可以通過本領域任何公知的方法從這些樣品中獲得單細胞。例如，一些待克隆的動物組織是在麻醉狀態下被切除，形成外科樣品或活組織檢查樣品，然后，這些樣品被切碎，用胰酶處理后在組織培養基中培養。在組織培養基中培養3-4天后，確定細胞在培養皿中的生長情況。當細胞完全生長時，冷凍一些細胞并保存在液氮中供以后使用，將剩余的細胞傳代培養以用于核移植。為了防治細胞過度生長，用于核移植的連續培養的細胞傳代培養高達10次。上述使用的組織培養基可以是本領域中公知的一種培養基，其實例包括TCM-199和DMEM(Dulbecco，smodifiedEagle'smedium)。步驟3:核供體細胞的顯微注射和融合將核供體細胞顯微注射到去核的卵母細胞是通過采用移液管將核供體細胞顯微注射到去核的卵母細胞的細胞質和透明帶之間來實現的。用細胞操作器將用于核供體細胞顯微注射的去核的卵母細胞和核供體細胞進行電融合。電融合可以用直流電或交流電進行。電融合優選在電壓為3.0-3.5KV/cm進行，更具體地說，可以用3.0-3.5KV/cm的直流電進行l-3次電融合，每次電融合10-30|is。電融合更優選用3.0-3.5KV/cm的直流電進行2次電融合，每次電融合20ps。如果電融合電壓低于3.0KV/cm或高于3.5KV/cm，卵母細胞和核供體細胞之間的融合速度很低。上述電融合的電壓范圍的特征是，該電壓范圍比目前公知的一般使用的電融合電壓范圍(1.7-2.0V/cm)高。在本發明的一個測試實施例中，為了確定最佳的電融合電壓范圍，將用于核供體細胞顯微注射的核移植胚胎在不同電壓范圍下進行電融合，并用顯微鏡觀察融合速度(見測試實施例2)。結果發現，核融合速度在高電壓下比在低電壓下快，并且在電壓為3.0-3.5KV/cm范圍內時獲得最高達75.2%的融合速度(見表7)。通過電剌激將核供體細胞融合到卵母細胞可以在融合培養基中進行。本發明使用的融合培養基可以是含有甘露醇、MgS04、Hepes(4-羥乙基呱嗪乙磺酸)和BSA(牛血清白蛋白)的培養基。步驟4:核移植胚胎的激活核移植胚胎的激活是重新激活暫時終止的細胞周期的步驟。為了重新激活細胞周期，必須降低用于終止細胞周期的元素如MPF和MAP激酶等的細胞信號傳遞物質的激活作用。一般地，激活核移植胚胎的方法包括電學方法和化學方法。在本發明中，優選采用化學方法激活核移植胚胎。化學方法比電學方法能更快地激活核移植胚胎。作為化學方法，存在一種使用下述物質處理核移植胚胎的方法，所述下述物質為乙醇；三磷酸肌醇(IP3);二價離子(如，Ca^或Sr2+);微管抑制劑(如，細胞松弛素B);二價離子載體；和包括6-二甲基氨基嘌呤、蛋白質合成抑制劑(如，環己酰亞胺)、佛波醇-12-十四烷酸酯-D-醋酸酯(PMA)在內的蛋白質激酶抑制劑。作為核移植胚胎的激活的化學方法，優選地，在本發明中可以用鈣離子載體和6-二甲基氨基嘌呤同時或逐步處理核移植胚胎。更優選地，先用5-10pM的鈣離子載體在37-39t:下處理核移植胚胎3-6分鐘，然后用1.5-2.5mM的6-二甲基氨基嘌呤37-39t:下處理核移植胚胎4-5小時。在本發明的一個測試實施例中，用電學方法和化學方法激活核移植胚胎后，觀察該核移植胚胎的發育時期(見測試實施例3)。結果表明化學激活方法能夠促進核移植胚胎的發育潛力，化學方法激活的核移植胚胎能夠使核移植胚胎發育到桑椹胚期(見表8)。因此，本發明提供了通過上述方法制備的犬科動物的核移植胚胎。本發明的一個實施例制備的犬科動物的核移植胚胎被本發明的發明人命名為"Snuppy"(克隆的犬科動物的胚胎)。"