專利名稱：一種芯片、制備方法、用途及篩選藥物的方法
技術領域：
本發明涉及藥物篩選領域，特別涉及一種芯片、制備方法、用途及篩選藥物的方法。
背景技術：
中藥是我國幾千年來的文化沉淀，具有悠久的歷史和文化淵源。然而，中藥的開發仍然依賴于多年來的傳統方法，并以原料藥為基礎，缺乏系統的現代科學的基礎研究。大多數的中藥的作用機制不清楚、中藥藥方的關鍵組分不明確，而且可能存在無法意料的副作用。這些因素阻礙了中藥進軍國際天然藥物市場的主流。中藥要走向世界，進入國際市場，必須實現中藥現代化，與世界現代醫學接軌。研究人員希望尋找出治療特定疾病的中藥配方中的某種關鍵組分，解開傳統中醫的潛在功效之謎，為傳統中藥的發展開辟新的道路。例 如采用超臨界萃取等技術對中藥成分的提取，然后通過生物實驗(如細胞實驗)確認某一種餾分中是否含有有效活性成分，作為下一步細分、提純的決策依據。這種方法操作繁瑣、耗時費力、效率低。經濟快速的高通量篩選已成為當今藥物篩選的主流。在過去的幾年中，世界上著名的制藥公司紛紛與以高通量藥物篩選技術為核心的中小型生物科技公司結盟或合作，采用高通量或超高通量藥物篩選技術進行先導物分子的篩選。其中以小分子陣列芯片技術的應用最為廣泛。哈佛大學Schreiber課題組首次報道了小分子化合物微陣列芯片，主要用于篩選能與特定蛋白質特異性結合的化合物。他們將玻片表面進行化學處理，使其衍生化產生活性基團，然后采用高精度點樣儀吸取約InL的溶于合適有機溶劑(例如DMS0)樣品點樣于玻片特定的區域，利用表面活性基團與小分子特定基團的相互作用將小分子共價固定于芯片表面。通過這種方式，可以實現小分子陣列，而且滿足高密度地固定于玻片表面。雖然這種特異性固定策略非常適合于固定合成化合物，但是天然化合物的結構通常是多樣性，如果采用單一的固定方式難以將多種小分子固定于同一張芯片中，尤其是部分環狀小分子并沒有連接臂用于固定。因此，天然化合物的固定是小分子陣列的技術瓶頸。

發明內容
有鑒于此，本發明提供一種芯片、制備方法、用途及篩選藥物的方法。本發明提供的芯片，具有很好的抗蛋白質非特異性吸附能力，能夠并行固定多種小分子物質，進而用于篩選具有復雜組分的藥物，僅僅需要微量的化合物就能夠有效地分析小分子化合物與具體疾病靶標的生物活性，靈敏度高。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案本發明提供了一種芯片，包括固體支持物、兩端修飾的聚乙二醇和光交聯劑；兩端修飾的聚乙二醇為一端由鉚定基團修飾、另一端由結合基團修飾的聚乙二醇；固體支持物與鉚定基團連接、光交聯劑與結合基團連接；鉚定基團選自-SH、-S-S-、-SiCl3；
結合基團選自-C00H、-OH、-NH2、-OCH3。本發明提供的芯片在固體支持物表面通過兩端修飾的聚乙二醇引入光交聯劑，在紫外光(波長365nm，能量4J/cm2)照射下轉化為反應活性較高的中間體卡賓，卡賓基團能以多種方式結合小分子而無需小分子帶有特定功能基團。作為優選,光交聯劑選自苯基疊氮類化合物、B丫丙唳類化合物、二苯甲酮類化合物。優選地，光交聯劑選自苯基疊氮類化合物。作為優選，光交聯劑與結合基團經酸胺縮合反應偶聯。在本發明的一些實施例中，本發明提供的芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為100 5000。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為 1000 4000。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為 1500 3400。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為 2000 2800。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為 100 500。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為 500 1000。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為 1000 2000。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為 2000 5000。