本發(fā)明屬于環(huán)境修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用微生物——白腐真菌粗酶液降解四溴雙酚a的方法。
背景技術(shù)：
四溴雙酚a（tetrabromobisphenola，tbbpa），是目前比較常見(jiàn)的一種溴類阻燃劑，作為反應(yīng)型阻燃劑，可用于環(huán)氧樹(shù)脂、聚氨酯樹(shù)脂等；作為添加型阻燃劑可用于聚苯乙烯、san樹(shù)脂及abs樹(shù)脂等。作為常見(jiàn)的溴類阻燃劑，其污染危害是顯而易見(jiàn)的。長(zhǎng)期接觸溴化阻燃劑會(huì)妨礙大腦和骨骼發(fā)育；且在被焚化處理時(shí)，會(huì)釋放出溴化的二惡英和呋喃，二者均為極易致癌物質(zhì)。由于四溴雙酚a的大量使用及其生物富集性，已經(jīng)在多種環(huán)境介質(zhì)和生物樣品中被檢測(cè)到，如大氣、水體、土壤及沉積物等，一些暴露于阻燃劑的特定人群的組織、血液、母乳及普通人群甚至于北極都已檢測(cè)到四溴雙酚a的存在。因此尋求一種去除效率高、方便、安全且無(wú)污染的降解方法勢(shì)在必行。目前常用的降解方法有物理降解、光化學(xué)降解以及生物降解，無(wú)疑生物降解法最綠色環(huán)保，因而也最受環(huán)境科學(xué)工作者的青睞。錢(qián)艷園等篩選得到了四溴雙酚a的好氧降解菌并用于對(duì)tbbpa的降解研究；文俊平等則篩選得到了兩株厭氧降解菌對(duì)四溴雙酚a進(jìn)行降解。
白腐真菌是能夠引起木質(zhì)白色腐朽的絲狀真菌的統(tǒng)稱，多數(shù)在木材或者土壤中營(yíng)腐生生活，因其對(duì)眾多污染物尤其是難降解有機(jī)物強(qiáng)大的降解作用而成為環(huán)境污染控制領(lǐng)域最受關(guān)注的研究對(duì)象之一。黃孢原毛平革菌作為白腐真菌的模式菌株，對(duì)眾多難降解污染物都有顯著的降解效果。已有研究表明，黃孢原毛平革菌對(duì)難降解物質(zhì)的作用主要源于其自身分泌的豐富酶系，主要包括胞內(nèi)分泌的p450酶、胞外分泌的錳過(guò)氧化物酶（mnp）和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（lip），酶促反應(yīng)具有高效綠色安全的特點(diǎn)，因此考慮對(duì)白腐真菌分泌的粗酶液進(jìn)行提取用以對(duì)四溴雙酚a進(jìn)行生物降解。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)在現(xiàn)有技術(shù)對(duì)四溴雙酚a降解過(guò)程中存在的工作量大、成本高、處理量低、步驟繁瑣等問(wèn)題，提供一種利用白腐真菌粗酶液降解四溴雙酚a的方法。
具體步驟為：
(1)白腐真菌的培養(yǎng)
接種白腐真菌凍干粉于土豆葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，在35~39℃培養(yǎng)3~7d后，在無(wú)菌條件下于2~6℃保存，作為活化后的菌種孢子待用，接種時(shí)用無(wú)菌水將待用的活化后的菌種孢子沖下，接種至液體土豆葡萄糖培養(yǎng)基，置于34~39℃、110~140r/min條件下振蕩培養(yǎng)4~6d，接種時(shí)控制od值為1.5，得到接種有白腐真菌的培養(yǎng)基。
(2)白腐真菌胞外粗酶液的制備
將步驟(1)得到的接種有白腐真菌的培養(yǎng)基移至離心杯，以2500~3500r/min的速度離心5~15min，得到上清液和菌絲體，去除下層菌絲體，將上清液在3~4℃下以8000~9000r/min的速度離心6~20min，上清液的離心操作次數(shù)為1~2次，離心操作后的上清液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾得到白腐真菌胞外粗酶液，0~6℃保存?zhèn)溆谩?/p>
(3)四溴雙酚a的降解
將0~2ml濃度為1~2mmol/l的mnso4溶液、0~0.3ml體積百分比濃度為20%~40%的h2o2、1.0~1.5mlph值為4.5的酒石酸-酒石酸鈉緩沖溶液、6~8ml步驟(2)制得的白腐真菌胞外粗酶液和4~5μl濃度為10g/l的四溴雙酚a-甲醇溶液混合，建立總體積為10ml的胞外酶液反應(yīng)體系混合液，經(jīng)2~5d，即實(shí)現(xiàn)四溴雙酚a的降解。
本發(fā)明方法利用白腐真菌依靠胞外酶降解環(huán)境污染物的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一種利用白腐真菌粗酶液降解四溴雙酚a的方法，所選取的處理材料僅為微生物，生長(zhǎng)繁殖快、方便取用、成本低廉，生物酶具有高效催化能力。此外，操作較為簡(jiǎn)便，而且成本比較低，處理量較大。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例：
為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、達(dá)成目的與作用更加清楚及易于了解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，所列實(shí)施例僅在于說(shuō)明本發(fā)明而不限制本發(fā)明。
(1)白腐真菌的培養(yǎng)
接種白腐真菌凍干粉于土豆葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)5d后，在無(wú)菌條件下于4℃保存，作為活化后的菌種孢子待用，接種時(shí)用無(wú)菌水將待用的活化后的菌種孢子沖下，接種至液體土豆葡萄糖培養(yǎng)基，置于37℃、130r/min條件下振蕩培養(yǎng)5d，接種時(shí)控制od值為1.5，得到接種有白腐真菌的培養(yǎng)基。
(2)白腐真菌胞外粗酶液的制備
將步驟(1)得到的接種有白腐真菌的培養(yǎng)基移至離心杯，以3000r/min的速度離心10min，得到上清液和菌絲體，去除下層菌絲體，將上清液在4℃下以9000r/min的速度離心10min，離心操作后的上清液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾得到白腐真菌胞外粗酶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
(3)四溴雙酚a的降解
將1ml濃度為1mmol/l的mnso4溶液、0.1ml體積百分比濃度為30%的h2o2、1.4mlph值為4.5的酒石酸-酒石酸鈉緩沖溶液、7.5ml步驟(2)制得的白腐真菌胞外粗酶液和5μl濃度為10g/l的四溴雙酚a-甲醇溶液混合，建立胞外酶液反應(yīng)體系混合液，經(jīng)3d，即實(shí)現(xiàn)四溴雙酚a的降解。
經(jīng)測(cè)試，本實(shí)施例中四溴雙酚a的降解率為66.1%。