Snuppy"(克隆的犬科動物的胚胎)已在2005年7月15日在國際保藏單位韓國典型培養物保藏中心(KCTC)(KoreanCollectionforTypeCultures;KoreanResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology,52,Oundong,Yusong-gu，Daejeon,K0rea)進行了保7藏，保藏編號為KCTC10831BP。凍存核移植胚胎并在需要時可以將核移植胚胎熔化后使用。而且，可以通過將本發明的犬科動物的核移植胚胎移植到代孕母體中生產活體后代而生產克隆的犬科動物。優選地，將本發明的核移植胚胎移植到代孕母體的輸卵管中。可以通過本領域任何公知的方法進行移植，優選地，可以使用導管來移植克隆胚胎。在本發明的一個實施例中，首先通過將本發明的核移植胚胎移植到代孕母體的輸卵管中生產得到了克隆狗"Snuppy"和"NT-2『(見實施例6)。然而，本發明的一個測試實施例表明如果將本發明的核移植胚胎移植到代孕母體的子宮中，代孕母體不會懷孕(見測試實施例4)。這說明在生產克隆狗時，優選將核移植胚胎移植到輸卵管中。并且，在將核移植胚胎移植到代孕母體中時，核移植胚胎可以處于1-細胞期、2-細胞期或4-細胞期。核移植胚胎在移植到代孕母體之前可以一直培養在25^1用礦物質油覆蓋的mSOF微滴中。因此，本發明提供了克隆的犬科動物。該克隆的犬科動物具有與核供體細胞或供體完全相同的基因特性。在本發明的一個實施例中，按照本發明的方法生產了克隆狗并且采用微衛星分析法分析了其基因特性(見測試實施例1)。結果發現本發明的克隆狗具有與核供體細胞或供體完全相同的基因特性(見表6)。如前文所述，本發明提供了一種生產克隆的犬科動物的方法。因此本發明有助于獸醫學、人類學和醫學方面研究的發展，如優良犬科動物的繁殖、稀有或瀕危犬科動物的保護、異種移植和疾病動物模型。圖1是本發明一個實施例中所使用的從狗體內收集卵母細胞的15量規和18量規針型卵母細胞收集器的照片；圖2(a)的照片顯示了根據本發明的方法生產的克隆狗Snuppy和供體狗(a);以及克隆狗Snuppy和它的代孕母親(b)。具體實施方式在下文中，將通過實施例對本發明進行詳細地描述。然而，應當理解為給出這些實施例僅僅是為了說明的目的而不是為了限制本發明的范圍。實施例l:狗的受體卵母細胞的收集用于收集受體卵母細胞的狗是按照首爾大學的實驗動物管理認證(SeoulNationalUniversityforAccreditationofLaboratoryAnimalCare虔立的標準混合繁殖的131條狗齡為1-3年的雌性狗。排卵時間是根據對動情期狗的陰道涂片試驗和血清中孕酮的濃度進行檢測來確定的。成熟卵母細胞在排卵后48-72小時收集。為了檢測血清中孕酮的濃度，每天收集3-5ml的血并離心收集血清，通過DSL-3900ACTIVEProgesteroneCoated-TubeRadioimmunoassayKit(DiagnosticSystemsLaboratories,Inc.,TX)對血清進行分析。孕酮濃度首次達到4.0-7.5ng/ml的那一天被認為是排卵時間(Hase等J.Vet.Med.Sci.,62:243-248,2000)。為了進行陰道涂片試驗，從剛出現發情前期跡象的那天開始每天收集涂片。通過將拭子插入外陰唇中收集涂片，然后將涂片滾涂到玻璃片上。用Diff-Quik染色(InternationalchemicalCo.,Japan)后，用顯微鏡檢測涂片；表面細胞超過表皮細胞角化指數的80%的時間被認為排卵時間(EvansJ.M.等，VET.Rec.，7:598-599,1970)。己知在排卵后48-72小時是排出的卵母細胞的成熟時間。