專利名稱：農作物轉基因成份檢測法及所用芯片的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學檢測技術，尤其是涉及大豆、玉米等相關產品的轉基因成份檢測。
背景技術：
轉基因，是指運用科學手段從某種生物中提取所需的基因，將其轉 入另一種生物中，使之與另一種生物的基因進行重組，從而產生特定的具有優良遺傳性狀的物質。利用轉基因技術，可以改變動植物性狀、培育新品種；也可以利用其他生物體培育出人類所需要的生物制品，用于醫藥、食品等方面。轉基因是基因工程的重要組成部分。全球轉基因作物發展勢頭強勁。據專家提供的權威資料，2010 年全球轉基因作物種植面積達到1.48億公頃，是1996年的87倍，15年間年均增長近5倍。1996年全球種植轉基因作物的國家僅6個，2010年已達29個。4大主要轉基因作物種植面積也創新高。全球大豆面積的五分之四(81%)、棉花面積的三分之二(64%)、玉米面積的三分之一(29%)、油菜面積的四分之一(23%)種植的都是轉基因品種。全球有近40個國家和地區雖未正式批準轉基因作物商業化種植，但允許進行試驗研究或進口轉基因作物原料用于飼料和食品加工。2010年有8個歐盟成員國批準種植抗蟲玉米等轉基因作物；歐盟生物安全委員會宣布各國可自主決定是否種植轉基因作物；瑞典首次批準種植轉基因優質淀粉馬鈴薯。2008年全球轉基因作物產品總收益超過1300億美元。截至目前，中國共批準發放7種轉基因植物的農業轉基因生物安全證書，即1997年發放的耐忙存番爺、抗蟲棉花安全證書，1999年發放的改變花色矮牽牛和抗病辣椒(甜椒、線辣椒)安全證書，2006年發放的轉基因抗病番木瓜安全證書,2009年發放的轉基因抗蟲水稻和轉基因植酸酶玉米安全證書。根據中國農業生物技術學會數據顯示，2010年中國種植轉基因作物種植面積達到350萬公頃，排名世界第六。其中轉基因棉花約330萬公頃，其余是轉基因木瓜、轉基因番茄、轉基因辣椒等，所有作物都獲得農業部頒發的轉基因生物安全證書的農作物品種，是政策允許范圍內種植的。然而在安全性方面，有一些學者認為目前人類對基因的活動方式了解的還不夠透徹，對控制基因調整后的結果沒有十足的把握。當一種功能基因移入另一機體中，這種基因的功能可能發生不可預測的變化，而機體的相應反應更不可預測。對于轉基因作物的擔心主要有兩方面(1)轉基因生物對生物多樣性的影響；(2)轉基因生物對人體健康的威脅。由于基因工程是一個新的領域，人們還難以完全準確地預測到轉基因植物潛在危險性。雖然迄今已商品化的轉基因食品尚無對人體有毒副作用的報道，但并非轉基因植物完全沒有不可預見的負效應。2001年5月，我國《農業轉基因生物安全條例》開始實施，要求對大豆、玉米、油菜類轉基因食品必須加以標識。我國農業部2003年初在全國范圍內進行轉基因產品安全管理的執法大檢查。按照國家農業部第10號令《農業轉基因生物標識管理辦法》規定，自2003年3月20日起，國家對農業轉基因生物實行標識制度，要求對五大類17種農業轉基因生物進行標識。但真的要使這些法規、制度得以實施，關鍵還在于有一個有效的檢測技術。為此，科研人員分別從檢測外源蛋白和檢測外源DNA著手，建立了一系列檢測方法。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種靈敏度高、操作簡便、假陽性率低的農作物轉基因成份檢測法。為了解決上述技術問題，本發明提供一種農作物轉基因成份檢測法，包括以下步驟一、制備轉基因成份檢測芯片；針對轉基因農作物的內源、外源、品系這三類基因 ，選擇特異性探針，每條特異性探針5’進行氨基修飾；然后將氨基修飾后的探針固定醛基玻片上，預雜交后，得轉基因成份檢測芯片；二、檢測依次進行以下步驟I)、利用已知標準，獲取轉基因片段的引物；2)、農作物待測樣品中DNA的提取，得提取液；3)、靶基因的多重PCR擴增以步驟2)的提取液作為PCR模板，利用步驟I)所得的引物進行多重PCR擴增；得擴增產物；4)、芯片雜交檢測將擴增產物與轉基因成份檢測芯片雜交；然后進行熒光探針雜交，再利用T4DNA連接酶進行酶連接(即，利用T4DNA連接酶補齊)，接著用NaOH變性，最后用洗液洗滌；熒光探針為與特異性探針相對應的熒光探針；5)、雜交結果的檢測與分析用掃描儀掃描上述步驟4)所得的芯片，利用常規軟件對結果進行分析。