專利名稱：一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體nd5基因的部分dna測(cè)序及鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5基因的部分DNA測(cè)序及鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法。
背景技術(shù)：
早期的輪蟲分類學(xué)和系統(tǒng)學(xué)研究主要是依據(jù)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。如Wallace (1989)利用八種形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行聚類分析研究發(fā)現(xiàn)輪蟲門(Rotifera)、真輪蟲總綱(Eutatoria)和單巢綱(Monogonota)為單系，利用九種形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行聚類分析研究發(fā)現(xiàn)葉輪屬(Notholca)分為六個(gè)分支。Melone (1998)通過對(duì)I種棘頭動(dòng)物、6種輪蟲和2個(gè)外群(渦蟲和顎胃動(dòng)物)的60個(gè)形態(tài)特征進(jìn)行矩陣分析，獲得一個(gè)簡(jiǎn)約聚類樹，發(fā)現(xiàn)雙巢綱(Digononta)為并系類群，但不能確定輪蟲門的單系性。該系統(tǒng)樹不同于依據(jù)分子水平數(shù)據(jù)或演化分類原理而產(chǎn)生的系統(tǒng)樹。以形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)所研究的輪蟲系統(tǒng)學(xué)存在缺陷，因?yàn)檩喯x的形態(tài)受遺傳和環(huán)境因子兩方面的影響，盡管遺傳因素占主導(dǎo)地位。隨著輪蟲研究的深入，已有研究者發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)已經(jīng)不能滿足輪蟲部分種類鑒別和系統(tǒng)進(jìn)化研究(Guiset，1977 ；Koste, 1978 ；Shiel, 1993 ;Fontaneto, 2007)。Sergi (2005)等研究了褶皺臂尾輪蟲(B.plicatilis) L-型的兩個(gè)種 B.plicatilis sensu stricto 和 B.manjavacas 之間的形態(tài)度量差異，發(fā)現(xiàn)B.plicatilis s.s.比B.manjavacas平均長(zhǎng)6%,兩個(gè)種的個(gè)體之間表現(xiàn)出較大的形態(tài)度量交迭，形態(tài)學(xué)分類不能用于鑒別這兩個(gè)種，目前它們的分類只能依據(jù)分子指標(biāo)。2003年，為了了解形態(tài)可塑性和基因變異在輪蟲的形態(tài)變化中的作用，Derry等研究了不同形態(tài)的龜甲輪蟲(Keratella)線粒體CO I基因序列，發(fā)現(xiàn)有棘刺和無棘刺的螺形龜甲輪蟲(Keratella cochlearis)遺傳變異較大,核酸序列的差異達(dá)到4.4%,暗示它們是不同的種。而單棘刺和雙棘刺的曲腿龜甲輪蟲(K.hiemalis)核酸序列的差異為
0.21%，并且氨基酸序列沒有變異，說明它們的形態(tài)變異歸因于環(huán)境的誘導(dǎo)。傳統(tǒng)的輪蟲分類主要依據(jù)頭冠、棘刺、足和口器等外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)等形態(tài)學(xué)特征。但由于輪蟲種類眾多、體型微小及表型可塑性，輪蟲外部形態(tài)有些物種非常相似，并且同一物種還有季節(jié)性的周期變形，且許多種類缺乏有效地形態(tài)學(xué)分類特征，僅通過傳統(tǒng)的方法進(jìn)行鑒定和分類存在一定的困難，如壺狀臂尾輪蟲和紅臂尾輪蟲均為臂尾輪屬常見種類，因它們具有相似的形態(tài)，早期的研究曾將這兩種輪蟲歸為一種，稱為Brachionusurceus，也譯為壺狀臂尾輪蟲(張家楫)；后來Koste、章宗涉和黃祥飛等根據(jù)蟲體前端棘刺的兩側(cè)是否對(duì)稱和眼點(diǎn)的形狀把B.urceus分為B.urceolaris和B.rubens兩種，因此種的界定標(biāo)準(zhǔn)仍存在模糊不清之處，因此傳統(tǒng)鑒定方法滿足不了鑒定要求，并且內(nèi)部咀嚼器的超微結(jié)構(gòu)需要電子顯微鏡的輔助，鑒定困難