因此，本發明的發明人按照下述方式在48-72小時后收集卵母細胞。首先，對已經達到體內成熟的卵母細胞的收集時間的雌性狗施以0.05mg/kg的硫酸阿托品和0.025mg/kg的馬來酸乙烯丙嗪，并施以5mg/kg的氯胺酮進行麻醉。通過給與異氟烷維持麻醉狀態。將麻醉的雌性狗的腹部切幵5-10cm，然后將具有圓形前端的卵母細胞收集針(見圖1)插入到腹腔的輸卵管中并用縫合用的線在原地縫合，然后用24量規IV導管將卵母細胞收集培養基(見表l)向下沖入到子宮輸卵管結合處使沖洗物流到16量規的針型收集器中。將沖洗物轉移到無菌的有蓋培養皿(Petri-dish)中，然后在顯微鏡下觀察以選擇成熟的卵母細胞。表l卵母細胞收集培養基成分含量1升的TCM粉(Gibco31100-027)9.9gP/S抗生素1%(10000IU青霉素，10mg的鏈霉素)HEPES緩沖液2,38gFBS(胎牛血清)10%(v/v)NaHC03CU680gBSA5mg/L結果表明，從每只狗中平均收集12個成熟的卵母細胞，一共收集1370個成熟的卵母細胞。實施例2:受體卵母細胞的去核向hCR2aa培養基中(表2)加入0.1%(v/v)的透明質酸酶(Sigma，USA)，其中，hCR2aa培養基通過向不含Ca^的CR2培養基中加入Hepes緩沖液而制備得到(CHARLESRosenkrans2;Rosenkransetal"Biol.Reprod.49,459-462，1993)。然后，通過在上述培養基中反復吹打而除去由實施例1獲得的卵母細胞中的卵丘細胞。然后用5lig/ml雙苯甲亞胺(bisbenzimide)(Hoechst33342)對卵母細胞進行染色5分鐘，在裝有落射熒光的倒置顯微鏡下放大200倍觀察以選擇只具有第一極體的卵母細胞。將10%(v/v)FBS和5|ig/ml的細胞松弛素B加入到hCR2aa培養基(表2)中，用顯微操作器(Narishige，Tokyo,Japan)在培養基中使選擇的卵母細胞去核。也就是用控制(holding)微量吸液管(內徑為150pm)固定卵母細胞，然后用抽吸吸液管除去第一極體、附近的細胞質(少于5%)和卵母細胞核。將去核的卵母細胞保存在添加10X的FBS的TCM-199培養基(表3)中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施例3:核供體細胞的制備使用狗的成年成纖維細胞作為核供體細胞。為了本目的，首先分離3歲狗齡的雄性阿富汗獵犬的耳部皮膚的活組織切片。用DPBS(Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水)將小片的耳部組織片段沖洗3次，然后用外科刀片切碎。切碎的組織在含有0.25%(W/V)的胰蛋白酶和lmM的EDTA的Dulbecco，smodifiedEagle'smedium培養基(DMEM;LifeTechnologies,Rockville,MD)中于37"C溫度下分離1小時。胰蛋白酶消化的細胞在不含Ca"和Mg"的DPBS中通過300g離心2分鐘沖洗一次，將細胞接種在IOO毫米的塑料培養皿中。隨后將接種的細胞在添加有10%(V/V)的FBS、lmM的谷氨酰胺、25mM的NaHC03和1%(V/V)最少量的必需介質(MEM)非必需氨基酸溶液(LifeTechnologies)的DMEM培養基中于39。C溫度下、濕潤的含5%的C02和95%的空氣的氣氛中培養6-8天。除去未粘附的細胞簇或外植體后，通過O.l%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA消化粘附的細胞1分鐘，以進一步對粘附的細胞進行4-6天的傳代培養。