專利名稱：一種細胞dna文庫及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，特別是涉及一種細胞DNA文庫的構建方法以及由該方法制備得到的細胞DNA文庫。
背景技術：
表觀遺傳學是基于非基因序列改變所引起的基因表達水平的變化，組蛋白修飾 (Histone modification)和DNA甲基化(DNA methylation)是表觀遺傳的兩種主要形式。 組蛋白是染色體基本結構單位，其末端可發(fā)生多種修飾作用從而引起染色體結構的改變， 并調(diào)節(jié)相關基因的表達。DNA甲基化則是在不改變DNA序列的情況下，通過被修飾堿基介導的DNA空間結構的變化，引起相關基因的沉默或表達。組蛋白修飾與DNA甲基化修飾在生物體發(fā)育過程中共同發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，并通過拮抗或協(xié)同等多種方式相互聯(lián)系，形成表觀遺傳作用網(wǎng)絡。通過組蛋白化學修飾的形式來確定特定的基因組區(qū)域在特定時間的表達情況及其它功能的調(diào)節(jié)方式稱為組蛋白密碼(Jenuwein Tand Allis C,Translating the histone code. Science, 2001,293 :1074 ；Cosgrove Mand Wolberger C, How does the histone code work ？ Biochemistry and CellBiology，2005，83 :468-476.)。對組蛋白密碼的深入研究有助于了解組蛋白修飾模式對染色體結構及基因表達的調(diào)控。組蛋白修飾生物學定義為在不同催化酶的作用下，如組蛋白甲基化酶、組蛋白乙酰化酶等在組蛋白的N-末端或C-末端添加不同的化學基團的過程。組蛋白的修飾作用是可逆的，主要包括甲基化(methylation)、乙酰化(acetylation)、泛素化 (ubiquitination)、磷酸化(phosphorylation)等四種修飾方式(Strahl B and Allis C, The language of covalent histone modifications. Nature, 2000,403 :41-45.)四禾中修飾作用中，以甲基化和乙酰化修飾研究最為廣泛與深入。泛素化修飾主要發(fā)生在組蛋白 H2A、H2B的賴氨酸殘基上，包括單泛素化(monoubiquitous)和多泛素化(ployubiquitous) 兩種形式，在細胞周期中起到重要的調(diào)節(jié)作用，并且與組蛋白甲基化修飾密切相關(Shukla A, Chaurasia P and Bhaumik SR, Histone methylation and ubiquitination with theircross-talk and roles in gene expression and stability. Cell Mol Life Sci, 2009,66 :1419-1433 ；Agus D,Matthew C and Matthew S,A modified cross talkbetween histone H2BK123 ubquitination and H3K79 methylation. JBC，2010.)。磷酸化修飾主要發(fā)生在組蛋白的絲氨酸Ger)殘基上，在干細胞分化過程中起調(diào)節(jié)作用。甲基化和乙酰化修飾主要發(fā)生在組蛋白H3、H4的賴氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)殘基上。其中甲基化修飾又包括單甲基化(monomethylation)、雙甲基化(dimethylation)和三甲基化 (trimethylation)三種形式，主要起到相關基因表達的激活或抑制作用(Rice JC and Allis CD, Histone methylationversus histone acetylation :new insights into epigenetic regulation.Curr Opin CellBiol, 2001,13 :263-273)。組蛋白修飾與DNA甲基化對染色質(zhì)穩(wěn)定性及基因表達模式均起到至關重要的調(diào)節(jié)作用，兩者的調(diào)節(jié)作用并不是孤立的，而是通過DNA甲基化酶與組蛋白修飾相關酶類，以及眾多蛋白因子之間的相互作用而發(fā)生聯(lián)系的。通常情況下DNA甲基化是在DNA甲基化酶 (DNA methyltransferase，DWT)的催化下，以 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine， SAM)為甲基供體，將甲基基團(-CH3)添加到DNA分子特定堿基上的過程。真核生物中DNA 甲基化發(fā)生于5’ -CpG-3’中胞嘧啶的第五位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。人類基因組中，70% 80%的CpG雙核苷酸處于DNA甲基化狀態(tài)，未甲基化的CpG —般聚集成簇，形成 CpG島。CpG島一般位于結構基因啟動子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點，約有60%以上基因的啟動子含有CpG島。活性基因啟動子區(qū)域CpG島是未甲基化的，但在特定的情況下也會發(fā)生甲基化作用，進而導致基因的沉默，而去甲基化則可恢復基因表達。DNA甲基化對維持染色體結構、X染色體失活、基因印記都起重要作用(Jones P and Takai D，The role of DNA methylation in mammalian 印igenetics. Science，2001，293 :1068)，合適的DNA 甲基化水平和甲基化位點對于細胞的正常發(fā)育、分化是必須的。與正常體細胞相比，在腫瘤細胞中， DNA甲基化水平顯著降低，腫瘤細胞基因組甲基化的程度與正常細胞相比僅為20-60%，低水平的DNA甲基化導致基因組的不穩(wěn)定，多種致癌相關基因由表達抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚员磉_或過量表達狀態(tài)，同時伴隨局部區(qū)域的高甲基化，包括腫瘤抑制相關基因、細胞周期調(diào)節(jié)基因、DNA修復基因等，造成抑癌基因表達的丟失，最終導致癌癥的發(fā)生(Baylin S, DNA methylation and gene silencing in cancer. Nature Clinical Practice Oncology, 2005,2 :S4-S11 ；De Marzo A, Marchi V, YangE, et al. , Abnormal regulation of DNA methyltransferase expression duringcolorectal careinogenesis. Caneer research, 1999,59 :3855.)。 組蛋白修飾與DNA甲基化相互聯(lián)系，在染色體變構、干細胞分化、體細胞重編程， 癌癥發(fā)生等過程中發(fā)揮重要調(diào)控(cedar h and dergman y, LinkingDNA methylation and histone modification. Nuture review, 2009,10 :295-304) 如組蛋白 H3 第 4 位的賴氨酸(!KM)的甲基化修飾與基因活性表達相關，并對DNA甲基化有拮抗作用。