專利名稱：激光掃描共聚焦顯微鏡掃描畸變現(xiàn)象的全場(chǎng)校正方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種激光掃描共聚焦顯微鏡的全場(chǎng)校正技術(shù)。
背景技術(shù)：
隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，高圖像分辨率的顯微鏡成為科學(xué)工作者進(jìn)行科研的有效工具。20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的激光掃描共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy-LSCM)是當(dāng)今生物學(xué)的研究領(lǐng)域中的一種先進(jìn)的圖像采集和分析儀器，被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞骨架研究、生理生化研究、基因定位及染色體三維作圖、胚胎學(xué)研究、植物學(xué)研究等等。傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡由于衍射極限的限制其空間分辨率受到了限制，而激光掃描共聚焦顯微鏡利用激光作為照明光源，在傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上采用了共軛聚焦的原理和掃描成像裝置，大大提高了其空間分辨率，同時(shí)由于系統(tǒng)是在光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)完成的因此其對(duì)工作環(huán)境無特殊要求，相比其他高分辨率顯微鏡其測(cè)量過程的相對(duì)簡(jiǎn)單。
激光共聚焦掃描顯微鏡是由光學(xué)系統(tǒng)、電子控制系統(tǒng)及軟件系統(tǒng)三個(gè)子系統(tǒng)構(gòu)成，其工作原理如附圖1所示，激光器3發(fā)出的照明激光束經(jīng)過分光鏡4和掃描鏡5后由顯微鏡6會(huì)聚在位于物鏡焦點(diǎn)的試樣7上，試樣表面的被激光照射的點(diǎn)會(huì)反射出沿各個(gè)方向的光線，其中一部分光線經(jīng)顯微鏡、分光鏡后再通過檢測(cè)針孔光欄2，由檢測(cè)器1接收，形成試樣表面被激光照射點(diǎn)的圖像。在激光束掃描過程中，只有顯微物鏡的焦平面上被激光掃描的點(diǎn)反射出的光線能夠到達(dá)檢測(cè)器，其它位置發(fā)出的光線均被檢測(cè)針孔光欄阻擋，這種阻擋非焦面光線干擾的共焦成像方式能得到更高的成像質(zhì)量。通過旋轉(zhuǎn)安裝在電機(jī)上的掃描鏡可將激光點(diǎn)在試樣表面沿X、Y方向逐點(diǎn)掃描，從而得到一幅待測(cè)試樣表面的掃描圖像。
LSCM的掃描過程主要是通過電子控制系統(tǒng)來控制兩塊掃描鏡來完成掃描，形成平面掃描圖像系統(tǒng)。作為激光共聚焦顯微鏡的核心部件，要求掃描速度快且無掃描畸變。實(shí)際的系統(tǒng)中掃描鏡是采用步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)，步進(jìn)電機(jī)在使用中其可控角是以步為單位的，即其角度是跳躍式變化的，且每一個(gè)步長(zhǎng)也并非完全相等，因此在這種高精度的控制條件下會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)角誤差。這種誤差就會(huì)引起掃描控制單元的畸變，最終導(dǎo)致掃描圖像出現(xiàn)畸變。
