專(zhuān)利名稱(chēng)：一種大樣本快速三維顯微成像的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及顯微成像方法及系統(tǒng)，具體地說(shuō)是指一種適用于大樣本的，基于結(jié)構(gòu)光三維層析的顯微光學(xué)成像方法及系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
在光學(xué)顯微鏡領(lǐng)域，人們一直追求能在更大的成像區(qū)域內(nèi)對(duì)獲取樣本的三維細(xì)節(jié)信息。但這一目標(biāo)受到三方面的因素的制約，一是散射光的存在會(huì)導(dǎo)致背景光的產(chǎn)生，導(dǎo)致傳統(tǒng)顯微鏡成像除了得到物鏡焦面上的信息，還會(huì)疊加上來(lái)自其它區(qū)域的模糊背景，無(wú)法獲得樣本的三維層析圖像；二是受限于顯微物鏡的視場(chǎng)和成像速度，對(duì)于厘米級(jí)大樣本的顯微成像通常需要數(shù)十天，這不僅是對(duì)成像系統(tǒng)穩(wěn)定性和壽命本身是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)，成像樣本也很難在成像環(huán)境下長(zhǎng)時(shí)間保持性狀不變；三是標(biāo)記樣本的成像信號(hào)強(qiáng)度會(huì)由于蛋白的光漂白效應(yīng)而在整個(gè)成像過(guò)程中不斷下降，成像時(shí) 間越長(zhǎng)，曝光量越大，光漂白對(duì)成像的負(fù)面影響越大。
美國(guó)專(zhuān)利US6376818中描述結(jié)構(gòu)光顯微成像作為一種具有獲得光學(xué)斷層成像數(shù)據(jù)的成像技術(shù)，基于面掃探測(cè)方式使其具有對(duì)樣本進(jìn)行快速成像的潛力。目前的結(jié)構(gòu)光顯微鏡的大都基于光柵作為光源的調(diào)制器，使用壓電位移的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)構(gòu)照明光的相移， 這使得結(jié)構(gòu)光顯微鏡的成像速度嚴(yán)重受限于光柵機(jī)械位移的速度，一般情況只有I赫茲左右。另一類(lèi)基于數(shù)字微鏡陣列的結(jié)構(gòu)光顯微鏡中(例如中國(guó)專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)?00810071628. 5， 201110448980. 8)，探測(cè)器進(jìn)行曝光期間，數(shù)字微鏡驅(qū)動(dòng)版通過(guò)產(chǎn)生一系列的脈寬調(diào)制信號(hào) (PWM)控制每個(gè)微鏡開(kāi)關(guān)狀態(tài)的占空比，數(shù)字微鏡時(shí)刻在翻轉(zhuǎn)，在不同的兩個(gè)狀態(tài)下不停切換，產(chǎn)生256級(jí)不同亮度灰度圖案。雖然數(shù)字微鏡陣列中單個(gè)微鏡的切換速度可達(dá)數(shù)萬(wàn)赫茲，但這種灰度調(diào)制方式將其有效調(diào)制速度限制在數(shù)十赫茲的水平上。且微型反射鏡不斷的翻轉(zhuǎn)，使得即使在最亮的灰度級(jí)數(shù)下，灰度調(diào)制的微鏡陣列也無(wú)法將照明光全部反射至， 照明光的利用率較低，降低了結(jié)構(gòu)光照明圖案的調(diào)制深度，影響了成像速度和成像效果。
綜上所述，現(xiàn)存的針對(duì)大樣本的三維顯微成像方法和系統(tǒng)存在以下不足(1)成像速度慢，對(duì)于結(jié)構(gòu)光顯微鏡，其成像速度主要受限于調(diào)制器的有效調(diào)制頻率；(2)光漂白影響成像質(zhì)量。這些問(wèn)題在實(shí)際應(yīng)用中限制了此類(lèi)方法的發(fā)展和應(yīng)用，因此發(fā)展一種適用于大樣本的快速三維顯微成像方法和系統(tǒng)很有必要。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的提供一種大樣本快速三維顯微成像的方法和系統(tǒng)，目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中成像速度慢，對(duì)樣本光漂白嚴(yán)重，機(jī)械加工對(duì)樣本形態(tài)的影響的缺點(diǎn)。