H3K4的甲基化通過阻擾DNA甲基化酶(DNMT)的結合阻止DNA甲基化，從而促進相關基因的高水平表達(BarskiA, Cuddapah S, Cui K, et al. , High-resolution profiling of histone methylations inthe human genome. Cell, 2007，129 :823-837)。而組蛋白 H3第 9位賴氨酸 (H3K9)的甲基化卻可以吸引DNA甲基化酶的結合，從而與DNA甲基化發(fā)生協(xié)同作用，抑制相關基因的表達(Rosenfeld JA, Wang Z, Schones DE, et al. , Determination of enriched histone modifications in non-genic portions of thehuman genome. BMC Genomics, 2009,10 :143.)。活性表達基因一般是未甲基化的，但在內(nèi)環(huán)境改變或外界因素刺激情況下，基因啟動子區(qū)域的CpG島可以發(fā)生甲基化，并引起組蛋白去乙酰化酶(HDAC)的結合， 從而發(fā)生組蛋白的去乙酰化，進一步引起基因編碼區(qū)的甲基化，引起染色質(zhì)的高度折疊，最終形成異染色質(zhì)，導致基因永久性沉默(Baylin S，DNA methylation and genesilencing in cancer. Nature Clinical Practice Oncology，2005，2 :S4_S11)。在胚胎發(fā)育過程中， 多能干細胞通過關閉某些基因進而分化成為體細胞，表達基因的關閉即是由組蛋白修飾和DNA甲基化，以及相關蛋白因子共同作用導致和維持的(Meissner A，Mikkelsen T，Gu H, et al. , Genome-scale DNAmethylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature, 2008,454 :766-770)。因此，深入了解細胞分化過程中的組蛋白修飾模式與DNA甲基化修飾途徑后，通過向體細胞中添加特殊誘導因子anduction factor)，改變細胞內(nèi)組蛋白修飾模式和去除DNA甲基化，可以使體細胞發(fā)生重編程，重新形成全能或多能干細胞(Takahashi K and Yamanaka S, Induction ofpluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures bydefined factors. Cell,2006,126 663-676 ；Maherali N,Sridharan R,Xie W,et al·,Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling andwidespread tissue contribution. Cell Stem Cell,2007,1 :55-70.)。人工誘導多功能干細胞(Induced Pluripotent Stem cells iPS) 在疾病治療，尤其是癌癥治療方面具有重要意義。 鑒于組蛋白修飾與DNA甲基化在胚胎發(fā)育，個體發(fā)育，疾病發(fā)生過程中的重要作用，尤其是將組蛋白修飾與DNA甲基化相聯(lián)系，在基因組水平上構建生物的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡對于人類的疾病研究具有十分重要的意義。因此相關檢測技術的發(fā)展在一定程度上左右了研究者對表觀遺傳的相關研究。研究蛋白質(zhì)和DNA作用的傳統(tǒng)方法有凝膠阻滯技術， DNase I足跡法，以及染色質(zhì)免疫沉淀的方法。凝膠阻滯技術(Electrophoretic Mobility ShiftAssay, EMSA)是研究蛋白質(zhì)-DNA的經(jīng)典方法，可以對目標蛋白進行定性和定量分析 (Hellman L and Fried Μ,Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols, 2007, 2 :1849-1861.)。該技術的原理是蛋白質(zhì)-DNA復合體的電泳遷移率受到蛋白質(zhì)大小、電荷等因素影響，將顯著低于游離DNA，在凝膠電泳過程中條帶相對滯后。EMSA實驗通常是將純化的蛋白或細胞粗提液和32P同位素標記的DNA探針一同孵育，反應產(chǎn)物在非變性的聚丙烯凝膠上進行電泳， 蛋白質(zhì)-DNA復合物由于較慢的遷移率形成滯后的條帶。凝膠阻滯技術簡單易行，并且放射性同位素標記可以保證實驗的高靈敏度，僅需要少量蛋白和DNA即可以完成實驗。隨著技術的發(fā)展以及不同的實驗需求，凝膠阻滯實驗進行了相應的改進，可采用熒光、化學發(fā)光或免疫組化等檢測手段，避免同位素對環(huán)境身體有害的缺點。但凝膠阻滯實驗也存在局限性，最主要的是影響蛋白質(zhì)-DNA復合體遷移率的因素較多，并且根據(jù)實驗結果無法直接得到DNA的包括位置和序列的相關信息。DNase I足跡法的基本原理是用DNase I對末端標記的待測DNA酶切，使在DNA上形成隨機切口，而與蛋白質(zhì)結合的DNA由于空間阻隔，受到蛋白質(zhì)的保護，不會受到DNase I酶切，因此產(chǎn)物中未被酶切的DNA片段分離純化后，進行電泳和放射自顯影，可與對照組相比得到足跡部位的核苷酸序列(Res N, Biol P， Biotechnol N, et al.,1.GalasDJ, Schmitz A :DNAse footprinting :a simple method for the detection ofprotein-DNA binding specificity. Journal of Computer and System Sciences，2002，65 :73-96)。DNase I足跡實驗能夠粗略定位目標蛋白結合的DNA 并得到其堿基序列，提供大量的有效信息，但對蛋白質(zhì)的純度和量要求較高。以上兩種方法均為基于體外的蛋白質(zhì)-DNA研究方法，其局限性是不能充分反映生理情況下DNA與蛋白相互作用的真實情況，而且很難捕捉到在染色質(zhì)水平上基因表達調(diào)控的動態(tài)瞬時反應。 而ChIP (Chromatin Immunoprecipitation，染色質(zhì)免疫沉淀)是一種直接反映細胞內(nèi)蛋白和DNA相互作用的重要技術，在組蛋白修飾以及轉(zhuǎn)錄因子研究中應用十分廣泛(Im H， Grass J, Johnson K, et al. , Measurement of protein—DNA interactions in vivo by chromatinimmunoprecipitation. METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY-CLIFT0NTHEN T0T0WA-, 2004，284 :129-146)。該技術是在活細胞狀態(tài)下，采用甲醛固定蛋白質(zhì)和DNA的結合，然后通過超聲波打斷得到理想大小的染色質(zhì)片段后，再與特異性抗體進行抗體與目標蛋白的結合反應，從而獲得與目標蛋白結合的DNA進行后續(xù)研究。