在本發明的一些實施例中，本發明提供的芯片中，固體支持物為玻璃基片或鍍金玻璃基片。本發明還提供了一種芯片的制備方法，包括如下步驟步驟I :取聚乙二醇分別與鉚定基團、結合基團連接，獲得兩端修飾的聚乙二醇；步驟2 :取固體支持物經預處理后與鉚定基團連接；步驟3 :活化結合基團后，與光交聯劑經酸胺縮合反應偶聯，即得；鉚定基團選自-SH、-S-S-、-SiCl3；結合基團選自-C00H、-OH、-NH2。作為優選，光交聯劑選自苯基疊氮類化合物、吖丙啶類化合物、二苯甲酮類化合物。優選地，光交聯劑選自苯基疊氮類化合物。在本發明的一些實施例中，本發明提供的芯片的制備方法中兩端修飾的聚乙二醇 的分子量為100 5000。 在本發明的另一些實施例中，本發明提供的芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為 1000 4000。
在本發明的另一些實施例中，本發明提供的芯片的制備方法中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為1500 3400。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的芯片的制備方法中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為2000 2800。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的芯片的制備方法中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為100 500。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的芯片的制備方法中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為500 1000。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的芯片的制備方法中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為1000 2000。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的芯片的制備方法中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為2000 5000。在本發明的一些實施例中，本發明提供的芯片的制備方法中，固體支持物為玻璃基片或鍍金玻璃基片。本發明還提供了上述制備方法制得的芯片。本發明還提供了上述芯片用于篩選藥物的應用。本發明還提供了一種基于芯片篩選藥物的方法，包括如下步驟步驟I :取待測物與芯片混合，干燥后置于紫外光下，洗去未結合的待測物，獲得第一芯片，滅活未結合位點后與靶標混合，經表面等離子體共振檢測獲得第一響應值；步驟2 :取不與靶標結合的配體作為陰性對照物與芯片混合，干燥后置于紫外光下曝光，洗去未結合的所述陰性對照物，獲得第二芯片，滅活未結合位點后與靶標混合，經表面等離子體共振檢測獲得第二響應值；步驟3 :獲得第一響應值與第二響應值的比值，根據比值判斷待測物與靶標是否結合；比值不小于3時，待測物為與靶標結合的藥物；比值小于3時，待測物為不與靶標結合的配體；芯片包括固體支持物、兩端修飾的聚乙二醇和光交聯劑；兩端修飾的聚乙二醇為一端由鉚定基團修飾、另一端由結合基團修飾的聚乙二醇；固體支持物與鉚定基團連接，光交聯劑與結合基團連接；鉚定基團選自-SH、-S-S-、-SiCl3；結合基團選自-C00H、-OH、-NH2、-OCH3。具體可以為，本發明提供的一種基于芯片篩選藥物的方法，包括如下步驟步驟I :采用高精度點樣儀將待測物點樣于芯片的特定區域，干燥后置于紫外光進行光交聯，洗去未結合的待測物，滅活未結合位點后與靶標混合，獲得小分子陣列，經表面等離子體共振檢測獲得第一響應值；步驟2 :采用高精度點樣儀將陰性對照物點樣于芯片的特定區域，干燥后置于紫外光進行光交聯，洗去未結合的陰性對照物，滅活未結合位點后與靶標混合，獲得小分子陣列，經表面等離子體共振檢測獲得第二響應值；步驟3 :獲得第一響應值與第二響應值的比值，根據所述比值判斷待測物與靶標是否結合；比值不小于3時，待測物為與靶標結合的藥物；比值小于3時，待測物為不與靶標結合的配體；芯片包括固體支持物、兩端修飾的聚乙二醇和光交聯劑；兩端修飾的聚乙二醇為一端由鉚定基團修飾、另一端由結合基團修飾的聚乙二醇；固體支持物與鉚定基團連接，光交聯劑與結合基團連接；鉚定基團選自-SH、-S-S-、-SiCl3；結合基團選自-C00H、-OH、-NH2。作為優選，光交聯劑選自苯基疊氮類化合物、吖丙啶類化合物、二苯甲酮類化合物。