一種大樣本快速三維顯微成像的方法，其特征在于包括以下步驟
(I)樣本包埋在樣本塊中，固定在精密三維電動(dòng)平移臺(tái)之上；
(2)數(shù)字微鏡陣列工作在二值調(diào)制的模式下，作為結(jié)構(gòu)光顯微鏡中的空間光調(diào)制器，對(duì)于照明光進(jìn)行二值調(diào)制，形成結(jié)構(gòu)光條紋，結(jié)構(gòu)光顯微鏡采集樣本表層I 一 100微米的深度內(nèi)的圖像；
(3)完成成像區(qū)域內(nèi)表層的成像后，利用金剛石或硬質(zhì)合金刀具，去除樣本塊表層已成像部分；
(4)重復(fù)步驟(2)和步驟(3)，直到完成數(shù)據(jù)獲取任務(wù)。
所述步驟(2 )具體方法為
(a)數(shù)字微鏡陣列工作在二值調(diào)制的模式下指當(dāng)面陣相機(jī)進(jìn)行曝光時(shí)，數(shù)字微鏡陣列中的每個(gè)微型反射鏡都工作在穩(wěn)定狀態(tài)下，不進(jìn)行任何翻轉(zhuǎn)，出射光在物鏡焦面只有亮和暗兩種狀態(tài)，分別對(duì)應(yīng)微型反射鏡固定在入射光出射和非出射兩種角度的狀態(tài)，不存在灰度的變化；
(b)當(dāng)曝光完成后，數(shù)字微鏡陣列的微鏡進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，改變至下一相位圖案，同時(shí)觸發(fā)面陣相機(jī)進(jìn)行再次曝光，重復(fù)該過(guò)程直到完成結(jié)構(gòu)光成像所需的0、2/3pi和4/3pi三幅不同相位圖像的采集；
(c)步驟(b)完成后，數(shù)字微鏡陣列中的微鏡統(tǒng)一翻轉(zhuǎn)至入射光非出射的角度上， 阻擋照明光照射到樣本上；
(d)壓電位移器帶動(dòng)物鏡進(jìn)行軸向移動(dòng)，使物鏡焦面對(duì)準(zhǔn)同一個(gè)成像子區(qū)域的更深層樣本進(jìn)行成像。
(e)采集得到的圖像存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)硬盤(pán)或者內(nèi)存中，利用公式
權(quán)利要求
1.一種大樣本快速三維顯微成像的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)樣本包埋在樣本塊中，固定在精密三維電動(dòng)平移臺(tái)之上； (2)數(shù)字微鏡陣列工作在二值調(diào)制的模式下，對(duì)照明光進(jìn)行二值調(diào)制，形成結(jié)構(gòu)光條紋，結(jié)構(gòu)光顯微鏡采集樣本表層I 一 100微米深度內(nèi)的圖像； (3)完成成像區(qū)域內(nèi)表層的成像后，利用金剛石或硬質(zhì)合金刀具，去除樣本塊表層已成像部分； (4)重復(fù)步驟(2)和步驟(3)，直到完成數(shù)據(jù)獲取任務(wù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的大樣本快速三維顯微成像的方法，其特征在于所述步驟(2)具體方法為 (a)數(shù)字微鏡陣列工作在二值調(diào)制的模式下指當(dāng)面陣相機(jī)進(jìn)行曝光時(shí)，數(shù)字微鏡陣列中的每個(gè)微型反射鏡都工作在穩(wěn)定狀態(tài)下，不進(jìn)行任何翻轉(zhuǎn)，出射光在物鏡焦面只有亮和暗兩種狀態(tài)，分別對(duì)應(yīng)微型反射鏡固定在入射光出射和非出射兩種角度的狀態(tài)，不存在灰度的變化； (b)當(dāng)曝光完成后，數(shù)字微鏡陣列中的微鏡進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，改變至下一相位圖案，同時(shí)觸發(fā)面陣相機(jī)進(jìn)行再次曝光，重復(fù)該過(guò)程直到完成結(jié)構(gòu)光成像所需的0、2/3pi和4/3pi三幅不同相位圖像的采集； (c)步驟(b)完成后，數(shù)字微鏡陣列中的微鏡統(tǒng)一翻轉(zhuǎn)至入射光非出射的角度上，阻擋照明光照射到樣本上； (d)壓電位移器帶動(dòng)物鏡進(jìn)行軸向移動(dòng)，使物鏡焦面對(duì)準(zhǔn)同一個(gè)成像子區(qū)域的更深層樣本進(jìn)行成像； Ce)采集得到的圖像存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)硬盤(pán)或者內(nèi)存中，利用公式