廣泛使用的ChIP方法還可以通過MNase I的特異性酶切獲得單核小體并通過特異的抗體富集與目標蛋白結合的DNA片段，進而分析目標蛋白和DNA相互作用關系。ChIP技術可以充分反映生理狀態(tài)下DNA與蛋白質(zhì)作用的真實情況，是目前用于研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用常用的方法。ChIP實驗可以記錄活細胞狀態(tài)下蛋白質(zhì)和DNA的相互作用，甚至能夠捕捉到發(fā)生在染色體水平上基因表達調(diào)控的瞬時事件。免疫沉淀中使用的特異性的抗體能夠精確的富集所研究的靶蛋白-DNA復合體。ChIP可以與生物芯片技術以及新一代測序技術結合，高通量的篩選與目標蛋白結合的DNA在基因組上的分布。在ChIP基礎上發(fā)展起來的ChIP on chip技術是 ChIP和芯片相結合的技術，可高通量的分析活體細胞中蛋白質(zhì)和基因組DNA之間的相互作用(Kuras L, Characterization of protein-DNAassociation in vivo by chromatin immunoprecipitation. METHODS I匪OLECULAR BIOLOGY-CLIFTON THEN T0T0WA，2004，284 : 147-162)。ChIP on chip的核心流程是染色體DNA進行ChIP實驗富集，緊接著與標記好的芯片雜交，從芯片數(shù)據(jù)的分析得到與目標蛋白結合的DNA序列信息。ChIP on chip盡管能獲得高分辨率的基因組圖譜，并可以確定與研究對象(如組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子)相互作用的 DNA序列信息，但芯片價值不菲，導致ChIPon chip技術成本昂貴，除此之外，海量的數(shù)據(jù)分析也是一個挑戰(zhàn)。 隨著DNA甲基化研究的深入，檢測DNA甲基化的方法也不斷涌現(xiàn)。其中一種常見的方法是基于甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶，該方法依賴于特定限制性內(nèi)切酶對甲基化位點的敏感，對甲基化區(qū)域不切割的特性，將DNA切割成大小不一的片度， 進一步通過二維電泳或者PCR技術分析。該技術包括甲基化敏感的限制性指紋技術 (MethyIation-sensitive restriction fingerprinting，MSRF)(Huang T，Laux D，Hamlin B，et al.，Identification of DNA methylationmarkers for human breast carcinomas using the methylation-sensitive restrictionfingerprinting technique. Cancer research，1997，57 :1030.)、限制性標記基因組掃描技術(Restriction landmark genomic scanning，RLGS) (Costello J，F(xiàn)riihwaIdM, Smiraglia D，et al.，Aberrant CpG-island methylation has non-random andtumour-type-specific patterns. Nature genetics， 2000，24:132-138.)、甲基化間區(qū)位點擴增技術(Amplification of intermethylated sites，AIMS)(Frigola J，Ribas M，Risques R，et al.，Methylome profiling of cancer cells by amplification ofinter-methylated sites (AIMS). Nucleic Acids Research， 2002,30 :e28)0依賴于限制性酶切的甲基化檢測技術雖然成本低廉，并可以檢測到全基因組所有的CpG島的甲基化情況，但由于限制性內(nèi)切酶本身的限制，可能會出現(xiàn)某些位點被遺漏或者不完全消化導致出現(xiàn)假陽性，除此之外，由于試驗方法和儀器設備的限制，基于酶切的限制性內(nèi)切酶的分析方法不能夠進行高通量的樣本分析。另外一種甲基化檢測方法基于亞硫酸氫鹽對甲基化和非甲基化胞嘧啶的不同作用，在亞硫酸氫鹽的作用下，甲基化修飾的胞嘧啶保持不變，而非甲基化修飾的胞嘧啶將發(fā)生脫氨基作用，轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)。因此，利用亞硫酸氫鹽處理的反轉(zhuǎn)堿基的作用，可以檢測到每個CpG位點的甲基化狀態(tài)，精確勾畫出某個基因或全基因組的甲基化全貌。傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化直接測序((Bisulfite sequencing)的方法隨著測序技術的改進，與新一代測序技術結合，可快速準確的得出大量的有效數(shù)據(jù)(Frommer M, McDonald L, MillarD, et al.，A genomic sequencing protocolthat yields a positive display of5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America, 1992,89 :1827)。傳統(tǒng)甲基化檢測方法和芯片技術的結合解決了通量問題。這種技術基于寡核苷酸微陣列雜交，可以在基因組中尋找甲基化位點，包括用于全基因組甲基化水平檢測的差異化雜交(Differential methylation hybridization usingCGI array, DMH) (Huang Τ, Perry M and Laux D, Methylation profiling of CpGislands in human breast cancer cells. Human molecular genetics, 1999,8 :459.),差異化雜交的芯片是CpG島微陣列，是依賴于甲基化敏感性限制性酶切和PCR技術的雜交法，能夠快速簡捷地富集高甲基化的CpG島。該方法可用于多樣本和多位點的甲基化分析，但由于仍不能解決酶切導致的假陽性問題。以及用于檢測單個甲基化位點的甲基化特異性微陣列 ((Methylation specificoligonucleotide, MS0)(Gitan R, Shi H, Chen C, et al. , Methy lation-specificoligonucleotide microarray -.a new potential for high-throughput methylationanalysis. Genome research, 2002,12 :158)。甲基化特異性微陣列是針對 CpG 二核苷酸位點的寡核苷酸微陣列，芯片的設計采用甲基化特異性PCR的原理，按照亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后非甲基化位點和甲基化位點的差異設計兩個寡核苷酸探針，采用亞硫酸氫鹽對目標DNA處理后，進行PCR擴增，并標記產(chǎn)物3’端后雜交，根據(jù)雜交后產(chǎn)生的熒光強度判斷目標DNA甲基化水平。