將傳代培養的細胞置于凍存的培養基中并保存在-196。C的液氮中。所述凍存培養基由80%(V/V)DMEM、10%(V/V)DMSO和10%(V/V)FBS組成。實施例4:核供體細胞微注射到去核的卵母細胞和它們的融合將實施例3制備的核供體細胞微注射到實施例2制備的去核的卵母細胞中。實施例2中的微操作器上的抽吸吸液管被移液管代替后，在hCR2aa培養基中，用濃度為100mg/ml的植物凝集素處理固定的細胞。用控制微量吸液管控制去核的卵母細胞的裂縫，然后將移液管插入。用移液管將實施例3中從成纖維細胞中分離的單細胞注入到去核的卵母細胞的細胞質和透明帶之間。將上述注射有核供體細胞的卵母細胞置于融合培養基(含0.26M的甘露醇，0.1mM的MgS。4，0.5mM的Hepes和0.05%的BSA)中，然后轉移到裝有不銹鋼電線電極(BTX453，3.2mm的間隙；BTX，SanDiego，CA)的細胞融合腔中。在平衡3分鐘后，用BTX電細胞操作器在3.0-3.5KV/cM的直流電壓下作用偶合體(couplets)20秒鐘，這樣將供體細胞融合到卵母細胞中。如果在低電壓(接近3.0KV/cM)下進行融合，收集的卵母細胞是弱的卵母細胞。而如果在高電壓(接近3.5KV/cM)下進行融合，收集的卵母細胞是健康的卵母細胞。在電壓平均為3.3KV/cM下進行融合。用立體顯微鏡選出1,095個融合的核移植胚胎，并將該胚胎在如表4所示的改良的合成輸卵管流體(mSOF)中培養3小時(Jangetal.，ReprodFertilDev，15,179-185,2003)。表4mSOF的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例5:核移植胚胎的激活將實施例4獲得的核移植胚胎在含有10pM的離子載體的mSOF(表4)中在39。C下培養4分鐘。將所述胚胎沖洗后在添加有1.9mM的6-二甲基氨基嘌呤的mSOF中培養4小時。按照上述方法制備的一個犬科動物的核移植胚胎被本發明的發明人命名為"Snuppy"(克隆的犬科動物的胚胎)，該胚胎已在2005年7月15日在國際保藏單位KCTC(KoreanCollectionforTypeCultures;KoreanResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology,52,Oundong,Yusong-gu,Daejeon,Korea)進行了保藏，保藏編號為KCTC10831BP。核移植胚胎在移植到代孕母體之前一直培養在25pl的礦物質油覆蓋的mSOF微滴中。實施例6:胚胎移植到代孕母體中并生產克隆狗將實施例5制備的核移植胚胎采用外科手術的方法移植到代孕母體的輸卵管中。在實施例5中制備的核移植胚胎被激活后，移植取決于代孕母體的準備情況。即，如果代孕母體立刻被準備好，則可以立即進行核移植胚胎的移植；如果不是這樣，在核移植胚胎(繁殖胚胎時期2細胞期或4細胞期)激活后的第二天進行移植。使用由混合繁殖的狗和拉布拉多獵狗(LabradorRetrievers)組成的123只狗作為代孕母狗。選擇的狗無任何疾病，具有正常規律的動情周期和正常的子宮狀態。通過外科手術將1,095個由實施例5制備的重構胚胎移植到代孕母體中。為了實現這個目的，通過血管注射0.1mg/kg的乙烯丙嗪和6mg/kg的異丙酚使代孕母體麻醉，并用2%的異氟烷(isoflurane)維持麻醉狀態。麻醉雌性狗在無菌條件下進行手術，用在普通的腹部手術中常用的在腹部的中心部位切開5-10cm，以露出輸卵管。用手刺激腹腔以便于將卵巢、輸卵管和子宮拉到切口處。