優選地，光交聯劑選自苯基疊氮類化合物。在本發明的一些實施例中，本發明提供的基于芯片的篩選藥物的方法中，芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為100 5000。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的基于芯片的篩選藥物的方法中，芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為1000 4000。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的基于芯片的篩選藥物的方法中，芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為1500 3400。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的基于芯片的篩選藥物的方法中，芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為2000 2800。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的基于芯片的篩選藥物的方法中，芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為100 500。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的基于芯片的篩選藥物的方法中，芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為500 1000。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的基于芯片的篩選藥物的方法中，芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為1000 2000。在本發明的另一些實施例中，本發明提供的基于芯片的篩選藥物的方法中，芯片中兩端修飾的聚乙二醇的分子量為2000 5000。在本發明的一些實施例中，本發明提供的基于芯片的篩選藥物的方法中，芯片的固體支持物為玻璃基片或鍍金玻璃基片。作為優選，藥物為中藥復方或天然產物。本發明提供了一種芯片、制備方法及藥物篩選方法。該芯片包括固體支持物、與固體支持物連接的自組裝化合物以及與自組裝化合物中的結合基團偶聯的光交聯劑；自組裝化合物包括與固體支持物連接的鉚定基團、與鉚定基團連接的聚乙二醇以及與聚乙二醇連接的結合基團。本發明還提供了一種篩選藥物的方法。該方法首先將中藥復方、天然產物的餾分溶于合適的有機溶劑中，然后利用高精度的點樣儀將樣品點樣于上述光交聯基團修飾的SPR芯片特定的區域，干燥后，暴露于紫外光(波長365nm，能量4J/cm2)中固定小分子。最后利用SPR生物檢測技術快速篩選與靶向蛋白有相互作用的藥物成分。本發明提供的芯片，僅僅需要極其微量(ng級別)的化合物就能夠有效地分析小分子化合物與具體疾病靶標的生物活性，所用樣品量少；此外，本發明采用自組裝化合物將聚乙二醇、結合基團共價固定于芯片的表面，降低背景噪音，提高信噪比，具有很好的抗蛋白質非特異性吸附能力；本發明提供的芯片表面引入光交聯劑，在紫外光照射下轉化為反應活性較高的中間體卡賓，卡賓基團能以多種方式結合小分子而無需小分子帶有特定功能基團。該篩選方法可以實現各種結構的天然藥物分子的并行固定；本發明提供的芯片可以將高達800多種化合物直接固定于SPR芯片的特定區域，然后利用SPR技術的高通量、快速、動力學分析等優點，快速篩選中藥復方、天然產物的有效組分，檢測迅速，成本低廉。