因此我們必須對(duì)這種畸變進(jìn)行校正，由于這種畸變的產(chǎn)生主要是由于步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)過程中的誤差引起的，所以目前傳統(tǒng)的方法都是從步進(jìn)電機(jī)角度入手，對(duì)步進(jìn)電機(jī)的誤差進(jìn)行修正或者消除。傳統(tǒng)的步進(jìn)電機(jī)的誤差的校正方法有采用高精度的步進(jìn)電機(jī)，根據(jù)要求精度可以盡量選用精度高誤差小的步進(jìn)電機(jī)，來降低系統(tǒng)的畸變現(xiàn)象，但是這種方法并沒有根除步進(jìn)電機(jī)的誤差只是通過采用高精度的步進(jìn)電機(jī)來降低誤差出現(xiàn)的幾率；設(shè)計(jì)高精度的控制電路來控制步進(jìn)電機(jī)的誤差，常見的如細(xì)分驅(qū)動(dòng)方式，通過減小步進(jìn)電機(jī)的步長(zhǎng)來減小步長(zhǎng)不均勻所引起的誤差，但是這種方法也有其局限性，即在高速轉(zhuǎn)動(dòng)中電機(jī)的步距的不均勻性會(huì)引起很高的振動(dòng)，導(dǎo)致系統(tǒng)的不穩(wěn)定性，因此采用這種方法會(huì)降低掃描的速度；現(xiàn)在最有效最常用的辦法就是對(duì)電機(jī)進(jìn)行閉環(huán)控制，通過電路控制來得到一個(gè)補(bǔ)償電流，通過在原始電流基礎(chǔ)上增加這個(gè)補(bǔ)償電流來實(shí)現(xiàn)對(duì)電機(jī)誤差的控制，此方法在實(shí)現(xiàn)起來相對(duì)復(fù)雜，需要復(fù)雜的電路設(shè)計(jì)，同時(shí)對(duì)誤差的修正只能是一種離線狀態(tài)的修正，其電路一旦設(shè)計(jì)完成，就不可再改變，因此不能處理在工作狀態(tài)下復(fù)雜的誤差現(xiàn)象，而且這種校正更多的是一種平均化的結(jié)果，無法實(shí)現(xiàn)逐點(diǎn)全場(chǎng)的校正。
上述方法只能在一定限度內(nèi)消除誤差，但是對(duì)這種誤差的量化就束手無策，同時(shí)采用的方法也多為離線的修正，不能在實(shí)際工作狀態(tài)下校正，因此在實(shí)際掃描過程中尤其是高速掃描的過程中這種圖像畸變現(xiàn)象無法得到修正。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種激光掃描共聚焦顯微鏡中掃描畸變的全場(chǎng)的校正方法，即通過掃描云紋和云紋相移技術(shù)，將激光掃描共聚焦顯微鏡中的掃描畸變場(chǎng)直接測(cè)量出來，實(shí)現(xiàn)激光掃描共聚焦顯微鏡中掃描畸變的校正，消除LSCM圖像的特征扭曲。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種激光掃描共聚焦顯微鏡掃描畸變現(xiàn)象校正方法，其特征在于該方法按如下步驟進(jìn)行a.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)一維光柵樣品柵距ps和激光掃描共聚焦顯微鏡掃描所使用的掃描線數(shù)N，按照公式 (l是云紋條數(shù))計(jì)算形成掃描云紋時(shí)所需要的掃描區(qū)域L的大?。籦.在待標(biāo)定激光掃描共聚焦顯微鏡中按步驟a計(jì)算出的掃描區(qū)域?qū)?biāo)準(zhǔn)一維光柵樣品進(jìn)行掃描，并形成掃描云紋，記錄云紋圖像；c.利用激光掃描共聚焦顯微鏡中的載物臺(tái)對(duì)光柵樣品做平移使樣品發(fā)生ps/4，ps/2，3ps/4的位移量，使得記錄下來的云紋條紋的光強(qiáng)函數(shù)的相移量為π/2，π，3π/2，記錄下各個(gè)相位下的云紋圖像；d.根據(jù)云紋相移方法的理論，用各幅圖像中的光強(qiáng)函數(shù)計(jì)算出第一幅云紋圖的相位函數(shù)；e.由步驟d得到的相位函數(shù)畫出相位圖；f.對(duì)步驟e得到的相位圖作解包裹處理得到原始的相位圖和相位函數(shù)；g.根據(jù)上邊得到相位函數(shù)(x)，由云紋方法的原理，按照公式 求出樣品的位移場(chǎng)v(x，y)，該位移場(chǎng)v(x，y)就是所需要求的激光掃描共聚焦顯微鏡中掃描控制單元的畸變場(chǎng)本發(fā)明同現(xiàn)有方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及突出性效果本發(fā)明通過掃描云紋和云紋相移技術(shù)，將激光掃描共聚焦顯微鏡中的掃描畸變場(chǎng)直接測(cè)量出來。具有精度高、操作簡(jiǎn)單、實(shí)時(shí)測(cè)量且可進(jìn)行全場(chǎng)測(cè)試等特點(diǎn)。