發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5基因的部分DNA測(cè)序及鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法，本鑒定方法使用實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增輪蟲線粒體上ND5 DNA序列，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、連接、克隆、轉(zhuǎn)化、測(cè)序，將序列進(jìn)行比對(duì)分析來鑒別輪蟲的種類。對(duì)輪蟲進(jìn)行分子生物學(xué)的種類鑒定，解決了利用形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)存在的鑒定困難，使得在大規(guī)模培養(yǎng)輪蟲的過程中，減少種群混雜帶來的種群競(jìng)爭(zhēng)而造成輪蟲減產(chǎn)甚至大量死亡的可能性。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5基因的部分DNA測(cè)序方法，包括以下步驟:A、臂尾輪屬輪蟲總DNA提取；B、PCR引物擴(kuò)增及序列測(cè)定；C、系統(tǒng)發(fā)生分析。所述步驟 B 中 PCR 引物為:ND5W1: 5’ -TTTC (AT) GCTTT (GA) GTTCATTCTTC-3’ 和C03B: 5’ -GTCTACCTCA(AG)TAAAT-3’ ；擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，48°C退火50s，68°C延伸3min,共15個(gè)循環(huán)；95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，48°C退火50s，68°C延伸3min，延伸時(shí)間每個(gè)循環(huán)加5s，共15個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin，4°C保存。一種鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法，使用臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5基因的部分DNA序列進(jìn)行鑒定進(jìn)行鑒定。基于線粒體ND5基因的 部分DNA序列鑒定臂尾輪屬輪蟲，結(jié)果準(zhǔn)確可靠；本方法中所設(shè)計(jì)的PCR引物可以擴(kuò)增出紅臂尾輪蟲、方形臂尾輪蟲、鐮形臂尾輪蟲、裂足臂尾輪蟲、尾突臂尾輪蟲、肛突臂尾輪蟲的線粒體ND5 DNA，利用對(duì)ND5 DNA比對(duì)結(jié)果(包括A、C、G、T堿基的含量、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)等)進(jìn)一步分析了有爭(zhēng)議種類的分類地位以及對(duì)輪蟲種群之間的親緣關(guān)系及輪蟲的系統(tǒng)進(jìn)化做出分子生物學(xué)的解釋，可對(duì)紅臂尾輪蟲Brachionusrubens、方形臂尾輪蟲Brachionus quadridentatus、鍵形臂尾輪蟲Brachionus falcatus、裂足臂尾輪蟲Brachionus diversicornis、尾突臂尾輪蟲Brachionus caudatus、肛突臂尾輪蟲進(jìn)行精確鑒定。解決了利用形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)存在的鑒定困難，使得在大規(guī)模培養(yǎng)輪蟲的過程中，減少種群混雜帶來的種群競(jìng)爭(zhēng)而造成輪蟲減產(chǎn)甚至大量死亡的可能性。
具體實(shí)施例方式本鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法所用生物材料為紅臂尾輪蟲Brachionus rubens、方形臂尾輪蟲Brachionus quadridentatus、鍵形臂尾輪蟲Brachionus falcatus、裂足臂尾輪蟲Brachionus diversicornis、尾突臂尾輪蟲Brachionus caudatus、肛突臂尾輪蟲，挑取每種輪蟲單個(gè)個(gè)體,單克隆培養(yǎng),其中紅臂尾輪蟲、方形臂尾輪蟲采用Gilbert (1963)配方，其余幾種采用原地方水樣過濾后作培養(yǎng)液，溫度與采集時(shí)環(huán)境溫度基本保持一致，所用食物為以HB-4培養(yǎng)液培養(yǎng)的，處于指數(shù)生長(zhǎng)期的斜生柵藻，當(dāng)單個(gè)克隆輪蟲個(gè)體數(shù)目達(dá)到一定多的量的時(shí)候，用25 μ m孔徑濾網(wǎng)濾出輪蟲，并以無菌蒸餾水沖洗，Eppendof管收集，置于-20°C冰箱保存。總DNA提取:利用董云偉等(2002)的方法提取輪蟲DNA。采用WizardTM基因組DNA純化試劑盒(p0rmega，USA)提取輪蟲DNA。將凍存的輪蟲從_20°C冰箱中取出，離心數(shù)秒，吸去多余水分。加入60 μ I核裂解液(nuclear lysis solution),輕彈離心管以使輪蟲懸浮均勻，在4°C放置lOmin，取出，65°C水浴40min，取出冷卻至室溫，加入20μ I蛋白沉降液(protein precipitation solution),劇烈震蕩 IOs,冰浴 5min, 13000g 離心 4min ;小心吸取上清，加入60 μ I異丙醇，2.5μ I糖原(20mg/ml, Sigma, USA)，小心混勻，_70°C放置30min, 13000g離心20min，然后棄去上清，用70%酒精洗滌兩次。在無菌室將其吹干，然后加入50 μ I無菌雙蒸水，4°C放置過夜以溶解DNA。PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定:擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR引物設(shè)計(jì)如下:ND5W1:5’ -TTTC (AT) GCTTT (GA) GTTCATTCTTC-3’ 和 C03B:5’ -GTCTACCTCA(AG) TAAAT-3’，引物于上海Invitrogen公司合成；PCR反應(yīng)體系的總體積為25 μ 1，包括I XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus), 0.4 mmol/L dNTP, 1.5ymol/L 引物，DNA 模板 2 μ 1，IU 的 TaKaRa La Taq 酶，超純水補(bǔ)至25μ1;擴(kuò)增反應(yīng)程序如下:95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，48°C退火50s，68°C延伸3min，共15個(gè)循環(huán)；95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，48°C退火50s，68°C延伸3min,延伸時(shí)間每個(gè)循環(huán)加5s，共15個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin，4°C保存。擴(kuò)增完成后，用BBI試劑盒純化PCR產(chǎn)物，取2 μ I于1%的瓊脂糖凝膠電泳上檢查，其余_20°C保存?zhèn)溆茫粚⒓兓a(chǎn)物用TaKaRa Pmd 18_T Vector克隆；最后送上海生工測(cè)序。系統(tǒng)發(fā)生分析:對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理并分析，序列編輯使用CLUSTAL X (1.81)軟件(Thompson, 1999)進(jìn)行DNA序列比對(duì)。通過引物測(cè)得輪蟲ND5序列如下:紅臂尾輪蟲: TTTCagctttagttcattcttctactctagttacttcaggtttatatttaataatgcgtttttcttatcttctttatagatcttatactttaatgaaagtgttattaattttaagattgtttacttctttctatgctggtataaattctatctttgaaaaagattaaagaaaataattgccttatctactttaagtcatttagggtttattggtatggcgttttctgcaggtcttttacaattggccttctttcatatacttactcacgctctttttaagtctcttctttttataactataggtgatattatgatcaatttaaatcattctcaagatattcgttatttgtcttctggtatgctttatactcctatgtcttgtcttgttatatatgtttctattcttaatttattaggtttacctaatttaagtgggtatttttctaaagatttagttttagagataatgaattattcttcttcatctattctagtaatagtagttttatttttaaatgttttttttacttattattatacttatcaattgtttttttattcttttcaacctattaaagttcttccatatcaaaatttccatgctcctatactatttcacacagtttgtttgttttttatagctgtttcgactttggtgtttggtttcttttttataagacatatttgttcttttattttattttatcctgttccaactgtaaataagtggttacctttatttctaaatataatgatgtttttagttcttttttaaataaaaaactttttacttctaatcatcctttaattaattattacttttctaatatgatatatctttctaacattatgttgacggctagttctaatttatattatagtttaggttttatgttagtgaagtcggttgaattaggtattttcaattacacgttaaactcttttactaaa方形臂尾輪蟲:TTTCAGCTTTGGTTCATTCTTCTACTCTAGTTACCGCGGGTTTATACTTAATAATACGTTTTTCTTATCTATTATATAGTTCTTATTTTTTAATAAAACTATTGCTAATTTTAAGCCTTTTTACTTCTTTTTATGCTGGAATAAATGCTATCTTTGAAAAAGATTTAAAAAAAATAATTGCTTTATCTACCCTCAGGCATTTAGGGTTTATTGGAATGGCTTTCTCTGTTGGCTTATTGCAATTAGCATTTTTTCACATACTGACCCACGCCCTTTTTAAATCTTTATTATTCATGACTATAGGGGATATTATAATTAATTTAAATCACTCTCAAGATATCCGTTATTTGTCTTCCGGGATACTATACACTCCTATATCCTGTATAATTATGTATGTGTCAATTTTAAATTTATTAGGAATGCCTAACCTTAGGGGTTATTTTTCAAAGGATTTAGTACTAGAAATAATAAATTACTCTAATGTCTCCTTCTTAGTTATAGGGGTTTTATTTCTTAATGTTTTTTTTACTTACTATTATACTTATCAACTATTTTTTTATTCTTTTCAACCTCTAAAGGTTTACCCTTACCAAAACTTTCATTCTCCTATGTACATCCATACTTTAGGTCTTTTTATTATGGCCTGTTCAACTCTAGTGTTTGGCTATTTCTTTTTGAGCCATATTTGTTACACTGTAATTTACTACCCTATTCCTGTGCTTATTAAATCCTTGCCATTTATTAT 