圖I示實施例I提供的芯片與對照組普通芯片的表面蛋白質吸附情況；其中，線I示對照組芯片表面吸附蛋白引起SPR信號，線2示試驗組芯片表面吸附蛋白引起SPR信號；圖2示實施例10中本發明提供的芯片與陰性對照芯片(不與靶標結合的配體)的SPR檢測結果；其中線I示待測物R18，線2示待測物F0BISIN101，線3示陰性對照物。
具體實施方式
本發明公開了一種芯片、制備方法、用途及篩選藥物的方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明提供的一種芯片、制備方法、用途及篩選藥物的方法中所用藥物、天然小分子、原料及試劑均可由市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發明實施例I本發明提供的芯片的制備在潔凈的玻璃基片表面蒸鍍或磁控濺射l_2nm鉻膜，再在鉻膜的表面蒸鍍或者磁控派射約50nm的金膜。取蒸餾水30mL加熱至70 80°C，加入氨水6mL、雙氧水6mL，放入上述制得的鍍金玻璃基片，于70 80°C下處理lOmin，冷卻lOmin，加入蒸餾水、乙醇清洗，氮氣吹干，制得固體支持物。配置HS-PEG-OCH3 (分子量為350)和HS-PEG-COOH (分子量為450)的自組裝化合物的乙醇溶液，其中二者的摩爾比為10:1，總濃度為ImM。將固體支持物浸泡入上述自組裝化合物的乙醇溶液中，室溫下放置15小時，取出連接有分子量為450的自組裝化合物的固體支持物，用蒸餾水、乙醇充分清洗、氮氣吹干。表面的-COOH經由EDC/NHSS活化后，固定光交聯試劑，即得芯片。光交聯試劑為苯基疊氮類化合物。實施例2本發明提供的芯片的制備在潔凈的玻璃基片表面蒸鍍或磁控濺射l_2nm鉻膜，再在鉻膜的表面蒸鍍或者磁控派射約50nm的金膜。取蒸餾水30mL加熱至70 80°C，加入氨水6mL、雙氧水6mL，放入上述制得的鍍金玻璃基片，于7(T80°C下處理lOmin，冷卻lOmin，加入蒸餾水、乙醇清洗，氮氣吹干，制得固體支持物。 配置HS-PEG-OCH3 (分子量為350)和HS-PEG-OH (分子量為100)的自組裝化合物的乙醇溶液，其中二者的摩爾比為10:1，總濃度為ImM。將固體支持物浸泡入上述自組裝化合物的乙醇溶液中，室溫下放置15小時，取出連接有分子量為100的自組裝化合物的固體支持物，用蒸餾水、乙醇充分清洗、氮氣吹干。表面的-OH經丁二酸酐羧基化，后經EDC/NHSS活化后，固定光交聯試劑，即得芯片。光交聯試劑為吖丙啶類化合物。實施例3本發明提供的芯片的制備在潔凈的玻璃基片表面蒸鍍或磁控濺射l_2nm鉻膜，再在鉻膜的表面蒸鍍或者磁控派射約50nm的金膜。取蒸餾水30mL加熱至70 80°C，加入氨水6mL、雙氧水6mL，放入上述制得的鍍金玻璃基片，于7(T80°C下處理lOmin，冷卻lOmin，加入蒸餾水、乙醇清洗，氮氣吹干，制得固體支持物。配置HS-PEG-OCH3 (分子量為350)和HS-PEG-COOH_NH2 (分子量為339)的自組裝化合物的乙醇溶液，其中二者的摩爾比為10:1，總濃度為ImM。將固體支持物浸泡入上述自 組裝化合物的乙醇溶液中，室溫下放置15小時，取出連接有上述分子的自組裝化合物的固體支持物，用蒸餾水、乙醇充分清洗、氮氣吹干。表面的-NH2經由催化劑EDC、DMAP活化后，固定光交聯試劑，即得芯片。光交聯試劑為二苯甲酮類化合物。實施例4本發明提供的芯片的制備在潔凈的玻璃基片表面蒸鍍或磁控濺射l_2nm鉻膜，再在鉻膜的表面蒸鍍或者磁控派射約50nm的金膜。取蒸餾水30mL加熱至70 80°C，加入氨水6mL、雙氧水6mL，放入上述制得的鍍金玻璃基片，于7(T80°C下處理lOmin，冷卻lOmin，加入蒸餾水、乙醇清洗，氮氣吹干，制得固體支持物。配置-S-S-PEG-OCH3(分子量為 1500)和-S-S-PEG-COOH (分子量為 1000)的自組裝化合物的乙醇溶液，其中二者的摩爾比為10:1，總濃度為ImM。將固體支持物浸泡入上述自組裝化合物的乙醇溶液中，室溫下放置15小時，取出連接有分子量為1000的自組裝化合物的固體支持物，用蒸餾水、乙醇充分清洗、氮氣吹干。表面的-COOH經由EDC/NHSS活化后，固定光交聯試劑，即得芯片。光交聯試劑為苯基疊氮類化合物。實施例5本發明提供的芯片的制備取蒸餾水30mL加熱至70 80°C，加入氨水6mL、雙氧水6mL，放入玻璃基片，于7(T80°C下處理lOmin，冷卻lOmin，加入蒸餾水、乙醇清洗，氮氣吹干，制得固體支持物。