3.一種大樣本快速三維顯微成像系統(tǒng)，包括光源、光導(dǎo)、一塊激發(fā)濾光片、一塊發(fā)射濾光片、三塊透鏡、數(shù)字微鏡陣列、二塊反射鏡、一塊二向色鏡、壓電位移器、物鏡、精密三維電動(dòng)平移臺(tái)、面陣相機(jī)、數(shù)字微鏡陣列驅(qū)動(dòng)板、壓電位移驅(qū)動(dòng)器、平臺(tái)控制器、圖像采集卡、計(jì)算機(jī)、金剛石或硬質(zhì)合金刀具，其特征在于計(jì)算機(jī)分別與數(shù)字微鏡陣列驅(qū)動(dòng)板、壓電位移驅(qū)動(dòng)器、平臺(tái)控制器、圖像采集卡相連，數(shù)字微鏡陣列與數(shù)字微鏡陣列驅(qū)動(dòng)板相連，壓電位移器與壓電位移驅(qū)動(dòng)器相連，精密三維電動(dòng)平移臺(tái)與平臺(tái)控制器相連，面陣相機(jī)與圖像采集卡相連，面陣相機(jī)受數(shù)字微鏡陣列驅(qū)動(dòng)板輸出的觸發(fā)脈沖信號(hào)控制采集時(shí)刻；由光源出射的光耦合入光導(dǎo)中，均勻化后經(jīng)由激發(fā)濾光片、第一透鏡進(jìn)行準(zhǔn)直，第一反射鏡將光束反射至數(shù)字微鏡陣列中，當(dāng)數(shù)字微鏡陣列中的微鏡處于12狀態(tài)時(shí)，被微鏡反射的光線經(jīng)由第二反射鏡被第二透鏡收集，經(jīng)過(guò)二向色鏡反射后進(jìn)入固定在壓電位移器上的物鏡中；樣本固定在精密三維電動(dòng)平移臺(tái)之上，樣本接受激發(fā)光后發(fā)出的光經(jīng)物鏡、二向色鏡，第三透鏡和發(fā)射濾光片，最后在面陣相機(jī)上成像；金剛石或硬質(zhì)合金刀具固定在鋼制刀架上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大樣本快速三維顯微成像系統(tǒng)，其特征在于所述的光源為L(zhǎng)ED、鹵素?zé)艋蚬療簟?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大樣本快速三維顯微成像系統(tǒng)，其特征在于所述的光導(dǎo)為光纖或液態(tài)光導(dǎo)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大樣本快速三維顯微成像系統(tǒng)，其特征在于所述的面陣相機(jī)為電荷耦合元件CCD相機(jī)或互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體CMOS相機(jī)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大樣本快速三維顯微成像的方法及系統(tǒng)，本發(fā)明方法(1)樣本包埋在樣本塊中固定在精密三維電動(dòng)平移臺(tái)上；(2)數(shù)字微鏡陣列工作在二值調(diào)制的模式下，對(duì)照明光進(jìn)行二值調(diào)制，形成結(jié)構(gòu)光條紋，結(jié)構(gòu)光顯微鏡采集樣本表層1－100微米深度內(nèi)的圖像；(3)完成成像區(qū)域內(nèi)表層的成像后，利用金剛石或硬質(zhì)合金刀具，去除樣本塊表層已成像部分；(4)重復(fù)步驟(2)和步驟(3)，直到完成數(shù)據(jù)獲取任務(wù)。本發(fā)明的數(shù)字微鏡陣列工作在二值調(diào)制的模式下，有效加快成像速度；通過(guò)數(shù)字微鏡陣列與面陣相機(jī)的曝光同步方法，使得只有在面陣相機(jī)曝光時(shí)樣本才會(huì)接受到激發(fā)光的照射，進(jìn)一步降低樣本的曝光量，避免光漂白效應(yīng)對(duì)成像帶來(lái)負(fù)面影響。
文檔編號(hào)G02B21/06GK102928970SQ201210402820
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者駱清銘, 龔輝, 許冬力, 李安安 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)