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TGGTTTATTAAATTATGTTTTGAATATTTACTCCTCT肛突臂尾輪蟲:TTTCAGCTTTGG·TTCATTCTTCTACCCTTGTAACATCTGGTTTGTATCTTATAATACGTTTTTCTTACCTTTTGTATTCCTCTTATTTTCTAATAAAAATACTTCTAATTTTAAGACTATTC ACTTCTTTTTATGCTGGTATAAACGCTATTTTTGAAAAGGATTTAAAAAAAATGATTGCTTTGTCTACTCTTAGTCATTTAGGTTTCATTGGTATGTCTTTTTCAGTAGGTTTACTACAATTGGCTTTTTTTCATATATTAACACACGCTTTATTCAAATCTCTTCTTTTCATAACAATAGGTGATATTATGATTAACTTAAACCATTCTCAAGATATTCGTTATTTATCTTCTGGTTCTATTTACACTCCTATATCTTGTATAGTTATATATGTTTCTATTGTAAATTTATTGGGTTTACCTAATCTAAGTGGCTATTTCTCTAAAGATTTAGTATTAGAAATAATAAACTATTCTAATATGTCTTTTATTGTTATATTAGTATTATTTTTAAATGTATTTTTTACTTACTATTATACTTACCAGCTTTTCTTTTATTCTTTTCAACCTATTAAAGTTTTTCCTTATCAAAATTTTCATTCTCCAATTCTTTTTCATTCCATTCTATTATTAATTATAAGTATTTCCACTTTGTTATTTGGCTTCTTTTTCATTAGTCACATTTGTAGTTATATTTTATTTTACCCTGTCCCTATTTTATCTAAAAGTTTACCTATAATTATTAACTTTTTAATATTTTCAATTCTTCTTTTAAACTCAAAGCTATTTACTTCTAATAATCCTTTAGTTAATTACTATTTTTCTAATATGATATACCCTTCTAACTTATTGTTAACTATAAGGTCTAATATATATTATAATGTAGGTTTTATGTTAGTTAAATCAATTGAATTGGGAGCTTTTAATTATTCTGTTAATTTCTACACTAGT
權(quán)利要求
1.一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5基因的部分DNA測(cè)序方法，包括以下步驟: A、臂尾輪屬輪蟲總DNA提取； B、PCR引物擴(kuò)增及序列測(cè)定； C、系統(tǒng)發(fā)生分析。
2.按權(quán)利要求1所述的測(cè)序方法，其特征在于:所述步驟B中PCR引物為:ND5W1:5’-TTTC(AT)GCTTT (GA)GTTCATTCTTC-3’ 和 C03B: 5’ -GTCTACCTCA (AG)TAAAT-3’。
3.按權(quán)利要求1所述的測(cè)序方法，其特征在于:所述步驟B中擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，48°C退火50s，68°C延伸3min，共15個(gè)循環(huán)；95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，48°C退火50s，68°C延伸3min，延伸時(shí)間每個(gè)循環(huán)加5s，共15個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin，4°C保存。
4.一種鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法，使用臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5基因的部分DNA序列進(jìn)行鑒定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5基因的部分DNA測(cè)序及鑒定臂尾輪屬輪蟲的方法，測(cè)序方法步驟包括臂尾輪屬輪蟲總DNA提取、PCR引物擴(kuò)增及序列測(cè)定、系統(tǒng)發(fā)生分析；鑒定方法使用臂尾輪屬輪蟲的線粒體ND5 DNA進(jìn)行鑒定。本測(cè)序方法中所設(shè)計(jì)的PCR引物可以擴(kuò)增出紅臂尾輪蟲等的線粒體ND5 DNA，測(cè)序結(jié)果可用于對(duì)紅臂尾輪蟲等進(jìn)行精確鑒定，解決了利用形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)存在的鑒定困難，使得在大規(guī)模培養(yǎng)輪蟲的過程中，減少種群混雜帶來的種群競(jìng)爭(zhēng)而造成輪蟲減產(chǎn)甚至大量死亡的可能性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103088125SQ20121056296
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月22日
發(fā)明者程雙懷, 張逸, 夏夢(mèng)寧, 劉應(yīng)龍, 盧燕梅, 閆錦錦, 張寧 申請(qǐng)人:安徽師范大學(xué)