配置Cl3-Si-PEG-OCH3 (分子量為 100)和 Cl3-Si-PEG-COOH(分子量為 500)的自組裝化合物的甲苯溶液，其中二者的摩爾比為10:1，總濃度為ImM。將固體支持物浸泡入上述自組裝化合物的甲苯溶液中，室溫下放置15小時，取出連接有分子量為10000的自組裝化合物的固體支持物，用蒸餾水、乙醇充分清洗、氮氣吹干。表面的-COOH經由EDC/NHSS活化后，固定光交聯試劑，即得芯片。光交聯試劑為苯基疊氮類化合物。實施例6本發明提供的芯片的制備取蒸餾水30mL加熱至70 80°C，加入氨水6mL、雙氧水6mL，放入玻璃基片，于7(T80°C下處理lOmin，冷卻lOmin，加入蒸餾水、乙醇清洗，氮氣吹干，制得固體支持物。配置Cl3-Si-PEG-OCH3(分子量為 450)和 Cl3-Si-PEG-OH(分子量為 436)的自組裝化合物的甲苯溶液，其中二者的摩爾比為10:1，總濃度為ImM。將固體支持物浸泡入上述自組裝化合物的甲苯溶液中，室溫下放置15小時，取出連接有分子量為8000的自組裝化合物的固體支持物，用蒸餾水、乙醇充分清洗、氮氣吹干。表面的-OH經由丁二酸酐羧基化后，再經由EDC/NHSS活化后，固定光交聯試劑，即得芯片。光交聯試劑為吖丙啶類化合物。實施例 7本發明提供的芯片的制備取蒸餾水30mL加熱至70 80°C，加入氨水6mL、雙氧水6mL，放入玻璃基片，于7(T80°C下處理lOmin，冷卻lOmin，加入蒸餾水、乙醇清洗，氮氣吹干，制得固體支持物。配置Cl3-Si-PEG-OCH3 (分子量為 2000)和 Cl3-Si-PEG-NH2 (分子量為 3400)的自組裝化合物的水溶液，其中二者的摩爾比為10:1，總濃度為ImM。將固體支持物浸泡入上述自組裝化合物的水溶液中，室溫下放置15小時，取出連接有分子量為3400的自組裝化合物的固體支持物，用蒸餾水、乙醇充分清洗、氮氣吹干。表面的-NH2經由EDC/NHSS活化后，固定光交聯試劑，即得芯片。光交聯試劑為二苯甲酮類化合物。實施例8本發明提供的芯片的制備取蒸餾水30mL加熱至70 80°C，加入氨水6mL、雙氧水6mL，放入玻璃基片，于7(T80°C下處理lOmin，冷卻lOmin，加入蒸餾水、乙醇清洗，氮氣吹干，制得固體支持物。配置Cl3-Si-PEG-OCH3 (分子量為450)和Cl3-Si-PEG-COOH的自組裝化合物的水溶液，其中二者的摩爾比為10:1，總濃度為ImM。將固體支持物浸泡入上述自組裝化合物的水溶液中，室溫下放置15小時，取出連接有分子量為5000的自組裝化合物的固體支持物，用蒸餾水、乙醇充分清洗、氮氣吹干。表面的-COOH經由EDC/NHSS活化后，固定光交聯試劑，即得芯片。光交聯試劑為苯基疊氮類化合物。實施例9蛋白非特異性吸附的檢測試驗組取243個天然配體小分子作為待測物，溶于DMSO中，利用GenetixQ-Array Mini將待測物點樣于實施例I制得的芯片中光交聯試劑表面，室溫下放置，干燥后，在紫外光(波長365nm，能量4J/cm2)下暴露45分鐘，光交聯固定待測物，獲得試驗組芯片。對照組將基片用蒸餾AH2030mL加熱至7(T80°C;加入氨水6mL ;加入雙氧水6mL ；放入待洗芯片，7(T80°C下處理IOmin ;冷卻IOmin ;蒸餾水、乙醇清洗，氮氣吹干。稱取的一定量11-巰基-I-十一酸(以下簡稱為MUA)，溶于無水乙醇配成ImM的溶液。將上述清洗好的芯片浸泡其新配制的溶液中，室溫過夜(15小時)。取出過夜的芯片，用乙醇浸泡并置于搖床上，室溫15分鐘，然后分別用去離子水及乙醇沖洗3次，用氮氣吹干，儲存于冰箱，備用。取上述芯片浸泡在IOmL的EDC/NHS溶液中，室溫30分鐘，固定光交聯試劑trifIuoromethyIaryldiazirines (TADs)。將243個天然小分子作為待測物溶于DMSO中，利用高精度點樣儀Genetix Q-Arrray Mini將待測物點樣于實施例I至8制得的芯片中光交聯試劑表面，點樣量為InL,室溫下放置,干燥后,在紫外光(波長365nm,能量4J/cm2)下暴露45分鐘，光交聯固定待測物，獲得對照組芯片。取試驗組芯片及對照組芯片，分別用DMF、乙醇充分清洗，洗掉未固定的待測物，氮氣吹干后浸泡入乙醇胺(1M，pH=8. 