甲基化特異性微陣列和其他基于芯片的甲基化檢測技術一樣，在通量方面有極大的提高，但芯片的成本阻礙了其廣泛的應用。除上述技術外，還有基于抗原抗體反應的甲基化DNA免疫沉淀技術(Methylated DNA Immunoprecipitation，MeDIP)和甲基化 DNA 結合蛋白的(Methylated DNA Binding Domain) WfF(Shiraishi Μ, Sekiguchi A, Oates A, et al. ，Methyl-CpG binding domain column chromatography as a tool forthe analysis of genomic DNA methylation. Analytical biochemistry, 2004, 329 :1)。這兩種方法都是依賴特異性的抗體或者特異性蛋白對甲基化DNA的富集作用，結合新一代測序技術，可以得出全基因組水平上DNA甲基化情況。這兩種方法與因為測序之前對基因組甲基化區(qū)域進行了富集，所以與亞硫酸氫鹽處理直接測序相比，測序成本較低，但只能得到基因組中甲基化情況的概況或者高度甲基化區(qū)域的情況，而不能精確到基因組單個堿基的甲基化情況。因此亞硫酸氫鹽處理技術仍然是繪制精細基因組甲基化圖譜必須的技術。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種能夠同時用于組蛋白修飾和DNA 甲基化研究的細胞DNA文庫構建方法以及由該方法制備得到的細胞DNA文庫。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案本發(fā)明公開了一種細胞DNA文庫構建方法，所述方法包括，對同一細胞樣本依次進行染色質(zhì)免疫共沉淀處理及亞硫酸氫鹽處理，并對處理后產(chǎn)物進行擴增得到所述細胞 DNA文庫。優(yōu)選的，所述方法包括步驟a、在活體細胞狀態(tài)下進行交聯(lián)反應，使DNA與DNA上結合的蛋白質(zhì)交聯(lián)固定；
b、將交聯(lián)固定后的染色質(zhì)打斷至片段長度為200 500bp ；C、采用染色質(zhì)免疫共沉淀的方法從打斷后的染色質(zhì)中分離得到與目的蛋白質(zhì)相結合的DNA片段；d、將分離的DNA片段采用亞硫酸氫鹽處理使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぁ＿M一步的，所述在步驟c之后及步驟d之前還包括步驟c+1，將分離的DNA片段進行末端修復，使其成為平末端，并在DNA片段3’末端加上“A”堿基，使其形成“T-A”粘性末端，然后連接甲基化測序接頭；在步驟d之后還包括步驟d+Ι，使用與甲基化測序接頭相匹配的引物進行PCR擴增得到所述細胞DNA文庫。更進一步地，所述步驟a中，進行交聯(lián)反應的活體細胞起始量為不低于10E6數(shù)量級，所述交聯(lián)反應為甲醛交聯(lián)反應，交聯(lián)反應所用甲醛的終濃度為0. 8-1. 2 %優(yōu)選1 %，甲醛交聯(lián)時間為5-20min優(yōu)選IOmin。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式中，所述步驟b中，染色體打斷采用非接觸式超聲破碎儀進行超聲波打斷，且超聲頻率為200w 320w，打斷條件為超聲25-35秒on/0. 5-3min off,共6-8個循環(huán)，優(yōu)選30秒on/2min off,共7個循環(huán)，；所述步驟c中，染色質(zhì)免疫共沉淀方法選用目的蛋白的特異性抗體及免疫磁珠來分離DNA片段，所述步驟c包括，將免疫磁珠與特異性抗體混合制備磁珠-抗體反應物，然后將步驟b打斷的染色質(zhì)與磁珠-抗體反應物混合進行免疫沉淀反應，之后進行反交聯(lián)反應，并純化得到與蛋白質(zhì)分離的DNA。在本發(fā)明一個具體的實施方式中，所述特異性抗體為H3Mme3，所述免疫磁珠為分別包被有protein A和protein G的protein A磁珠和protein G磁珠。所述抗體H3K4me3 的用量為3 4.5 μ g優(yōu)選4yg，protein A磁珠和protein G磁珠的用量為300 600 μ g 優(yōu)選600 μ g且兩者的用量比為1 1。所述反交聯(lián)反應的時間為2 1 優(yōu)選池。在本發(fā)明另一個具體的實施方式中，所述步驟d的亞硫酸氫鹽處理包括使用可溶性亞硫酸氫鹽使胞嘧啶磺酸化，對苯二酚脫氨基，再在堿性環(huán)境下，使磺基消失，成為尿嘧啶。本發(fā)明還公開了采用上述構建方法制備得到的細胞DNA文庫。由于采用了以上技術方案，使本發(fā)明具備的有益效果在于本發(fā)明的細胞DNA文庫構建方法，通過將研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的染色質(zhì)免疫沉淀技術和精確檢測甲基化位點的亞硫酸氫鹽處理直接測序的技術相結合，可以直接有效的檢測出與特定組蛋白修飾相結合的DNA甲基化狀況，通過對數(shù)據(jù)的分析從而得出特定組蛋白修飾和與DNA甲基化直接或間接地相互關系，從而深入研究組蛋白修飾及DNA甲基化在生物體內(nèi)的網(wǎng)絡作用，構建表觀遺傳調(diào)控圖譜；本發(fā)明的方法通過優(yōu)化，解決了傳統(tǒng)做法的染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗得到的產(chǎn)物量較少、無法用于常規(guī)亞硫酸氫鹽處理的問題，本發(fā)明通過優(yōu)化染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗方法增加其產(chǎn)物量，使其能夠達到亞硫酸氫鹽處理實驗的最低起始量的要求。


圖1為本發(fā)明染色質(zhì)免疫沉淀技術(ChIP)結合亞硫酸氫鹽(Bilsufite)處理的文庫構建技術流程圖。主要的實驗步驟依次為細胞處理(染色質(zhì)固定)、染色體的片段化、 染色質(zhì)免疫共沉淀、DNA片段末端處理與甲基化修飾接頭連接、亞硫酸氫鹽處理、PCR擴增
處理產(chǎn)物等。圖2為本發(fā)明實施例的樣品打斷效果檢測的電泳圖像。
具體實施例方式染色質(zhì)免疫共沉淀技術(ChIP)和亞硫酸氫鹽處理技術已經(jīng)分別成為研究組蛋白修飾和DNA甲基化的經(jīng)典方法。單獨的使用ChIP技術或是亞硫酸氫鹽處理技術只能從一個方面了解在研究對象體內(nèi)修飾組蛋白與DNA的結合區(qū)域或者是這個研究對象全基因組 DNA甲基化的狀況，而隨著表觀遺傳學的發(fā)展，為了更加透徹的系統(tǒng)的理解細胞內(nèi)表觀作用網(wǎng)絡，需要將表觀現(xiàn)象作為一個整體進行研究。因此，為了研究組蛋白修飾和DNA甲基化的相互關系，我們將研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的染色質(zhì)免疫沉淀技術和精確檢測甲基化位點的亞硫酸氫鹽處理直接測序的技術相結合，可以直接有效的檢測出與特定組蛋白修飾相結合的DNA甲基化狀況，通過對數(shù)據(jù)的分析從而得出特定組蛋白修飾和與DNA甲基化直接或間接地相互關系，從而深入研究組蛋白修飾及DNA甲基化在生物體內(nèi)的網(wǎng)絡作用，構建表觀遺傳調(diào)控圖譜。