小心處理拉出的卵巢的卵巢系膜以便于識別輸卵管的開口，將裝有1.0ml結核菌素注射器的3.5F雄貓導管(Sherwood,St.Louis,MO)插入到輸卵管中以確保在導管的前端有足夠的空間。在顯微鏡下觀察核移植胚胎是否被成功地注射到輸卵管中，然后將500ml生理鹽水注射到腹腔中。用可以吸收的縫合線縫合腹部，然后縫合皮膚。為了預防手術后感染，注射3天廣譜抗菌素。將核移植胚胎移植到代孕母體中22天后，用附有7.0MHZ線性探針的SONOACE9900(MedisonCo.LTD,Seoul,Korea)超聲掃描儀檢測妊娠情況。在首次確定懷孕后，每2周用超聲檢測妊娠情況。結果表明有三只狗懷孕。其中，一只狗失敗；在核移植胚胎移植后的60天，即2005年4月24日在剩余的兩只狗中的一只狗中通過剖腹產得到第一只克隆狗。出生時的重量為530克且克隆的小狗顯得很健康。克隆的小狗叫做"Snuppy"(SeoulNationalUniversityPuppy)。在對核移植胚胎進行移植后的60天，即2005年5月29日在剩下的另-一只狗中通過剖腹產得到第二只克隆狗。出生時的重量為550克且克隆的小狗顯得很健康。第二只克隆的小狗叫做"NT-2弁"。測試實施例l:本發明的克隆狗的基因身份的檢測根據本發明，對在實施例6中獲得的克隆小狗"Snuppy"和"NT-2『進行檢測，以確定克隆小狗"Snuppy"和"NT-2弁"是否與實施例3中供體狗阿富汗獵犬的核供體細胞具有相同的基因。分離克隆小狗、供體狗、代孕母體和核供體的成纖維細胞的基因組DNA。為了實現該目的，從克隆小狗得到組織片段和收集供體狗和代孕母體的血液樣本。將組織片段、血樣本和成纖維細胞置于添加有400pg蛋白酶K的裂解緩沖液中孵育過夜。然后進行酚抽提和乙醇沉淀，以分離各樣品中的基因組DNA。將分離的基因組DNA樣品溶解在50)^1的TE中，然后用8個犬科動物的特定標記[PEZ01、PEZ02、PEZ08、PEZ15(見美國專利No.5874217)、REN162B09、REN105L03、REN165M10、FH2140(見http:〃www.fhcre.org/science/dog—genome/dog.htm1)]進行小隨體分析(Francisco,L.V.等.Mann.Genome7,359-3621996;Neff,M.W.等，Genetics.151,803-820,1999;Richman，M.等.J.Biochem.Biophys.Methods47,137-149,2001;Denise,S.等.AnimalGenetics.35,14-17,2004)。以分離的基因組DNA作為模版，用根據公知標記序列制備的熒光標記的基因座位轉移性的引物(表5)進行PCR擴增。用自動DNA序列分析儀(ABI373AppliedBiosystems,FosterCity，CA)分析擴增產品。PCR反應條件為在94。C預變性1分鐘，接著在94"C變性20秒，58°C退火20秒，在74。C延長20秒，循環30次，最后在74"C延長5分鐘。用專用軟件(GeneScanandGenotype;AppliedBiosytems)計算PCR產品的大小。用于PCR擴增的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>結果發現本發明生產的克隆狗"Snuppy"和"NT-2#"與供體狗阿富汗獵犬和從供體狗分離的成纖維細胞的基因完全相同。