圖1為激光掃描共聚焦顯微鏡的工作原理圖。
圖2為理想情況下的掃描云紋示意圖。
圖3為掃描畸變現(xiàn)象示意圖。
圖4為一維標(biāo)準(zhǔn)光柵樣品在LSCM中形成的掃描云紋圖。
圖5為通過云紋相移方法求得的相位圖。
圖6為對(duì)圖5解包裹后的相位圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和具體實(shí)施方法作進(jìn)一步的說明。
為達(dá)到上述發(fā)明目的。本發(fā)明需采用一維標(biāo)準(zhǔn)光柵試件，用LSCM掃描云紋方法得到掃描云紋，再通過云紋相移方法得出全場(chǎng)區(qū)域的位移場(chǎng)信息，從中提取出掃描控制單元的畸變信息，從而達(dá)到校正的目的。掃描云紋方法是基于傳統(tǒng)云紋方法原理的一種在高倍顯微鏡中實(shí)現(xiàn)的幾何云紋方法，主要原理是在樣品表面通過刻蝕或者轉(zhuǎn)移光柵的方法形成一塊試件柵，同時(shí)由于顯微鏡的掃描線是按照一定的規(guī)律逐行掃描，因此在快速的掃描過程中會(huì)在試件表面形成一塊參考柵，兩塊柵疊加就會(huì)形成幾何云紋，通過傳統(tǒng)的云紋公式就可以得到樣品的變形情況。云紋相移技術(shù)是通過移動(dòng)試件柵或者參考柵來使得云紋條紋的光強(qiáng)中的相位發(fā)生變化，通過多步相移得到的云紋條紋來一次求解出光強(qiáng)函數(shù)中的相位，由于樣品的變形與相位有關(guān)，就可以得到樣品的變形信息。
在本發(fā)明中，我們采用光柵樣品作為參考柵，掃描線所形成的虛柵作為試件柵，在沒有掃描控制單元的畸變現(xiàn)象引起的掃描畸變的時(shí)候，得到的云紋條紋應(yīng)該為完全水平的等寬度的條紋，如圖2所示。而由于掃描畸變現(xiàn)象，在實(shí)際掃描中掃描線形成的虛柵會(huì)出現(xiàn)扭曲的現(xiàn)象，如圖3所示(虛線為正常的掃描線，實(shí)線為發(fā)生畸變后的掃描線)。我們以這種扭曲的虛柵作為變形后的試件柵，認(rèn)為無畸變影響的虛柵為變形前的試件柵，所以變形場(chǎng)實(shí)際上就是掃描線的畸變場(chǎng)，也就是我們需要校正的掃描控制單元的畸變現(xiàn)象。
采用的光柵樣品其柵距為ps，空間頻率為fs。掃描區(qū)域的長(zhǎng)度為L(zhǎng)，掃描線數(shù)為N，則根據(jù)云紋方法的原理在觀察區(qū)域出現(xiàn)兩條云紋條紋時(shí)有應(yīng)變ϵy=psL,]]>由上式就可以得到 進(jìn)一步可知，當(dāng)掃描區(qū)域內(nèi)有條紋出現(xiàn)時(shí)各參量之間應(yīng)滿足 其中l(wèi)是云紋條數(shù)，由前面的等式根據(jù)ps值和掃描線數(shù)N，就可以確定掃描區(qū)域的大小。
圖4所示為根據(jù)上邊計(jì)算結(jié)果調(diào)整LSCM參數(shù)最終得到的云紋條紋圖，此云紋條紋的光強(qiáng)函數(shù)可以表示為I(x，y)＝I0(x，y){1+b(x，y)cos[(x，y)+δ]}，其中I0(x，y)是背景光強(qiáng)，b(x，y)是交流光強(qiáng)分布，(x，y)是相位函數(shù)，δ為相移量。通過在LSCM中調(diào)整樣品臺(tái)的位置使光柵樣品發(fā)生ps/4，ps/2，3ps/4的位移量，由云紋的透射函數(shù)的關(guān)系可以知道，當(dāng)光柵樣品發(fā)生上述位移時(shí)，云紋條紋場(chǎng)的光強(qiáng)函數(shù)的相位發(fā)生π/2，π，3π/2得相移量。