5) 30min,使未結合的活化位點失活；然后按照SPR的操作手冊安裝芯片以PBS緩沖溶液(pH=7. 4)作為流動相，待基線穩定后，通入14-3-3靶標蛋白(10yM)250S。本發明實施例I提供的芯片與對照組普通芯片的表面蛋白質吸附情況比較結果如圖I所示。其中，線I示對照組芯片表面吸附蛋白引起SPR信號相應為85RU，線2示試驗組芯片表面吸附蛋白引起SPR信號相應為55RU。結果表明試驗組芯片能顯著降低蛋白質的非特異性吸附，從而能提高檢測的靈敏度和特異性。用本發明實施例2至8制得的芯片采用上述方法，結果同上，試驗組芯片能顯著降低蛋白質的非特異性吸附，從而能提高檢測的靈敏度和特異性。實施例10本發明提供的芯片用于藥物的篩選試驗組取243個天然配體小分子作為待測物，溶于DMSO中，利用GenetixQ-Array Mini將待測物點樣于實施例I至8制得的芯片中光交聯試劑表面，室溫下放置，干燥后，在紫外光(波長365，能量4J/cm2)下暴露45分鐘，光交聯固定待測物，獲得第一芯片。對照組不與14-3-3靶標蛋白結合的配體小分子生物素作為陰性對照物，溶于DMSO中，利用高精度點樣儀Genetix Q-Array Mini將待測物點樣于實施例I至8制得的芯片中光交聯試劑表面，點樣量為InL，室溫下放置，干燥后，在紫外光(波長365nm，能量4J/ cm2)下暴露45分鐘，光交聯固定待測物，獲得第二芯片。分別取第一芯片及第二芯片，用DMF、乙醇充分清洗，洗掉未固定的待測物，氮氣吹干后浸泡入乙醇胺(1Μ，ρΗ=8. 5)30min，使未結合的活化位點失活；然后按照SPR的操作手冊安裝芯片以PBS緩沖溶液(pH=7. 4)作為流動相，待基線穩定后，分別通入14-3-3靶標蛋白(10 μ M) 250s，試驗組獲得第一檢測值，對照組獲得第二檢測值。檢測結果如圖2所示。其中，線I示待測物R18，線2示待測物F0BISIN101，線3示陰性對照物。結果表明，待測物R18與14-3-3靶標蛋白、待測物F0BISIN101與14-3-3靶標蛋白均具有顯著作用，而陰性對照物與14-3-3靶標蛋白沒有明顯的信號變化。第一檢測值與第二檢測值相比，具有顯著差異。第一檢測值與第二檢測值的比值大于3。由此可知，待測物R18、待測物F0BISIN101能夠與14_3_3靶標蛋白特異性結合，可以用作相關疾病的治療藥物。實施例11本發明提供的芯片用于藥物的篩選試驗組取300個天然配體小分子作為待測物，溶于DMSO中，利用GenetixQ-Array Mini將待測物點樣于實施例I至8制得的芯片中光交聯試劑表面，室溫下放置，干燥后，在紫外光(波長365，能量4J/cm2)下暴露45分鐘，光交聯固定待測物，獲得第一芯片。對照組不與Plasmepsins II祀標蛋白結合的配體小分子生物素作為陰性對照物，溶于DMSO中，利用高精度點樣儀Genetix Q-Array Mini將待測物點樣于實施例I至8制得的芯片中光交聯試劑表面，點樣量為InL，室溫下放置，干燥后，在紫外光(波長365nm，能量4J/cm2)下暴露45分鐘，光交聯固定待測物，獲得第二芯片。分別取第一芯片及第二芯片，用DMF、乙醇充分清洗，洗掉未固定的待測物，氮氣吹干后浸泡入乙醇胺(1Μ，ρΗ=8. 5)30min，使未結合的活化位點失活；然后按照SPR的操作手冊安裝芯片以PBS緩沖溶液(pH=7. 4)作為流動相，待基線穩定后，分別通入Plasm印sinsII靶標蛋白(10 μ M) 250s，試驗組獲得第一檢測值，對照組獲得第二檢測值。結果表明，待測物POl與Plasmepsins II革巴標蛋白、待測物P02與PlasmepsinsII靶標蛋白均具有顯著作用，而陰性對照物與Plasmepsins II靶標蛋白沒有明顯的信號變化。第一檢測值與第二檢測值相比，具有顯著差異。第一檢測值與第二檢測值的比值大于3。由此可知，待測物P01、待測物P02能夠與Plasmepsins II靶標蛋白特異性結合，可以用作治療相關疾病的藥物。實施例12本發明提供的芯片用于藥物的篩選試驗組取341個天然配體小分子作為待測物，溶于DMSO中，利用GenetixQ-Array Mini將待測物點樣于實施例I至8制得的芯片中光交聯試劑表面，室溫下放置，干燥后，在紫外光(波長365，能量4J/cm2)下暴露45分鐘，光交聯固定待測物，獲得第一芯片。