專利名稱：對糖類物質有濃度響應的可降解的苯硼酸/粘液素層層自組裝超薄膜的制作方法
技術領域：
本發明涉及高分子自組裝膜領域，尤其涉及一種利用層層自組裝技術制備苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜的方法及應用。
背景技術：
Layer-by-Layer(LbL)自組裝(通常譯作層層自組裝)屬于界面超分子組裝技術，是一種制備厚度精確可控的功能薄膜的方法。此方法具有組裝基元豐富、組裝流程簡單可控及薄膜調控功能優越等優點。聚離子、生物大分子、金屬膠體粒子、表面帶電荷的無機微小粒子等均可作為組裝基元。組裝流程則主要是將洗滌干凈的基片依次浸泡在組裝材料中，通過靜電吸引使其交替沉積在基片表面，如此重復組裝即可獲得不同厚度的功能薄膜。 隨著對層層自組裝技術的不斷擴展，一些非靜電相互作用力如，氫鍵作用、疏水作用和生物特異識別作用也被引入作為層層組裝的成膜推動力，大大拓展了此技術的應用范圍。目前它以成為生物醫用材料表面設計和修飾的有效手段。與其它層狀組裝超薄膜技術(LB膜技術)相比，層層自組裝技術的最大特點是對沉積過程或膜結構的分子級控制。通過調控成膜溶液的酸堿度或離子強度，即可獲得功能可調的超薄膜表面。特別在生物大分子層層組裝中，此技術可以提高薄膜的生物相容性并可維持生物分子的天然結構。通過連續沉積不同組分即可實現層間分子對稱或非對稱的二維甚至三維的超晶格結構，從而實現薄膜的光、電、磁、非線性光學性等的功能化；也可仿真自然生物膜的形成。苯硼酸(PBA)是一種Lewis酸，在水溶液中以帶負電荷的解離態和不帶電荷的未解離態平衡存在。其中只有帶電荷的形式可以與具有1，2-或1，3-二醇基團的多羥基化合物(多糖、糖脂、糖蛋白及核苷酸等物質)形成可逆的五元或六元環酯，從而可用于多羥基化合物的識別、分離與檢測。眾所周知，在自然界中存在大量這樣的多羥基化合物，而且它們許多都存在于生物體內，對生物體的生命活動有重要影響。因此苯硼酸不僅可以用于這些化合物的檢測、分離與提純，還可以將其對體內多羥基物質的識別功能用于自律式給藥系統或調節某些生命活動。基于苯硼酸的上述特性，苯硼酸衍生物中的硼酸基團可與粘液素糖鏈中的羥基反應形成可逆的硼酯共價鍵。以此種硼酯共價鍵為主要推動力的層層自組裝超薄膜在適宜的條件下即會發生解組裝。例如在糖類物質(如葡萄糖)存在下，其會與粘液素中的糖鏈競爭硼酸基團從而導致自組裝膜解組裝。因此本發明的苯硼酸衍生物/粘液素層層組裝超薄膜是一種對糖類物質有濃度響應的可降解超薄膜。

發明內容
本發明的目的是提供一種對糖類物質有濃度響應的可降解的苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜及其制備方法和應用。
利用層層自組裝技術制備苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜的方法如下首先將基片依次浸泡在陽離子和陰離子聚電解質中，重復多個循環完成基片底膜的制備；再將苯硼酸衍生物和粘液素分別溶于pH 8. 0-9.0,0. OlM磷酸鹽緩沖液中，配成終濃度為0. 1-0. Olmg/mL含0-0. 5M NaCl的溶液。然后將預組裝底膜的基片繼續浸泡在苯硼酸衍生物溶液中，30-60分鐘取出，去離子水沖洗、氮氣干燥；再同樣操作放入粘液素溶液中浸泡。如此重復循環即可獲得苯硼酸 衍生物/粘液素層層自組裝超薄膜。