但是傳統(tǒng)做法的染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗得到的產(chǎn)物量較少 (很多時候都不到10ng，對于某些珍貴的材料來說，由于細胞樣品的量有限，得到的ChIP產(chǎn)物量更少)，而為了保證測序數(shù)據(jù)質(zhì)量亞硫酸氫鹽處理的起始量必須保證在IOOng以上，因此本發(fā)明為了將此兩種技術相結合，通過優(yōu)化染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗方法步驟增加其產(chǎn)物量使其能夠達到亞硫酸氫鹽處理實驗的最低起始量的要求。本發(fā)明的實驗步驟如圖1所示，詳細的實驗原理根據(jù)實驗步驟依次進行說明。一細胞處理根據(jù)免疫共沉淀實驗的要求(Hoffman B and Jones S, Genome-wide identification of DNA-protein interactions usingchromatin immunoprecipitation coupled with flow cell sequencing. Journal of Endocrinology, 2009, 201 :1),首先要在活體細胞狀態(tài)下將蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)固定，從而達到捕捉生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)與DNA作用情況的目的。采用甲醛處理細胞的方法可以使蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)，其原理是在甲醛的作用下，DNA堿基上的氨基或亞氨基和蛋白質(zhì)上的α-氨基及賴氨酸、精氨酸、組氨酸、色氨酸的側(cè)鏈氨基與另外的DNA和蛋白質(zhì)上的氨基或亞氨基交聯(lián)在一起形成蛋白質(zhì)-DNA復合體 (Merk 0 and Speit G,Significance of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks formutagenesis. Environmental and molecular mutagenesis, 1998, 32 :260-268),防止細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組分的重新分布，從而便于進行免疫沉淀反應。甲醛交聯(lián)反應是可逆的，便于在后續(xù)步驟中分別對DNA和蛋白質(zhì)進行分析。交聯(lián)反應所用甲醛的終濃度為1%，而交聯(lián)時間需要分析確定。交聯(lián)時間如果太長，交聯(lián)后的DNA-蛋白質(zhì)復合體難以被超聲破碎儀打斷，并且可能造成抗原表位丟失，影響后續(xù)免疫沉淀結果；交聯(lián)時間過短，則蛋白質(zhì)與 DNA無法形成較穩(wěn)定的結合，容易導致ChIP反應沉淀下來的DNA量不足以構建文庫，造成假陰性。本發(fā)明優(yōu)化的甲酸交聯(lián)時間為IOmin(Kim A,Kiefer CM andDean A,Distinctive signatures of histone methylation in transcribed coding andnoncoding humanbeta-globin sequences. Mol Cell Biol，2007，27 :1271-1279)。二染色體片段化根據(jù)免疫共沉淀與高通量測序的要求，需要將交聯(lián)固定后的染色體打斷到合適的片段長度以便于后續(xù)文庫構建與測序。本發(fā)明采用超聲方法打斷染色體，超聲打斷過程中會產(chǎn)生大量的熱引起樣品溶液溫度升高，容易造成蛋白質(zhì)變性不利于后續(xù)的免疫共沉淀操作。因此為了保證蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)，整個超聲打斷過程樣品均需處于冰浴狀態(tài)，且采用間斷超聲的方式，即超聲打斷與停止冷卻反復進行。超聲打斷的時間需要根據(jù)不同超聲破碎儀的參數(shù)與研究目的來確定，打斷時間太短會造成DNA片段太大，使得與DNA結合的蛋白質(zhì)抗原表位難以暴露，不利于抗體識別且不符合測序文庫要求；而打斷時間太長則會導致 DNA片段偏小，與蛋白質(zhì)的結合過于松散不利于免疫沉淀反應。除此之外，超聲時間過長還可能導致蛋白質(zhì)的變性失活，無法與采用的抗體結合，導致DNA無法被沉淀下來。本發(fā)明使用Bioruptor超聲破碎儀，功率輸出設置為“H”，打斷條件設定為30s on/2min off，共7個循環(huán)。細胞打斷后不進行離心(以避免染色體損失)，直接用dilution buffer稀釋，以得到更過的IP產(chǎn)物。三染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)免疫共沉淀是通過抗原抗體的特異性結合富集與目的蛋白質(zhì)相結合的DNA片段。 染色質(zhì)DNA片段后，根據(jù)研究選擇合適的組蛋白抗體，并根據(jù)抗體對ftOtein A與ftOtein G的親和力選擇合適的磁珠與用量比例。除了選擇合適的磁珠外，ChIP反應體系中抗體的量也是至關重要的。ChIP反應體系中抗體的量需要提前確定。若體系中抗體不足會造成 DNA不能完全沉淀，從而導致結果的假陰性或者DNA量達不到建庫要求；反之，若體系中抗體量過大，則過量的抗體會與部分非目標蛋白發(fā)生非特異性結合，導致假陽性的產(chǎn)生。本發(fā)明進行以下改進單個ChIP反應體系采用4 μ g鼠來源的H;3Mme3 (abl012)抗體，磁珠采用protein A與protein G各20 μ 1 (包被好的磁珠的濃度30ug/ul)進行混合。在做 ChIP實驗時，一定要做好實驗對照，因為沒有對照，很難對實驗結果的可靠性進行評估。陽性抗體和陰性抗體對照是最基本的實驗對照。陽性抗體通常選擇與已知序列相結合的比較保守的蛋白的抗體，陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG。通過陽性對照和陰性對照的設置可以檢測ChIP實驗的效果，從而保證整個實驗流程的有效性。另外，還應考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結合的可能，所以通常還會選擇一對陰性引物，即目的蛋白肯定不會結合的DNA序列，作為該抗體的陰性對照。除了設置陽性和陰性對照外，在進行免疫沉淀前，需要取一部分斷裂后的染色質(zhì)做Input對照。Input是斷裂后的基因組DNA， 需要與沉淀后的樣品DNA —起經(jīng)過逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，DNA純化，以及最后的PCR或其他方法檢測。 Input對照不僅可以驗證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)hput中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，檢測ChIP反應的富集效率。本發(fā)明取1/50的染色體打斷后樣品作為Input對照，與ChIP反應樣品一起進行反交聯(lián)處理，純化DNA片段，將純化后的 Input與ChIP樣品稀釋成相同濃度，取相同的量作為模板進行熒光定量PCR檢測，通過比較 ChIP樣品和Input的Ct值可以計算出ChIP反應的富集效率(Schemittgen TD,Livak KJ, Analyzing real-time PCR data by thecomparative Ct method,Nature protocol,2008, 13 :1101-1108.)，計算方法為富集效率=2" (Ct_Input_Ct_Sample)。四ChIPed DNA片段末端處理與甲基化接頭連接