另一方面，本發明的克隆狗與代孕母體(拉布拉多獵狗或混合繁殖的狗)的基因相互不同(表6)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>測試實施例2:核供體細胞與去核的卵母細胞的電融合的條件的優化為優化核供體細胞與去核的卵母細胞的電融合的條件，將核供體細胞按照實施例4的方式顯微注射到去核的卵母細胞中，然后在不同的電壓條件1.7-1.9KV/cm、2.1-2.5KV/cm和3.0-3.5KV/cm的條件下，使核供體細胞與卵母細胞相互融合。用立體顯微鏡觀察重組胚胎的融合情況。結果發現在電壓為3.0-3.5KV/cm的條件下，270個核移植卵母細胞中的203個是融合的。這表明在這種條件下融合效率比其它條件的融合效率高(表7)。表7在本發明的電融合電壓條件下的核移植胚胎的融合率使用的卵母細胞數電壓條件融合的卵母細胞數<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>測試實施例3:核移植胚胎激活條件的優化用電學方法和化學方法激活實施例4獲得的核移植胚胎。然后觀察核移植胚胎的發育時期。在電學方法中，將實施例4獲得的核移植胚胎置于含有100nM的CaCl2的甘露醇培養基(含0.26M的甘露醇，O.lmM的MgS04，0.5mM的Hepes和0.05%的BSA)中，然后轉移到裝有不銹鋼電線電極(BTX453,3.2mm的間隙；BTX，SanDiego，CA)的細胞融合腔中。在平衡3分鐘后，用BTX電細胞操作器在3.0-3.5KV/cM的直流電壓下作用偶合體20秒鐘，這樣將供體細胞融合到卵母細胞中。在化學方法中，將實施例4獲得的核移植胚胎置于含有10mM的離子載體(Sigma)的mSOF中，并在39。C下培養4分鐘。然后，將沖洗后的胚胎在添加有1.9mM的6-二甲基氨基嘌呤的mSOF(表4)中培養4小時。培養結束后，將胚胎轉移到TCM199培養基中(表3)。用立體顯微鏡在放大100倍下，觀察由電學方法和化學方法激活的核移植胚胎的每一個發育時期。結果表明采用化學方法激活的核移植胚胎提高了發育潛力。也就是說，如果用化學方法激活核移植胚胎，80%的卵母細胞發展到2-細胞期，而用電學方法激活核移植胚胎，只有約53%的卵母細胞發展到2-細胞期。并且還發現用化學方法激活的核移植胚胎能夠發育到桑椹胚期，而用電學方法激活的核移植胚胎僅發育到16-細胞期(表8)。表8按照本發明方法激活核移植胚胎的發育時期<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>測試實施例4:將本發明的的犬科動物的核移植胚胎移植到代孕母體中的移植條件的優化將實施例5激活的核移植胚胎在置于38-39'C的二氧化碳培養箱的mSOF(表4)中進行培養，且培養的空氣含5%的C02和5%的氧氣。然后將生長到8-細胞期的胚胎浸入到含0.1%的胎牛血清的PBS中，接著用細管將胚胎移植到20條代孕母體(混合繁殖的狗)的子宮角中。在移植核移植胚胎后的第22天，按照實施例6的方法用超聲掃描儀(MedisonCo.LTD,Seoul,Korea)檢測妊娠情況。結果發現將核移植胚胎移植到子宮中，沒有導致妊娠。這提示優選按照實施例6所述的方法將核移植胚胎移植到輸卵管中。工業適用性如上文所述，本發明提供了生產克隆的犬科動物的方法。因此本發明有助于獸醫學、人類學和醫學方面研究的發展，如優良犬科動物的繁殖、稀少或瀕危犬科動物的保護、異種移植和疾病動物模型。權利要求1.一種制備犬科動物的核移植胚胎的方法，該方法包括以下步驟(a)將犬科動物的成熟的卵母細胞的細胞核去除掉，以制備去核的受體卵母細胞；(b)從供體犬科動物的組織中分離體細胞，以制備核供體細胞；(c)將步驟(b)制備的所述核供體細胞顯微注射到步驟(a)制備的所述去核的卵母細胞中，并在3.0-3.5KV/cm的電壓下對供體細胞和去核的卵母細胞進行電融合；和(d)激活步驟(c)制備的融合的卵母細胞。