上述步驟中所述的陽離子聚電解質為聚二烯丙基二甲基氯化銨(TODA)、聚丙烯胺(PAH)和聚醚酰亞胺(PEI);陰離子聚電解質為聚苯乙烯磺酸鹽(PSS)、聚丙烯酸(PAA)。上述步驟中所述的苯硼酸衍生物為聚(丙烯酰胺-3-丙烯酰胺基苯硼酸)[P(AAm-AAPBA)]，其中丙烯酰胺單體與3-丙烯酰胺苯硼酸單體的比例為100 5或是1000 50 ;為聚(N-異丙基丙烯酰胺-3-丙烯酰胺苯硼酸)[P (NIPAM-APBA)]，其中N-異丙基丙烯酰胺單體與3-丙烯酰胺苯硼酸單體的比例為50 25或是750 37.5。上述步驟中所述的粘液素為豬胃粘蛋白(PGM)、牛頌下腺粘蛋白(BSM)或人粘蛋白(MUC5B)。上述步驟中所述的基片為玻璃片、硅片、石英片、石英金片、石英銀片、細胞培養板和ELISA板。玻璃、石英和硅片基片在使用前需要經過酸洗。其中酸洗的過程為將玻璃、石英和硅片基片浸泡在75°C的體積比為7 3的98wt^H2SO4與30被^H2O2混合溶液中，浸泡2-3小時，然后用去離子水清洗干凈，氮氣干燥后使用。石英金片在使用前需要經過堿洗。過程為采用體積比為I : I : 5的25-28wt%&氨水、30wt% H2O2與去離子水的混合溶液，75°C浸泡15-30分鐘,浸泡后用去離子水清洗干凈,氮氣干燥后使用。本發明所述層層自組裝超薄膜應用于體內和體外糖類物質濃度檢測基于苯硼酸能與糖類或是糖蛋白結合形成硼酸酯這一原理，采用本發明制備的含苯硼酸組分的層層自組裝膜可以用于檢測糖類物質(例如葡萄糖)。本發明采用的方法是以石英金片為基片制備苯硼酸衍生物/粘液素層層自組裝薄膜，再利用石英晶體微天平測定隨糖類通入時間的變化石英金片頻率變化的情況。本發明的制作設備簡單、成本低、有較好的使用價值。通過對薄膜厚度的調控可有效提高對糖類物質檢測或吸附的靈敏度。并且可逆硼酯共價鍵的特性使此超薄膜易于降解，更利于重復組裝及使用。


圖I為實施例I中，在不同鹽離子濃度溶液中，苯硼酸衍生物與粘液素層層吸附所引起的石英銀電極頻率變化的曲線。圖2為實施例2中，在不同pH值溶液中，苯硼酸衍生物與粘液素層層吸附所引起的石英銀電極頻率變化的曲線。圖3為應用例I中，在pH值9.0條件下不同濃度葡萄糖溶液引起組裝金電極頻率變化的曲線。圖4為應用例2中，在pH值7. 4條件下不同濃度葡萄糖溶液引起組裝金電極頻率變化的曲線。
具體實施例方式通過以下實施例和應用例對本發明做更詳細的描述，但所述實施例和應用例不構成對本發明的限制。實施例I :苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜組裝將500uL聚二烯丙基二甲基氯化銨(I3DDA)和IOOmg聚苯乙烯磺酸鹽(PSS)分別溶于IOOmL超純水中，配成lmg/mL的溶液；分別取聚(丙烯酰胺_3_丙烯酰胺基苯硼酸)[P (AAm-AAPBA)]和豬胃粘蛋白(PGM)溶于pH 9. 0,0. OlM磷酸鹽緩沖液中，配成終濃度為0. lmg/mL的溶液，其中含有0. 5M NaCl。將干凈的石英銀電極(石英片基頻為9MHz，切割方式為AT-cut)先浸泡在I3DDA溶液中，10分鐘后取出，去離子水沖洗氮氣吹干；再浸泡在PSS溶液中，10分鐘后取出，去離子水沖洗氮氣吹干。如此重復兩次，最后浸泡于roDA溶液中，完成石英銀電極2. 5個雙層(roDA/PSS)2roDA底膜的制備，右下角數字2為重復浸泡的次數，再將此石英銀電極放入石英晶體微天平上測量頻率變化。然后繼續將此銀電極分別浸泡在含有不同鹽濃度(0M、