由于ChIP沉淀下來的DNA片段是通過超聲的方法打斷的，需要對DNA末端進行修復，使其成為平末端。末端修復的目的是將雙鏈DNA片段損傷的5’端進行磷酸化，損傷的 3’端進行羥基化。末端修復完成后，通過向DNA片段3’末端加上一個“A”堿基，使其形成 “T-A”的粘性末端以便進行接頭連接。根據(jù)PCR擴增和測序的要求需要對DNA片段加上合適的接頭。一般情況下ChIP文庫只需要連接常規(guī)的測序接頭，但在本發(fā)明中要對得到的 DNA片段進行亞硫酸氫鹽翻轉(zhuǎn)處理，以研究DNA的甲基化情況，因此測序接頭的所有胞嘧啶位點必須都經(jīng)過甲基化修飾以防止亞硫酸氫鹽處理后無法進行PCR擴增與文庫構建。即連接的甲基化接頭可以保證DNA片段經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后接頭序列不變，但仍可與測序引物匹配，從而使染色質(zhì)免疫共沉淀與亞硫酸氫鹽處理有效的結合。五亞硫酸氫鹽翻轉(zhuǎn)處理亞硫酸氫鹽翻轉(zhuǎn)是采用亞硫酸氫鹽對單鏈DNA分子進行化學修飾，導致未甲基化胞嘧啶(C)可被亞硫酸氫鹽脫去氨基而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)，而5mC不能被修飾，仍保持為 5mC，在PCR反應過程中，尿嘧啶與腺嘌呤(A)配對，尿嘧啶則被胸腺嘧啶(T)取代。這一化學反應過禾呈首先由 Frommer 等A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosineresidues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A 89(1992) 1827-31)報導。具體過程為第一步，亞硫酸氫鈉使胞嘧啶磺酸化；第二步，對苯二酚脫氨基；第三步，在堿性環(huán)境下，磺基消失，成為尿嘧啶。例如，該實驗可由EZ DNA甲基化試劑盒-Gold(ZYM0 D5006)進行實施。六PCR擴增在DNA經(jīng)過亞硫酸氫鹽翻轉(zhuǎn)之后，PCR的目的是將單鏈的DNA片段變成雙鏈，同時擴增DNA的量。PCR擴增所用引物和亞硫酸氫鹽處理之后的接頭的序列相匹配。PCR擴增之后通過凝膠電泳回收的方式回收合適大小的DNA片段用于測序。膠回收采用Qiagen公司的QIAquick凝膠回收試劑盒。通過對上述步驟的終產(chǎn)物各項數(shù)據(jù)的進行分析后，可以直接有效的檢測出與特定組蛋白修飾相結合的DNA甲基化狀況，從而得出特定組蛋白修飾和與DNA甲基化直接或間接地相互關系，有助于闡明蛋白質(zhì)與DNA甲基化之間相互作用的機制以及基因表達抑制的調(diào)控關系。從而深入研究組蛋白修飾及DNA甲基化在生物體內(nèi)的網(wǎng)絡作用，構建表觀遺傳調(diào)控圖譜。下面通過具體實施方式
結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。實施例一材料和方法實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。培養(yǎng)健康人外周血細胞，命名為YH細胞。YH細胞培養(yǎng)使用 RPMI1640 (C22400500BT, Invitrogen)培養(yǎng)基(含 10% FBS (IO437OlO, Invitrogen))，YH 細胞屬于懸浮培養(yǎng)細胞，細胞培養(yǎng)瓶選用T-75。在倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，根據(jù)細胞培養(yǎng)基顏色變化進行傳代，當培養(yǎng)基顏色變?yōu)槠S時進行傳代。按照圖1的流程進行細胞處理、 文庫構建與相應的測序，詳細操作步驟如下1.細胞處理與交聯(lián)反應
用pH7. 4的PBS緩沖液(10010-031，Invitrogen)新鮮配制濃度為的甲醛溶液，37°C水浴鍋預熱待用。將細胞培養(yǎng)瓶從細胞培養(yǎng)箱中取出，并旋緊培養(yǎng)瓶蓋。在生物安全柜中進行以下操作用巴斯德吸管將培養(yǎng)瓶壁上的細胞吹勻，直接補充等體積的培養(yǎng)基進行傳代，后置于37°C，5% C02細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當收集細胞的時候，直接吹勻，并將細胞搜集到新的50ml離心管中，用血球計數(shù)板進行計數(shù)。本實驗經(jīng)過優(yōu)化后可以采用10E6 數(shù)量級細胞量起始，富集產(chǎn)物的量即能滿足進行亞硫酸氫鹽處理所需量。將收集的細胞在 4°C下850g離心5min，棄除細胞培養(yǎng)液，加入預熱的新鮮配制的甲醛溶液25ml，吹勻細胞，37°C細胞水浴鍋孵育10分鐘；立即在4°C下850g離心5min，棄除甲醛溶液，分別用預冷的 IOml PBS-BSA (用 PBS 配制，BSA 濃度為 5mg/ml。BSA 貨號為 0332_100g，AMRESC0)緩沖液及預冷的PBS緩沖液清洗細胞各一次；加入2ml冰預冷的PBS完全液(PBS-PIC，PIC即 protease inhibitor cocktail，Roche)，將細胞收集到2ml離心管中。850g離心1分鐘；移除上清，輕彈管壁使收集的細胞重懸于殘余的PBS中(可以在此步驟將處理好的細胞_80°C 凍存)。2.抗體準備根據(jù)本次實驗所用抗體Histone H3(tri methyl K4)antibody [mAbcaml012] (abl012，Abeam)，選擇 DynalBeads protein A(100. OlDInvitrogen)禾口 DynalBeads protein G(100. 03D, Invitrogen)(包被好的磁珠的濃度30ug/ul)，各取20 μ 1到新的 1. 5ml離心管中；加入500 μ 1冰預冷的PBS+BSA混合液，輕彈管壁，使磁珠重懸，并顛倒混勻；將離心管置于磁力架上2min，待磁珠吸附到磁力架上、上清變得澄清后，在磁力架上移除上清液。按上述步驟處理磁珠兩次，最后重懸磁珠于500 μ 1冰預冷的PBS+BSA混合液， 并加入 4yg Histone H3(tri methyl K4) [H3K4me3]抗體(ab8580，Abeam)，4°C垂直混合器上孵育反應5h。3.樣品打斷通過實驗條件的優(yōu)化，選擇Bioruptor超聲破碎儀作為染色質(zhì)打斷的儀器，與其他超聲儀相比，Bioruptor超聲破碎儀的穩(wěn)定性好，由于利用水波振蕩進行打斷，因此條件相對溫和，更加利于ChIP實驗，并且與探頭式超聲儀相比，Bioruptor打斷在封閉的離心管中進行，可以避免由于探頭浸入樣品中造成污染。提前半小時將向Bioruptor超聲破碎儀操作室中加入超純水，將冷循環(huán)儀打開， 使其降溫。新鮮制備 lysis buffer 完全液(1% SDS，IOmM EDTA, pH8. 150mM Tris-HCl, 1XPIC)，向步驟1中處理好的細胞中加入200μ1 lysis buffer完全液，輕彈管壁，使細胞重懸，冰置10-15min使細胞裂解；然后將其安裝到Bioruptor超聲破碎儀的適配器上 (Bioruptor UCD-200)。使用Biorupter超聲破碎儀打斷將功率輸出設置為“H” (該檔位功率為320w)，在控制旋鈕上將“On”時間設置為30s，“Off”時間設置為2min，共7個循環(huán)。此打斷條件可以使打斷的片段分布于200-500bp之間，取出1/50的量作為input，常規(guī) ChIP實驗一般是取用1/10的打斷樣品作為hput，用Input來檢測打斷的效果，本實驗由于起始細胞量少，所以只取出很少量的細胞作為hput，而用ChIP反應后的上清DNA用于檢測打斷效果，用 Dilution buffer (1 % triton, 2mMEDTA, 150mM NaCl,pH8. 120mM Tris-HCl) 將打斷后產(chǎn)物稀釋6-9倍，置于冰上備用。4.免疫共沉淀反應