作為本發明的農作物轉基因成份檢測法的改進步驟4)中進行熒光探針雜交的具體內容如下將濃度為2 3 μ M的每種熒光探針等體積混合后，得熒光探針混合液；將熒光探針混合液與雜交液按1:1體積比混合后，與前述步驟所得的已經與擴增產物雜交的轉基因成份檢測芯片進行雜交；47 49°C孵育29 31分鐘，室溫靜置8 12分鐘；雜交液由20 X SSC 100ml、10% SDS 4ml、10% BSA 40ml 和 dd H 20 276ml 組成。酶連接反應體系為0·05υ/μ1 Τ4連接酶反應液Ιμ ，Τ4 IOXBuffer 2μ I ;水(18. 2兆歐姆的水)補足到20 μ I ;NaOH變性為利用濃度為O. 3Μ的NaOH溶液洗滌4 6分鐘。作為本發明的農作物轉基因成份檢測法的進一步改進步驟4)中的洗液為洗液(2XSSC，0. 5% SDS)。作為本發明的農作物轉基因成份檢測法的進一步改進熒光探針如下表所示
權利要求
1.農作物轉基因成份檢測法，其特征是包括以下步驟 一、制備轉基因成份檢測芯片； 針對轉基因農作物的內源、外源、品系這三類基因，選擇特異性探針，每條特異性探針的5’進行氨基修飾；然后將氨基修飾后的探針固定醛基玻片上，預雜交后，得轉基因成份檢測芯片； 二、檢測 依次進行以下步驟 1)、利用已知標準，獲取轉基因片段的引物； 2)、農作物待測樣品中DNA的提取，得提取液； 3)、靶基因的多重PCR擴增 以步驟2)的提取液作為PCR模板，利用步驟I)所得的引物進行多重PCR擴增；得擴增產物； 4)、芯片雜交檢測 將擴增產物與轉基因成份檢測芯片雜交；然后進行熒光探針雜交，再利用T4DNA連接酶進行酶連接，接著用NaOH變性，最后用洗液洗滌； 所述熒光探針為與特異性探針相對應的熒光探針； 5)、雜交結果的檢測與分析 用掃描儀掃描上述步驟4)所得的芯片，利用常規軟件對結果進行分析。
2.根據權利要求I所述的農作物轉基因成份檢測法，其特征是 所述步驟4)中 進行熒光探針雜交的具體內容如下 將濃度為2 3 uM的每種熒光探針等體積混合后，得熒光探針混合液；將熒光探針混合液與雜交液按I :1體積比混合后，與前述步驟所得的已經與擴增產物雜交的轉基因成份檢測芯片進行雜交；47 49°C孵育29 31分鐘，室溫靜置8 12分鐘； 酶連接反應體系為0.05U/ul T4連接酶反應液lul，T4 IOXBuffer 2 ul ;水補足到 20ul ； NaOH變性為利用濃度為O. 3M的NaOH溶液洗滌4 6分鐘。
3.根據權利要求2所述的農作物轉基因成份檢測法，其特征是 步驟4)中的洗液為洗液(2 X SSC, O. 5% SDS)。
4.根據權利要求2或3所述的農作物轉基因成份檢測法，其特征是 所述熒光探針如下表所示
全文摘要
本發明公開了一種農作物轉基因成份檢測法，包括以下步驟一、制備轉基因成份檢測芯片；針對轉基因農作物的內源、外源、品系這三類基因，選擇特異性探針，每條特異性探針的5'進行氨基修飾；然后將氨基修飾后的探針固定醛基玻片上，預雜交后，得轉基因成份檢測芯片； 二、檢測1)、利用已知標準，獲取轉基因片段的引物；2)、農作物待測樣品中DNA的提取，得提取液；3)、靶基因的多重PCR擴增；4)、芯片雜交檢測將擴增產物與轉基因成份檢測芯片雜交；然后進行熒光探針雜交，再利用T4DNA連接酶進行酶連接，接著用NaOH變性，最后用洗液洗滌； 5)、雜交結果的檢測與分析掃描所得的芯片，對結果進行分析。
文檔編號C40B40/06GK102965442SQ20121052600
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月4日 優先權日2012年12月4日
發明者張明哲, 張曉峰, 陳笑梅, 吳姍, 陳曦 申請人:浙江省檢驗檢疫科學技術研究院