0.15M、0. 25M和0. 5M NaCl)的P (AAm-AAPBA)溶液中，20分鐘取出，去離子水沖洗氮氣吹干；再放入含有相同鹽濃度的PGM溶液中浸泡，20分鐘取出，去離子水沖洗氮氣吹干。此為一個循環，如此重復10次即在石英銀電極表面制得10個雙層的P(AA-APBA)/PGM層層自組裝超薄膜。在每層沖洗吹干后都將銀電極放入石英晶體微天平中測量銀電極頻率的變化，檢測不同鹽濃度下每雙層的P(AAm-AAPBA)和PGM吸附量的情況，結果如圖I。實施例2 :苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜組裝將ImL聚二烯丙基二甲基氯化銨(TODA)和200mg聚苯乙烯磺酸鹽(PSS)分別溶于 IOOmL超純水中，配成2mg/mL的溶液。分別取5mg聚(丙烯酰胺_3_丙烯酰胺基苯硼酸)[P(AAm-AAPBA)]和豬胃黏蛋白(PGM)溶于pH 8. 0-9. 0,0. OlM磷酸鹽緩沖液中，配成終濃度為0. lmg/mL的溶液，其中含0. 5M NaCl。按照實例I方法在石英銀電極(石英片基頻為9MHz，切割方式為AT-cut)上預組裝2. 5個雙層(roDA/PSS)2H)DA底膜，然后再將此銀電極分別浸泡在不同pH值(pH 8.0、pH 8. 5和pH 9. 0)的P(AAm-AAPBA)溶液中，30分鐘取出，去離子水沖洗氮氣吹干；再浸泡在相應PH值的PGM溶液中，30分鐘取出，去離子水沖洗氮氣吹干。如此重復10個循環，SP在石英銀電極制得10個雙層的P (AAm-AAPBA)/PGM層層自組裝超薄膜。將每層去離子水沖洗氮氣吹干后電極都放入石英晶體微天平中測量銀電極頻率的變化，檢測不同PH值條件下P(AAm-AAPBA)和PGM吸附量的情況，結果如圖2。實施例3 :堿性條件下苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜對葡萄糖濃度響應的應用按照實施例I方法在石英金電極表面組裝6個雙層的P (AAm-AAPBA) /PGM層層組裝超薄膜。再將組裝好的石英金電極安裝在石英晶體微天平內(石英片基頻為5MHz，切割方式為AT-cut)，先用pH 9.0,0. OlM磷酸鹽緩沖液走平基線，再分別換用濃度為0. 5、I和5mg/mL, pH 9. 0的葡萄糖溶液。檢測在pH值9. 0條件下不同濃度葡萄糖溶液對已組裝薄膜的金電極頻率的影響，結果如圖3所示。實施例4 :生理pH值條件下苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜對葡萄糖濃度響應的應用按照實施例I方法在石英金電極表面組裝5. 5個雙層的P (AAm-AAPBA) /PGM層層組裝超薄膜。再將組裝好的石英金電極安裝在石英晶體微天平內(石英片基頻為5MHz，切割方式為AT-cut)，先用pH 7. 4，0. OlM磷酸鹽緩沖液走平基線，再分別換用濃度為0. 5、I和5mg/mL, pH 7. 4的葡萄糖溶液。檢測在生理pH值條件下不同濃度葡萄糖溶液對已組裝薄膜的金電極頻率的 影響，結果如圖4所示。
權利要求