取出Dynal beads與抗體反應物，置于磁力架上2分鐘，棄除上清液；加入500ul 冰預冷的PBS-BSA混合液，輕彈管壁重懸磁珠，并顛倒混勻；置于磁力架上anin ；在磁力架上移除上清液，重復處理一次，此處理的目的在于除去未與磁珠結合的抗體；將步驟3中處理好的樣品轉(zhuǎn)移加入磁珠中；4°C旋轉(zhuǎn)混合IP反應過夜。5.樣品反交聯(lián)取出染色質(zhì)免疫沉淀反應過夜的樣品，置于磁力架上2分鐘，將上清轉(zhuǎn)移；力口入 500 μ 1 RIPA buffer(50mM HEPES(H4034-25G，Sigma)，ImMEDTA(EB0185_500g，BBI)， 0.7 % Na Deoxycholate (D6750-100G，Sigma)，1 % NP-40(NDB0385-100ml, BBI),0.5M LiCl (LDB0307-250g, BBI))，輕彈管壁重懸磁珠，并顛倒混勻；置于磁力架上2min，棄除上清液；再加入500 μ 1 RIPAbuffer,輕彈管壁重懸磁珠，并在4°C旋轉(zhuǎn)混合20min ；置于磁力架上2min，棄除上清液；重復步驟兩次；加入500 μ 1 TE (ΑΜ9858，Ambion)，輕彈管壁重懸磁珠，并顛倒混勻；置于磁力架上2min，棄除上清液；再加入500 μ 1 TE (pH 8. 0)，輕彈管壁輕彈管壁重懸磁珠，并在4°C旋轉(zhuǎn)混合20min ；置于磁力架上aiiin，將上清液棄除干凈；將磁珠重懸于200 μ 1的反交聯(lián)buffer (1% SDS, 0. IM NaHCO3)中，將ChIP反應后上清，ChIP樣品與^iput同時65°C反交聯(lián)，反交聯(lián)時間由過夜縮短為3h，使整個建庫流程縮短1天，上清 DNA用于電泳檢測打斷的效果，結果如圖2顯示，本實驗打斷的主帶位于250-500bp之間。6.純化ChIP產(chǎn)物將反交聯(lián)樣品置于磁力架上aiiin，取出樣品，并用200 μ 1的純水洗磁珠，轉(zhuǎn)移出洗液與樣品混合。加入等體積的酚氯仿異戊醇05 24 1)抽提，HOOOrpm離心IOmin ；離心后吸取上層水相，加入2倍體積的無水乙醇，1/10體積的3Μ NaAc, 1 μ 1的 20ug/ul的糖原，_80°C超低溫冰箱放置20min，然后HOOOrpm離心lOmin，棄上清液；70% 乙醇清洗沉淀一次，HOOOrpm離心5min ；棄除上清，晾干沉淀，溶于25 μ 1 EB溶液中。抽取 Ιμ 樣品采用Qubit (Quant-it dsDNA HS Assary Kit)檢測樣品濃度，本實驗ChIP產(chǎn)物總量為83ng。7.末端修復預先從_20°C 保存的凍存盒中取出 lOXPolynucleotide Kinasebuffer (B904, Enzymatics)和IOmM dNTPs mix(N201L，Enzymatics)，將其置于冰上融解并充分混勻 10 XPolynucleotide Kinase buffer。取出 KlenowFragment (P706L, Enzymatics),用一新的PCR管取1 μ 1 Klenow Fragmen并按1 10稀釋成濃度為IU/ μ 1的工作液。在1. 5ml 的離心管中配制末端修復反應體系ChIP樣品DNA 20 μ 1 ； 10 XPolynucleotide Kinase BufferlOy 1 ； IOmM dNTPs mix 2μ 1 ； T4DNA Polymerase (P708L, Enzymatics) 1 μ 1 ；## 10 倍白勺 Klenow Fragmen 1 μ 1 ；Τ4 Polynucleotide Kinase(Y904L, Enzymatics)1 μ 1 ；辛卜水至總體系100 μ 1。將離心管在Iliermomixer中20°C溫浴30min后，用酚氯仿異戊醇 (25 4 1)抽提一次，并用乙醇沉淀DNA，最后溶于34 μ 1 EB中。8.末端加A預先從-20°C保存的凍存盒中取出IOXblue buffer (B011, Enzymatics)和 ImM dATP，將其置于冰盒上溶解并充分混勻。在1. 5mL的離心管中配制加“Α”反應體系末端修復的樣品 32 μ 1，IOXblue buffer (Β011，Enzymatics) 5 μ 1，dATP (28406501, Sigma) 10 μ 1 禾口 3μ 1 Klenow (3 ‘ -5，exo_) (P701-LC-L，Enzymatics),反應體系總體積為 50 μ 1。在Thermomixer中在37°C溫浴30min，用氯仿異戊醇抽提，乙醇沉淀，最后DNA溶于45 μ 1的 EB中。9.連接甲基化接頭預先從-20°C 保存的凍存盒中取出 2XRapid ligation buffer (ΒΙΟΙ, Enzymatics)禾口 PE Methylated Adapter (illumina methylated adapterME-100-0010, 其置于冰上融解并充分混勻2XRapid Iigationbuffer0取出PE Adapter用一新的PCR 管取IyL Adapter oligo mix按1 10稀釋成工作液。在1. 5mL離心管中配置如下反應體系加 A 后的樣品 45 μ L ;2 X Rapid ligation buffer 50 μ 1;稀釋 10 倍 PE Methylated Adapter 1 μ 1 ；H20 2μ L ； T4DNA Ligase (L603-HC-L, Enzymatics) 4 μ 1 ；總體積 100 μ 1。在在Thermomixer中在20°C溫浴15min，用氯仿異戊醇抽提，乙醇沉淀，最后DNA溶于45 μ 1 的超純水中。10.亞硫酸氫鹽處理本實驗使用ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit進行亞硫酸氫鹽處理，實驗步驟如下1)在PCR管中添加 130 μ 1 的CT Conversion Reagent 到每20 μ IDNA樣品中.如果DNA樣品的體積小于20 μ 1，則用水來彌補差量.通過輕彈試管或移液器操作來混合樣
P