初始的云紋條紋的相移量為0，則得到的4幅云紋條紋圖的條紋光強(qiáng)函數(shù)分別為I1(x，y)＝I0(x，y){1+b(x，y)cos[(x，y)]}I2(x，y)＝I0(x，y){1+b(x，y)cos[(x，y)+π/2]}I3(x，y)＝I0(x，y){1+b(x，y)cos[(x，y)+π]}I4(x，y)＝I0(x，y){1+b(x，y)cos[(x，y)+3π/2]}聯(lián)立上述方程可以解出相位函數(shù) 上邊求得的相位函數(shù)(x)其取值區(qū)間在[-π，+π]之間的相位圖如圖5所示，對(duì)求得的該相位圖進(jìn)行解包裹得到實(shí)際的通過灰度變化表示的相位圖，如圖6所示。
由云紋方法的原理知道，相位函數(shù)和變形場(chǎng)之間存在著對(duì)應(yīng)關(guān)系 其中v(x，y)為位移場(chǎng)。因此通過相位函數(shù)就求出變形場(chǎng)，此變形場(chǎng)就是我們所需要校正的掃描控制單元的畸變現(xiàn)象所引起的畸變場(chǎng)。到此就完成了對(duì)激光掃描共聚焦顯微鏡的掃描控制單元的畸變形象的全場(chǎng)校正。
權(quán)利要求
1.一種激光掃描共聚焦顯微鏡掃描畸變現(xiàn)象校正方法，其特征在于該方法按如下步驟進(jìn)行a.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)一維光柵樣品柵距ps和激光掃描共聚焦顯微鏡掃描所使用的掃描線數(shù)N，按照公式L＝ps(N(l-1))計(jì)算形成掃描云紋時(shí)所需要的掃描區(qū)域L的大小，l是云紋條數(shù)；b.在待標(biāo)定激光掃描共聚焦顯微鏡中按步驟a計(jì)算出的掃描區(qū)域?qū)?biāo)準(zhǔn)一維光柵樣品進(jìn)行掃描，并形成掃描云紋，記錄云紋圖像；c.利用激光掃描共聚焦顯微鏡中的載物臺(tái)對(duì)光柵樣品做平移使樣品發(fā)生ps/4，ps/2，3ps/4的位移量，使得記錄下來的云紋條紋的光強(qiáng)函數(shù)的相移量為π/2，π，3π/2，記錄下各個(gè)相位下的云紋圖像；d.根據(jù)云紋相移方法的理論，用各幅圖像中的光強(qiáng)函數(shù)計(jì)算出第一幅云紋圖的相位函數(shù)；e.由步驟d得到的相位函數(shù)畫出相位圖；f.對(duì)步驟e得到的相位圖作解包裹處理得到原始的相位圖和相位函數(shù)；g.根據(jù)上邊得到相位函數(shù)(x)，由云紋方法的原理，按照公式 求出樣品的位移場(chǎng)v(x，y)，該位移場(chǎng)v(x，y)就是所求的激光掃描共聚焦顯微鏡中掃描控制單元的畸變場(chǎng)。
全文摘要
激光掃描共聚焦顯微鏡掃描畸變現(xiàn)象的全場(chǎng)校正方法，采用標(biāo)準(zhǔn)光柵試件，用LSCM掃描云紋方法得到掃描云紋圖像，再通過云紋相移技術(shù)對(duì)原始圖像進(jìn)行四步相移處理得到相移云紋圖像，根據(jù)云紋相移理論由相移得到的云紋圖得出相位圖，解包裹后得到原始相位圖，根據(jù)相位和位移場(chǎng)的關(guān)系得到掃描畸變場(chǎng)，從而達(dá)到校正的目的。本發(fā)明同現(xiàn)有方法作比較，有如下顯而易見的突出特點(diǎn)和顯著優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明通過掃描云紋和云紋相移技術(shù)，將掃描控制單元的畸變現(xiàn)象引起的掃描線的畸變場(chǎng)直接測(cè)量出來。具有精度高、操作簡(jiǎn)單、實(shí)時(shí)測(cè)量且可進(jìn)行全場(chǎng)測(cè)試等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G02B21/00GK1851522SQ20061001200
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月26日
發(fā)明者謝惠民, 花韜, 方岱寧, 潘兵 申請(qǐng)人:清華大學(xué)