1.苯硼酸衍生物/粘液素層層自組裝超薄膜，其特征在于它的制備方法如下 首先將基片依次浸泡在陽離子和陰離子聚電解質中，重復多個循環完成基片底膜的制備；再將苯硼酸衍生物和粘液素分別溶解于溶劑，配成0. 1-0. 01mg/mL的溶液。然后將預組裝底膜的基片繼續浸泡在苯硼酸衍生物溶液中，30-60分鐘取出，去離子水沖洗、氮氣干燥；再同樣操作放入粘液素溶液中浸泡。如此重復循環即可獲得苯硼酸衍生物/粘液素層層自組裝超薄膜。
2.根據權利要求I所述的苯硼酸衍生物/粘液素層層自組裝超薄膜，其特征在于，所述的陽離子聚電解質為聚二烯丙基二甲基氯化銨(TODA)、聚丙烯胺(PAH)聚醚酰亞胺(PEI)；陰離子聚電解質為聚苯乙烯磺酸鹽(PSS)、聚丙烯酸(PAA)。
3.根據權利要求1-2所述的苯硼酸衍生物/粘液素層層自組裝超薄膜，其特征在于，所述的苯硼酸衍生物為聚(丙烯酰胺-3-丙烯酰胺苯硼酸)[P (AAm-AAPBA)]，其中丙烯酰胺單體與3-丙烯酰胺苯硼酸單體的比例為100 5或是1000 50;為聚(N-異丙基丙烯酰胺-3-丙烯酰胺苯硼酸)[P (NIPAM-AAPBA)]，其中N-異丙基丙烯酰胺單體與3-丙烯酰胺苯硼酸單體的比例為50 25或是750 37.5。
4.根據權利要求1-3所述的苯硼酸衍生物/粘液素層層自組裝超薄膜，其特征在于，所述的粘液素為豬胃粘蛋白(PGM)、牛頜下腺粘蛋白(BSM)或人粘蛋白(MUC5B)。
5.根據權利要求1-4所述的苯硼酸衍生物/粘液素層層自組裝超薄膜，其特征在于所述的溶劑為0. OlM磷酸鹽緩沖液，pH值8. 0-9. 0，其中含有0-0. 5M NaCl。
6.根據權利要求1-5所述的苯硼酸衍生物/粘液素層層自組裝超薄膜，其特征在于所述的基片為玻璃片、硅片、石英片、石英金片、石英銀片、細胞培養板和ELISA板。
7.權利要求1-6任一項所述的苯硼酸衍生物/粘液素層層自組裝超薄膜的制備方法，其特征在于首先將基片依次浸泡在陽離子和陰離子聚電解質中，重復多個循環完成基片底膜的制備；再將苯硼酸衍生物和粘液素分別溶解于溶劑，配成0. 1-O.Olmg/mL的溶液。然后將預組裝底膜的基片繼續浸泡在苯硼酸衍生物溶液中，30-60分鐘取出，去離子水沖洗、氮氣干燥；再同樣操作放入粘液素溶液中浸泡。如此重復循環即可獲得苯硼酸衍生物/粘液素層層自組裝超薄膜。
8.權利要求7所述的制備方法，其特征在于所述的陽離子聚電解質為聚二烯丙基二甲基氯化銨(TODA)、聚丙烯胺(PAH)聚醚酰亞胺(PEI);陰離子聚電解質為聚苯乙烯磺酸鹽(PSS)、聚丙烯酸(PAA)。
9.根據權利要求1-6任一項所述層層自組裝超薄膜在體內和體外對糖類物質檢測的應用。
全文摘要
本發明提供一種對葡萄糖及其它糖類物質有濃度響應的可降解苯硼酸衍生物/粘液素超薄膜的制備方法。這種自組裝超薄膜的具體制備步驟如下先將干凈基片依次浸泡在陽離子和陰離子聚電解質中，重復操作在基片表面制備多個雙層的底膜；然后再將此基片依次浸泡在苯硼酸衍生物溶液和粘液素溶液中。通過重復上述浸泡過程，即可獲得易于降解的苯硼酸衍生物/粘液素層層自組裝超薄膜。本發明的制作設備簡單、成本低、有較好的使用價值。通過對薄膜厚度的調控可有效提高對糖類物質檢測或吸附的靈敏度。并且可逆硼酯共價鍵的特性使此超薄膜易于降解，更利于重復組裝及使用。
文檔編號C04B41/52GK102775078SQ20121007322
公開日2012年11月14日 申請日期2012年3月13日 優先權日2012年3月13日
發明者安鐵洙, 李玉花, 林園, 王倩, 王博, 藍興國 申請人:東北林業大學大慶生物技術研究院, 大慶麥伯康生物技術有限公司, 李玉花