ΡΠ O2)將樣品管放到循環(huán)變溫器并按以下步驟操作98°C放置10分鐘，64°C放置2. 5 小時，立刻進行下述操作或者在4°C下存儲(最多20小時).3)添加 600 μ 1 的 M-Binding Buffer 到 Zymo-Spin Column 中，并將柱放如試劑盒所提供的Collection Tube中.4)裝填樣品(從步驟2)到Zymo-Spin Column含有M-Binding Buffer.蓋上蓋將柱顛倒數(shù)次來混合樣品。5)全速(> 10，OOOxg)離心30秒.去除流出液。6)添加200 μ 1的M-Wash Buffer到柱中.全速離心30秒。7)添加 200 μ 1 的 M-Desulphonation Buffer 到柱中并且在室溫(20°C _30°C下放置15-20分鐘.在培養(yǎng)后，全速離心30秒。8)添加200 μ IM-Wash Buffer到柱中·全速離心30秒·再添加200 μ 1的M-Wash Buffer并且離心30秒·。9)直接添加20 μ 1的M-Elution Buffer到柱基質(zhì)中.將柱放置在1. 5ml的管中.全速離心來洗脫DNA。11. PCR從-20°C 保存的凍存盒中取出 PCR PE Primer 1. 1 禾口 PCR PE Primer 2. 1(Paired-End DNA Sample Pr印 Kit，PE-102-1001)，MgSO4(C11708-021，Invitrogen)， IOmM dNTP mix, IOXPfx amplication buffer (Cl 1708-021, Invitrogen)將其置于冰上化凍并充分混勻。在0. 2mL的PCR管中配制PCR反應體系樣品20μ 1 ； 10 X Pfx amplication buffer 5 μ 1 ；platinum PfxDNA Polymerase(C11708-021, Invitrogen)0. 5 μ 1 ；primer 1. l(10pmol/y 1)5μ 1 ；primer 2. 1 (lOpmol/μ 1) 5 μ 1 ；補水至總體積 50ul。配置完成后，首先在熱循環(huán)儀中94°C下反應2min，然后進行18個擴增循環(huán)，擴增程序為94°C變性15sec，62°C退火30sec，72°C延伸30sec，最后在72°C保持5min。反應結束及時將樣品取出放入4°C冰箱保存并按要求退出或關閉儀器。通過瓊脂糖凝膠電泳，選取合適大小的PCR 產(chǎn)物膠回收純化，用于Illumina公司HiSeq2000測序儀測序。本實驗中選取插入片段約為 150bp的PCR產(chǎn)物進行膠回收與文庫構建。二結果1、Sanger法測序庫檢對用本次發(fā)明的測序庫樣本制備技術所制備的測序庫進行克隆處理并使用 Sanger法進行小范圍的測序檢測。文庫檢測結果中有91 %的reads能比對回基因組區(qū)，且其甲基化化率為45% ；而99%的轉(zhuǎn)化率說明亞硫酸氫鹽(磺酸化)處理的效果(表1)非常顯著。因此，通過抗體富集與亞硫酸氫鹽處理可得到有效的序列信息。文庫檢測合格并構建Illumina公司Hiseq高通量測序的I^aired End DNA文庫與進行相應的測序。表2 1細胞H3Mme3抗體ChIP文庫Sanger法測序結果
權利要求
1.一種細胞DNA文庫構建方法，所述方法包括，對同一細胞樣本依次進行染色質(zhì)免疫共沉淀處理及亞硫酸氫鹽處理，并對處理后產(chǎn)物進行擴增得到所述細胞DNA文庫。
2.根據(jù)權利要求1所述的細胞DNA文庫構建方法，其特征在于所述方法包括步驟a、在活體細胞狀態(tài)下進行交聯(lián)反應，使DNA與DNA上結合的蛋白質(zhì)交聯(lián)固定；b、將交聯(lián)固定后的染色質(zhì)打斷至片段長度為200 500bp；c、采用染色質(zhì)免疫共沉淀的方法從打斷后的染色質(zhì)中分離得到與目的蛋白質(zhì)相結合的DNA片段；d、將分離的DNA片段采用亞硫酸氫鹽處理使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぁ?br> 3.根據(jù)權利要求2所述的細胞DNA文庫構建方法，其特征在于所述在步驟c之后及步驟d之前還包括步驟c+1，將分離的DNA片段進行末端修復，使其成為平末端，并在DNA片段3’末端加上“A”堿基，使其形成“T-A”粘性末端，然后連接甲基化測序接頭；在步驟d之后還包括步驟d+Ι，使用與甲基化測序接頭相匹配的引物進行PCR擴增得到所述細胞DNA文庫。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的細胞DNA文庫構建方法，其特征在于所述步驟a中，進行交聯(lián)反應的活體細胞起始量為不低于10E6數(shù)量級，所述交聯(lián)反應為甲醛交聯(lián)反應，交聯(lián)反應所用甲醛的終濃度為0. 8-1. 2%優(yōu)選1%，甲醛交聯(lián)時間為5-20min優(yōu)選lOmin。
5.根據(jù)權利要求4所述的細胞DNA文庫構建方法，其特征在于所述步驟b中，染色體打斷采用非接觸式超聲破碎儀進行超聲波打斷，且超聲頻率為200w 320w，打斷條件為超聲 25-；35 秒 on/0. 5_3min off,共 6-8 個循環(huán)，優(yōu)選 30 秒 on/2min off,共 7 個循環(huán)。
6.根據(jù)權利要求4所述的細胞DNA文庫構建方法，其特征在于所述步驟c中，染色質(zhì)免疫共沉淀方法選用目的蛋白的特異性抗體及免疫磁珠來分離DNA片段，所述步驟c包括，將免疫磁珠與特異性抗體混合制備磁珠-抗體反應物，然后將步驟 b打斷的染色質(zhì)與磁珠-抗體反應物混合進行免疫沉淀反應，之后進行反交聯(lián)反應，并純化得到與蛋白質(zhì)分離的DNA。
7.根據(jù)權利要求6所述的細胞DNA文庫構建方法，其特征在于所述特異性抗體為 H;3K4me3，所述免疫磁珠為分別包被有protein A和protein G的protein A磁珠和protein G磁珠，所述抗體H3Mme3的用量為3 4. 5 μ g優(yōu)選4 μ g，protein A磁珠和protein G磁珠的用量為300 600 μ g優(yōu)選600 μ g且兩者的用量比為1 1。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的細胞DNA文庫構建方法，其特征在于所述反交聯(lián)反應的時間為2 IMi優(yōu)選池。
9.根據(jù)權利要求2或3所述的細胞DNA文庫構建方法，其特征在于所述步驟d的亞硫酸氫鹽處理包括使用可溶性亞硫酸氫鹽使胞嘧啶磺酸化，對苯二酚脫氨基，再在堿性環(huán)境下，使磺基消失，成為尿嘧啶。
10.采用權利要求1 9任意一項所述的細胞DNA文庫構建方法制備得到的細胞DNA 文庫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細胞DNA文庫構建方法，包括對同一細胞樣本依次進行染色質(zhì)免疫共沉淀處理及亞硫酸氫鹽處理，并對處理后產(chǎn)物進行擴增得到所述細胞DNA文庫。本發(fā)明的方法，可以直接有效的檢測出與特定組蛋白修飾相結合的DNA甲基化狀況，從而深入研究組蛋白修飾及DNA甲基化在生物體內(nèi)的網(wǎng)絡作用，構建表觀遺傳調(diào)控圖譜。
文檔編號C40B50/06GK102534812SQ201010619688
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權日2010年12月31日
發(fā)明者卓著, 葉明芝, 張秀清, 楊煥明, 郜趙偉, 韓旭 申請人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司