對照組不與histone deacetylase5 (HDAC5)祀標蛋白結合的配體小分子生物素作為陰性對照物，溶于DMSO中，利用高精度點樣儀Genetix Q-Array Mini將待測物點樣于實施例I至8制得的芯片中光交聯試劑表面，點樣量為InL，室溫下放置，干燥后，在紫外光(波長365，能量4J/cm2)下暴露45分鐘，光交聯固定待測物，獲得第二芯片。分別取第一芯片及第二芯片，用DMF、乙醇充分清洗，洗掉未固定的待測物，氮氣吹干后浸泡入乙醇胺(1M，pH=8. 5)30min,使未結合的活化位點失活；然后按照SPR的操作手冊安裝芯片以PBS緩沖溶液(pH=7.4)作為流動相，待基線穩定后，分別通入histonedeacetylase5 (HDAC5)靶標蛋白(10 μ Μ) 250s，試驗組獲得第一檢測值，對照組獲得第二檢測值。結果表明，待測物HAl與histone deacetylase5 (HDAC5)靶標蛋白、待測物HA2 與histone deacetylase5 (HDAC5)祀標蛋白均具有顯著作用，而陰性對照物與histonedeacetylase5(HDAC5)靶標蛋白沒有明顯的信號變化。第一檢測值與第二檢測值相比，具有顯著差異。第一檢測值與第二檢測值的比值大于3。由此可知，待測物HA1、待測物HA2能夠與histone deacetylase5 (HDAC5)祀標蛋白特異性結合,可以用作治療相關疾病的藥物。實施例13本發明提供的芯片用于藥物的篩選試驗組取301個天然配體小分子作為待測物，溶于DMSO中，利用GenetixQ-Array Mini將待測物點樣于實施例I至8制得的芯片中光交聯試劑表面，室溫下放置，干燥后，在紫外光(波長365nm，能量4J/cm2)下暴露45分鐘，光交聯固定待測物，獲得第一芯片。對照組不與beta-site APP Cleaving Enzyme I (BACEl)革巴標蛋白結合的配體小分子生物素作為陰性對照物，溶于DMSO中，利用高精度點樣儀Genetix Q-Array Mini將待測物點樣于實施例I至8制得的芯片中光交聯試劑表面，點樣量為InL，室溫下放置，干燥后，在紫外光(波長365nm，能量4J/cm2)下暴露45分鐘，光交聯固定待測物，獲得第二芯片。分別取第一芯片及第二芯片，用DMF、乙醇充分清洗，洗掉未固定的待測物，氮氣吹干后浸泡入乙醇胺(1Μ，ρΗ=8. 5)30min，使未結合的活化位點失活；然后按照SPR的操作手冊安裝芯片以PBS緩沖溶液(pH=7. 4)作為流動相，待基線穩定后，分別通入beta-site APPCleaving Enzyme I (BACEl)祀標蛋白(10 μ M) 250s,試驗組獲得第一檢測值,對照組獲得第二檢測值。結果表明，待測物KA2與beta-siteAPP Cleaving Enzyme I (BACEl)革巴標蛋白、待測物FA2與beta-site APP Cleaving Enzyme I (BACEl)革巴標蛋白均具有顯著作用，而陰性對照物與beta-site APP Cleaving Enzyme I (BACEl)革巴標蛋白沒有明顯的信號變化。第一檢測值與第二檢測值相比，具有顯著差異。第一檢測值與第二檢測值的比值大于3。由此可知，待測物KA2、待測物FA2能夠與beta-site APP Cleaving Enzyme I (BACEl)祀標蛋白特異性結合，可以用作治療相關疾病的藥物。實施例14本發明提供的芯片用于藥物的篩選試驗組取260個天然配體小分子作為待測物，溶于DMSO中，利用GenetixQ-Array Mini將待測物點樣于實施例I至8制得的芯片中光交聯試劑表面，室溫下放置，干燥后，在紫外光(波長365，能量4J/cm2)下暴露45分鐘，光交聯固定待測物，獲得第一芯片。對照組不與C0X-2靶標蛋白結合的配體小分子生物素作為陰性對照物，溶于DMSO中，利用高精度點樣儀Genetix Q-Array Mini將待測物點樣于實施例I至8制得的芯片中光交聯試劑表面，點樣量為InL，室溫下放置，干燥后，在紫外光(波長365nm，能量4J/cm2)下暴露45分鐘，光交聯固定待測物，獲得第二芯片。分別取第一芯片及第二芯片，用DMF、乙醇充分清洗，洗掉未固定的待測物，氮氣吹干后浸泡入乙醇胺(1Μ，ρΗ=8. 5)30min，使未結合的活化位點失活；然后按照SPR的操作手冊安裝芯片以PBS緩沖溶液(pH=7. 