2、根據權利要求1所述的方法，其中，所述成熟的卵母細胞為在體內成熟的卵母細胞。3、根據權利要求2所述的方法，所述在體內成熟的卵母細胞是在排卵后48-72小時從犬科動物收集得到的。4、根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(b)中的所述體細胞為選自由卵丘細胞、上皮細胞、成纖維細胞、神經細胞、表皮細胞、角化細胞、造血細胞、黑素細胞、軟骨細胞、紅細胞、巨噬細胞、單核細胞、肌肉細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、胚胎干細胞、胚胎生殖細胞、胎兒細胞、胎盤細胞和胚胎細胞所組成的組中的一種細胞。5、根據權利要求1所述的方法，其中，所述體細胞為成纖維細胞或卵丘細胞。6、根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(c)中的所述電融合在3.0-3.5KV/cm的直流電壓下進行1-3次，每次10-30ps。7、根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(d)中的激活步驟是通過用鈣離子載體和6-二甲基氨基嘌呤對融合的卵母細胞進行同時或逐步的處理而進行的。8、根據權利要求7所述的方法，其中，所述激活方法是通過用5-10nM的鈣離子載體將融合的卵母細胞在37-39。C下處理3-5分鐘，然后用1.5-2.5mM的6-二甲基氨基嘌呤將融合的卵母細胞在37-39。C下處理4-5小時而進行的。9、根據權利要求1所述的方法，其中，所述犬科動物選自由狗、狼、狐、犲、叢林狼、韓國狼和貍所組成的組中。10、根據權利要求1所述的方法，其中，所述犬科動物選自由狗、狼和狐所組成的組中。11、一種核移植胚胎，該核移植胚胎是由權利要求1-10中任意一項所述的方法制備的。12、根據權利要求11所述的核移植胚胎，該核移植胚胎保藏于韓國典型培養物保藏中心，保藏編號為KCTC10831BP。13、一種生產犬科動物的方法，該方法包括將權利要求11或12所述的核移植胚胎移植到代孕母體的輸卵管中以生產活體后代的步驟。14、根據權利要求13所述的方法，其中，所述犬科動物選自由狗、狼、狐、豺、叢林狼、韓國狼和貍所組成的組中。15、根據權利要求13所述的方法，其中，所述犬科動物選自由狗、狐和狼所組成的組中。16、一種克隆的犬科動物，該克隆的犬科動物是由權利要求13所述的方法生產的。17、根據權利要求16所述的克隆的犬科動物，其中，所述克隆的犬科動物的基因型與權利要求1所述的核供體細胞或核供體動物相同。18、根據權利要求16所述的克隆的犬科動物，其中，所述犬科動物選自由狗、狼、狐、豺、叢林狼、韓國狼和貍所組成的組中。全文摘要本文公開了克隆的犬科動物及其生產方法。所述克隆的犬科動物的生產方法包括將犬科動物的卵母細胞的細胞核去除掉以制備去核的受體卵母細胞，在優化條件下采用犬科動物的體細胞作為核供體細胞，將核移植到去核的卵母細胞中以制備核移植胚胎，然后將該核移植胚胎移植到代孕母體的輸卵管中。本發明提供了生產克隆的犬科動物的方法。因此本發明有助于獸醫學、人類學和醫學方面研究的發展，如優良犬科動物的繁殖、稀有或瀕危犬科動物的保護、異種移植和疾病動物模型。文檔編號C12N5/16GK101228265SQ200680027246公開日2008年7月23日申請日期2006年7月26日優先權日2005年7月26日發明者H·F·尤達,S·H·穆罕默德,吳炫周,姜成根,龜張,李柄千,金惠珍,金敏奎,金正柱,黃禹錫申請人:首爾大學校產學協力財團