4)作為流動相，待基線穩定后，分別通入14-3-3靶標蛋白(10 μ Μ) 250s，試驗組獲得第一檢測值，對照組獲得第二檢測值。結果表明，待測物C08與C0X-2靶標蛋白具有顯著作用，而陰性對照物與C0X-2靶標蛋白沒有明顯的信號變化。第一檢測值與第二檢測值相比，具有顯著差異。第一檢測值與第二檢測值的比值大于3。由此可知，待測物C08能夠與C0X-2靶標蛋白特異性結合，可 以用作治療相關疾病的藥物。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種芯片，其特征在于，包括固體支持物、兩端修飾的聚乙二醇和光交聯劑；所述兩端修飾的聚乙二醇為一端由鉚定基團修飾、另一端由結合基團修飾的聚乙二醇；所述固體支持物與所述鉚定基團連接，所述光交聯劑與所述結合基團連接； 所述鉚定基團選自-SH、-S-S-、-SiCl3 ； 所述結合基團選自-COOH、-OH、-NH2、-OCH3。
2.根據權利要求I所述的芯片，其特征在于，所述兩端修飾的聚乙二醇的分子量為100 5000。
3.根據權利要求I所述的芯片，其特征在于，所述光交聯劑選自苯基疊氮類化合物、吖丙啶類化合物、二苯甲酮類化合物。
4.一種芯片的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟I :取聚乙二醇分別與鉚定基團、結合基團連接，獲得兩端修飾的聚乙二醇； 步驟2 :取固體支持物經預處理后與所述鉚定基團連接； 步驟3 :活化所述結合基團后，與光交聯劑經酸胺縮合反應偶聯，即得； 所述鉚定基團選自-SH、-S-S-、-SiCl3 ； 所述結合基團選自-cooh、-oh、-nh2。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述兩端修飾的聚乙二醇的分子量為 100 5000。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述光交聯劑選自苯基疊氮類化合物、吖丙啶類化合物、二苯甲酮類化合物。
7.根據權利要求4至6任一項所述的制備方法制得的芯片。
8.根據權利要求I至3任一項或權利要求7所述的芯片用于篩選藥物的應用。
9.一種基于芯片篩選藥物的方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟I :取待測物與芯片混合，干燥后置于紫外光下經光交聯后，洗去未結合的待測物，滅活未結合位點后與靶標混合，經表面等離子體共振檢測獲得第一響應值； 步驟2 :取不與靶標結合的配體作為陰性對照物與芯片混合，干燥后置于紫外光下經光交聯后，洗去未結合的陰性對照物，滅活未結合位點后與靶標混合，經表面等離子體共振檢測獲得第二響應值； 步驟3 :獲得所述第一響應值與所述第二響應值的比值，根據所述比值判斷所述待測物與所述靶標是否結合；所述比值不小于3時，所述待測物為與所述靶標結合的藥物；所述比值小于3時，所述待測物為不與靶標結合的配體； 所述芯片包括固體支持物、兩端修飾的聚乙二醇和光交聯劑；所述兩端修飾的聚乙二醇為一端由鉚定基團修飾、另一端由結合基團修飾的聚乙二醇；所述固體支持物與所述鉚定基團連接，所述光交聯劑與所述結合基團連接； 所述鉚定基團選自-SH、-S-S-、-SiCl3 ； 所述結合基團選自-C00H、-0H、-NH2、-OCH3。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述兩端修飾的聚乙二醇的分子量為100 5000。
11.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述光交聯劑選自苯基疊氮類化合物、吖丙啶類化合物、二苯甲酮類化合物。
全文摘要
本發明涉及藥物篩選領域，具體涉及一種芯片、制備方法、用途及篩選藥物的方法。本發明提供的芯片，具有很好的抗蛋白質非特異性吸附能力，能夠并行固定多種小分子物質，進而用于篩選具有復雜組分的藥物，僅僅需要微量的化合物就能夠有效地分析小分子化合物與具體疾病靶標的生物活性，靈敏度高。
文檔編號C03C17/38GK102866132SQ20121037125
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者朱勁松, 何建安, 陳新穎, 彭開美 申請人:廣州高通生物技術有限公司